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Los fibroblastos de RTT muestran una activación defectuosa de la autofagia en condiciones de inanición

Para verificar la hipótesis relativa a una autofagia defectuosa en pacientes de RTT, analizamos la activación de la autofagia en condiciones de inanición en fibroblastos primarios de la piel aislados de pacientes con RTT (n = 4) y de sujetos sanos (n = 4)17,19.

En primer lugar, definimos la viabilidad a lo largo del tiempo de los fibroblastos sanos y los de RTT cultivados en medio de inanición mediante las pruebas de exclusión de MTT y azul Trypan. Con respecto a la viabilidad de los fibroblastos RTT cultivados en medio estándar, la viabilidad de los fibroblastos RTT disminuyó tras 4 h de inanición (20 ± 3,3% de células moribundas, p < 0,05); este porcentaje aumentó considerablemente tras 6-8 h de inanición (60 ± 5,1% de células moribundas, p < 0,05) (Fig. 1a). Por el contrario, los fibroblastos sanos seguían siendo totalmente viables después de 4 h de inanición con sólo una reducción muy baja de la viabilidad después de 6-8 h (10 ± 1,2% de células moribundas, p < 0,01) con respecto a la viabilidad de los fibroblastos cultivados en medio estándar (Fig. 1a). Así, a partir de una comparación directa de la viabilidad de las dos líneas celulares en cada punto de tiempo, resultó que la viabilidad de los fibroblastos RTT estaba gravemente comprometida a partir del tiempo 4 h (ver detalles en las leyendas de las figuras, p < 0,05). Además, un análisis de Western blotting (WB) puso de manifiesto que en los fibroblastos RTT que habían pasado hambre durante 4 h, una banda correspondiente al fragmento p25 de la poli (ADP-ribosa)polimerasa-1 (PARP) estaba muy aumentada (96 ± 4%, p < 0,001) con respecto a la débil detección en el tiempo 0. Este fragmento se libera por la degradación de la proteína dependiente de las caspasas durante la fase temprana de inducción de la apoptosis (Fig. 1b)35. El fragmento p25 era casi indetectable en los fibroblastos sanos bajo las mismas condiciones experimentales.

Estos datos confirmaron que los fibroblastos RTT no toleraban el crecimiento en un medio hambriento y sufrían rápidamente apoptosis. Por lo tanto, investigamos además el flujo autofágico mediante la monitorización del aclaramiento del marcador LC3B-II en presencia y en ausencia de un inhibidor del lisosoma, como la cloroquina (CQ)24,25,26,27,28,29,30.

Después de haber descartado un efecto citotóxico ligado a la CQ (Fig. Suplementaria S1), se cultivaron fibroblastos sanos y RTT en medios de reposo o de inanición durante 2 h en presencia o ausencia de 20 µM de CQ para cuantificar la relación LC3B-II/GAPDH por WB (Fig. 2a). El patrón de la relación LC3B-II/GAPDH (o cualquier otro control interno que no esté modulado por la autofagia) en condiciones de activación de la autofagia y en presencia y en ausencia de CQ (o cualquier otro inhibidor lisosomal) se considera una estrategia válida para monitorizar el flujo de autofagia.

En los fibroblastos sanos, cultivados en medio estándar, LC3B-I fue claramente inmunodetectado, mientras que LC3B-II fue débil. La relación LC3BII/GAPDH de los fibroblastos sanos cultivados en medio estándar en ausencia y en presencia de CQ era comparable (Fig. 2a, panel izquierdo). Esta observación sugiere que la autofagia basal era casi indetectable en los fibroblastos sanos (Fig. 2a, panel izquierdo).

Cuando estas células se cultivaron en el medio de inanición y en ausencia de CQ durante 2 h, la relación LC3B-II/GAPDH aumentó (60 ± 4.8%, p < 0,05) en comparación con la de los fibroblastos sanos cultivados en medio estándar, ya sea en ausencia o en presencia de CQ (que era, como se ha mencionado anteriormente, idéntica) (Fig. 2a, panel izquierdo y derecho). Este comportamiento, de hecho, indica que LC3-I realmente sufrió una lipidación para formar LC3B-II, que es un marcador temprano de la activación de la autofagia24,25,26,27,28,29,30. Para comprobar la presencia de esta activación de la autofagia, cultivamos las células en un medio de inanición en presencia de CQ durante 2 h y mostraron un aumento adicional de la relación LC3B-II/GAPDH (94 ± 5,5%, p < 0,001) con respecto a los fibroblastos sanos cultivados en medio estándar (Fig. 2a, panel izquierdo y derecho).

Además, la diferencia entre la relación LC3B-II/GAPDH de los fibroblastos sanos cultivados en medio de inanición en ausencia y en presencia de CQ fue estadísticamente significativa (p < 0,05, Fig. 2a, panel izquierdo)

Así, según la interpretación estándar del patrón de LC3B-II por análisis de WB, el resultado global indica que, en ausencia de nutrientes, los fibroblastos sanos estimulan la formación de autofagosomas que sufren una acumulación en presencia de CQ. Este comportamiento es compatible con un flujo autofágico normal24,25,26,27,28,29,30. Curiosamente, en el caso de los fibroblastos RTT cultivados en medio estándar, mientras que LC3B-I fue claramente inmunodetectado, LC3B-II fue muy débil en las células tanto en ausencia como en presencia de CQ (Fig. 2a, panel izquierdo). En condiciones de inanición y en ausencia de CQ, la aparición de una banda débil correspondiente a LC3B-II en los fibroblastos RTT sólo después de una larga exposición del filtro sugirió que se produjo al menos una mínima lipidación de LC3B-I (Fig. 2a, panel izquierdo). Por lo tanto, la relación LC3B-II/GAPDH entre los fibroblastos RTT cultivados en medio de inanición en ausencia de CQ se incrementó (93 ± 5,5%, p < 0,001) con respecto a la de los fibroblastos RTT cultivados en medio estándar en ausencia de CQ (Fig. 2a, panel derecho).

Sin embargo, la administración de CQ a los fibroblastos RTT cultivados en medio de inanición no aumentó más la relación LC3B-II/GAPDH, que se incrementó (95 ± 3,5%, p < 0,001) si se compara con las células cultivadas en medio estándar en ausencia de CQ, pero no se incrementó significativamente con respecto a la relación LC3B-II/GAPDH de los fibroblastos RTT cultivados en medio de inanición en ausencia de CQ (Fig. 2a, panel izquierdo). Este hallazgo sugiere que no se produce una acumulación de autofagosomas en las células RTT y el análisis de WB apoyó un bloqueo, a cierto nivel, en el flujo de autofagia24,25,26,27,28,29,30,31.

Para reforzar aún más nuestra hipótesis sobre un posible flujo autofágico defectuoso, verificamos la degradación de dos sustratos indicadores de autofagia reconocidos en fibroblastos sanos y RTT sometidos a inanición durante 2 y 4 h en ausencia de CQ, a saber: (i) la proteína p62/SQSMT1, que ayuda a la eliminación de agregados de proteínas poli-ubiquitadas y que es degradada por las hidrolasas lisosomales36; (ii) el proteasoma 20 S, que se degrada rápidamente en condiciones de inanición37,38. Con respecto al nivel basal de las dos proteínas (es decir, el tiempo 0), se observó una disminución a lo largo del tiempo de la relación p62/tubulina (44 ± 10% después de 4 h, p < 0,001) y de la relación PSMA-3/GAPDH (es decir, la subunidad α7 del proteasoma 20 S) (45 ± 3,1% después de 2 h, 11 ± 5,2% después de 4 h, en ambos casos p < 0,001) en fibroblastos sanos (Fig. 2b, panel superior).

En el caso de los fibroblastos RTT, la disminución de la relación p62/tubulina a lo largo del tiempo no fue estadísticamente significativa incluso después de 4 h (89 ± 9%), mientras que la disminución de la relación PSMA3/GAPDH a las 2 h (81 ± 4,4%, p < 0,05) y a las 4 h (78 ± 5,1%, p < 0,05) fue significativamente diferente si se compara con el nivel basal de la proteína (es decir, el tiempo 0) (Fig. 2b, panel inferior). Sin embargo, las diferencias entre los grupos sanos y RTT fueron estadísticamente significativas en el caso de la relación p62/tubulina sólo a las 4 h (p < 0,05), mientras que la relación PSMA3/GAPDH fue significativamente diferente entre los grupos experimentales tanto a las 2 h (p < 0.05) como a las 4 h (p < 0,001) (Fig. 2b, panel inferior).

Es interesante que los patrones de β-tubulina y GAPDH, utilizados como controles internos para la tinción de p62 y la tinción de PSMA3, respectivamente, no se modificaron durante las 4 h de inanición en los fibroblastos sanos. Sin embargo, la intensidad de la banda de β-tubulina, así como la de la banda de GAPDH, disminuyó significativamente en los fibroblastos RTT sometidos a inanición durante 4 h en comparación con lo observado a tiempo 0 o a tiempo 2 h para estas células (Fig. 2b, panel superior). Esta reducción se debió probablemente al menor número de fibroblastos RTT vivos cosechados en este punto de tiempo (de acuerdo con la escasa viabilidad de los fibroblastos RTT a las 4 h de inanición reportada en la Fig. 1a) y no a una regulación a la baja de la β-tubulina con el tiempo. En conjunto, se encontró que los fibroblastos RTT no degradaban eficientemente estos sustratos reporteros de autofagia, apoyando la hipótesis de una autofagia defectuosa.

Para arrojar más luz sobre las características de este bloqueo, realizamos un análisis de inmunofluorescencia utilizando el anticuerpo LC3B. Analizamos fibroblastos sanos y RTT cultivados en medio estándar en ausencia de CQ (condición de reposo) y en medio de inanición durante 2 h en presencia o ausencia de 20 µM de CQ (Fig. 2c). En consonancia con la lenta tasa metabólica de las células primarias, encontramos que los fibroblastos sanos y RTT en reposo mostraban una tinción débil y difusa de LC3B+ con un bajo porcentaje de células que mostraban más de 10 puntos (es decir, autofagosomas) (8 ± 5% y 1 ± 0,5%, respectivamente) indicando que, por inmunofluorescencia, la autofagia basal era poco detectable de acuerdo con los datos reportados en la Fig. 2a.

Respecto a las células cultivadas en medio estándar, el porcentaje de fibroblastos sanos cultivados en medio de inanición (en ausencia de CQ) que mostraban al menos 10 autofagosomas LC3B+ aumentó notablemente (82 ± 10%, p < 0,005), mientras que los fibroblastos RTT cultivados en medio de inanición mostraron un ligero aumento (17 ± 8%, p < 0,001). De hecho, el porcentaje de fibroblastos sanos cultivados en medio de inanición que mostraban al menos 10 autofagosomas era significativamente mayor que el de los fibroblastos RTT cultivados en la misma condición experimental (p < 0,005). Los autofagosomas se localizaron principalmente en la región perinuclear. En presencia de CQ se observó además una esperada tinción difusa e intensa de LC3B+, aunque en este caso, la tinción difusa no permitió cuantificar con precisión el número de puntos.

La administración de CQ fue ineficaz en los fibroblastos RTT, lo que indica claramente un grave deterioro de la biogénesis de los autofagosomas (Fig. 2c).

Dada la relevancia del supuesto deterioro de la biogénesis de los autofagosomas, se adoptó un enfoque adicional para confirmar esta observación. Tanto los fibroblastos sanos como los de la RTT, muertos de hambre durante 2 h en ausencia de CQ, se tiñeron con un colorante específico (Cyto-ID) para la membrana autofagosomal y se analizaron por inmunofluorescencia. Incluso en este caso, mientras que en los fibroblastos sanos se detectaron varios autofagosomas, en los fibroblastos RTT sólo se observó un número limitado de vesículas pequeñas y aisladas (Fig. Suplementaria S2). La diferencia en el porcentaje de células que mostraban al menos 5 puntos positivos de Cyto-ID entre los fibroblastos sanos y los de RTT fue notablemente significativa (80 ± 4% vs 8 ± 6%, respectivamente, p < 0,001). Por lo tanto, el análisis general proporcionó pruebas de que se produce una biogénesis defectuosa de los autofagosomas en los fibroblastos primarios RTT.

Los glóbulos rojos maduros de los pacientes con RTT portadores de la mutación R255X MeCP2 retienen mitocondrias

A continuación, intentamos determinar si podían observarse signos adicionales de autofagia defectuosa ex vivo en los pacientes con RTT. Debido al hecho de que la eliminación de las mitocondrias es un mecanismo clásico basado en la autofagia que se produce en los reticulocitos circulantes en la etapa final de la maduración para convertirse en glóbulos rojos32,33,34 , ampliamos nuestra investigación también a los glóbulos rojos humanos ex vivo para verificar si las mitocondrias se conservan en estas células.

Por lo tanto, los glóbulos rojos de los pacientes con RTT (n = 15) y de los donantes sanos (n = 11) se analizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). La investigación por TEM puso de manifiesto la presencia de estructuras similares a las mitocondrias (SRM) en los glóbulos rojos de forma bicóncava aislados de la mayoría de los pacientes con RTT (11 de 15). Entre esos 11 pacientes con RTT, tres de ellos mostraban la cohorte más severa de síntomas y también una alta frecuencia de glóbulos rojos (20 ± 4%) (Fig. 3a-h). Como era de esperar, los MER eran indetectables en los GR sanos (Fig. 3I). Las diferencias entre los sujetos sanos y los de RTT fueron estadísticamente significativas (p < 0,0004; Fig. 3, panel inferior).

No obstante, la gravedad de los síntomas se basó en la evaluación clínica y, en consecuencia, los tres pacientes con los síntomas más graves presentaban la mutación R255X del gen MeCP2, que se asocia a un pronóstico grave39.

En consecuencia, y teniendo en cuenta que no teníamos la posibilidad de inscribir a un mayor número de sujetos portadores de otras mutaciones con una frecuencia baja o nula de glóbulos rojos que contienen mitocondrias, centramos nuestra atención en el análisis de esos tres pacientes. El análisis TEM documentó, en esos tres casos mencionados, la presencia de estructuras que se asemejan a mitocondrias intactas o parcialmente digeridas (densas en electrones o lucentes), que tenían forma normal o de campana (alargada), y generalmente pequeñas con cristas tenues (Fig. 3a-h). De hecho, el tamaño y la forma general de estas estructuras eran consistentes con los de las mitocondrias retenidas en los glóbulos rojos maduros en modelos murinos no RTT de macroautofagia defectuosa (es decir, los ratones Ulk1-/-) o mitofagia (es decir, los ratones Nix-/-) reportados por otros autores32,33. Curiosamente, las alteraciones morfológicas de las mitocondrias que observamos, como la dimensión reducida, la estructura alargada (es decir, en forma de campana) y, en particular, la presencia de cristas tenues, ya se han descrito en el músculo y en el cerebelo de pacientes con RTT20,21. Para confirmar la identidad mitocondrial de la MER, se tiñeron glóbulos rojos de donantes sanos y de estos pacientes de RTT con síntomas graves con un anticuerpo anti-COX-IV (citocromo c oxidasa). Un número estadísticamente significativo de glóbulos rojos de los tres pacientes con RTT en comparación con los glóbulos rojos de sujetos sanos (35 ± 5% frente a 0,2 ± 0,01%, respectivamente, p < 0,005) mostraron un patrón punteado COX-IV+ que sugería la retención de mitocondrias (Fig. 4). Se calculó que el contenido medio de mitocondrias por célula era de 1,2 ± 0,2 orgánulos por GR en los pacientes con RTT y de 0,002 ± 0,0002 en los sujetos sanos (p < 0,005) (Fig. 4). Las diferencias en el porcentaje de glóbulos rojos que muestran mitocondrias entre la TEM y las investigaciones de la IF pueden atribuirse al hecho de que la posibilidad de detectar los orgánulos mediante la TEM depende estrictamente de la sección fina de la célula, que puede dificultar su presencia, mientras que el enfoque de la IF no está limitado de esta manera.

Para confirmar aún más estos resultados, realizamos un análisis citofluorimétrico de los glóbulos rojos de los sujetos sanos y de los tres pacientes con RTT utilizando un anticuerpo anti-CD71 (receptor de transferrina) y un anticuerpo anti-COX-IV. La frecuencia de positividad de CD71, un marcador de glóbulos rojos inmaduros, no fue significativamente diferente en los sujetos sanos y en los pacientes con RTT (1,34 ± 0,13% frente a 1,03 ± 0,3%; Fig. suplementaria S3). Debe subrayarse que los pacientes con RTT incluidos en el estudio presentaban parámetros hematológicos normales y, aunque el índice de reticulocitos era, al menos en un par de sujetos, inferior al encontrado en los sujetos sanos, las diferencias globales entre los dos grupos de pacientes no eran estadísticamente significativas (Tabla 1). Por el contrario, se observó una población COX-IV+ muy débil en los glóbulos rojos sanos, mientras que se detectó una mayor frecuencia de células COX-IV+ en los glóbulos rojos del RTT (0,056 ± 0,004% frente a 1,15 ± 0,19%, respectivamente, p < 0,01). Estos resultados se confirmaron además utilizando la tinción con Verde Mitotracker (MT) (Fig. Suplementaria S3), que documentó un aumento de glóbulos rojos MT+ en un paciente con RTT (portador de la mutación R255X MeCP2) frente a un paciente sano (0,37% frente a 0,16%), similar al observado con el anticuerpo COX-IV descrito anteriormente.

Para validar aún más la identidad de los MER, se lisó un número igual de glóbulos rojos y se analizó por WB en condiciones desnaturalizantes y reductoras. Los filtros se tiñeron con anticuerpos contra la sirtuina-3, una desacetilasa que se expresa específicamente en la matriz mitocondrial40. Se eligió la sirtuina3 como marcador mitocondrial en este enfoque porque, a diferencia de la COX-IV y otros marcadores mitocondriales, su peso molecular no se solapa con el de las cadenas de hemoglobina o los oligómeros de hemoglobina en el patrón electroforético. En los tres pacientes con RTT examinados, se observó un aumento estadísticamente significativo de la relación sirtuina-3/GAPDH en cada uno de ellos con respecto a la misma relación en los lisados de glóbulos rojos sanos (p < 0. 001) (Fig. Suplementaria S4).

Estos tres pacientes, todos ellos portadores de la mutación MeCP2 (es decir, R255X), mostraron el peor fenotipo, con un porcentaje muy elevado de glóbulos rojos que mostraban al menos una mitocondria. Sin embargo, el número muy limitado de pacientes de que disponíamos dificultaba la extracción de cualquier conclusión estadísticamente significativa sobre la posibilidad de una relación entre la gravedad de la enfermedad y el grado de retención de mitocondrias dentro de los glóbulos rojos maduros. Otro punto, que parece digno de mención, es que la retención de mitocondrias en el interior de los GR maduros en los modelos murinos Ulk1-/- y Nix-/- citados anteriormente dio lugar a anemia u otras patologías sanguíneas probablemente determinadas por el aumento de la eliminación de estos eritrocitos anormales por parte de los macrófagos del bazo32,33. En los pacientes con RTT incluidos en este estudio, sólo se registró una disminución muy limitada y no estadísticamente significativa de los valores hematológicos, y no parecían tener anemia ni padecer otras patologías sanguíneas. La discrepancia entre nuestros resultados y los de los modelos murinos podría deberse al hecho de que la anulación de los genes de macroautofagia o mitofagia (es decir, los ratones Ulk1-/- y Nix-/-, respectivamente) induce un porcentaje muy elevado de glóbulos rojos que retienen mitocondrias y la retención de varios orgánulos dentro de los glóbulos rojos, que es un defecto considerablemente más grave en comparación con el documentado en los pacientes con RTT32,33. Aunque observamos un número significativamente alto de glóbulos rojos con retención de mitocondrias en los pacientes portadores de la mutación R255X (Fig. 4), el número de orgánulos en cada célula era muy bajo en los glóbulos rojos con RTT (Fig. 4). Esto podría no ser suficiente para provocar importantes alteraciones morfológicas y funcionales en los glóbulos rojos. Vale la pena mencionar que, aunque la retención mitocondrial dentro de los glóbulos rojos podría ser al menos uno de los factores que determinan el severo desequilibrio redox observado en los glóbulos rojos RTT en asociación con un cambio significativo del estado energético y del metabolismo (i.e, ATP/ADP y relación NADH/NAD), estudios recientes informaron de que la cinética de las uniones de oxígeno a la hemoglobina y la difusión de oxígeno casi coinciden con las de los pacientes sanos16,17,23,41.

La aparente discrepancia entre nuestros resultados y los derivados de modelos murinos podría encontrar también una explicación en el hecho de que el síndrome RTT es un trastorno ligado al cromosoma X que afecta casi exclusivamente al sexo femenino y la inactivación de una de las dos copias del cromosoma X (XCI) es un fenómeno aleatorio que ocurre durante la embriogénesis, como está ampliamente documentado42,43. Así, en el caso del síndrome RTT, se esperaría que la XCI aleatoria produjera, en las células somáticas, un mosaicismo con la mitad de las células expresando el alelo de tipo salvaje, con la mitad restante expresando el alelo mutado del gen MeCP2. Curiosamente, la posibilidad de que al menos algunas mutaciones de MeCP2 puedan estar asociadas a un XCI no aleatorio en el tejido neuronal está de acuerdo con la variabilidad fenotípica de los pacientes con RTT (y también para los casos familiares de RTT), una característica que ha sido ampliamente documentada42,43. Teóricamente, si la mitad de los progenitores hematológicos de la médula ósea conservan el cromosoma X portador de la mutación MeCP2, sólo la mitad de los glóbulos rojos maduros circulantes serían portadores del alelo patológico, restringiendo así el número de glóbulos rojos circulantes con mitocondrias. No obstante, se ha observado una mayor prevalencia de XCI no aleatoria a favor del alelo de tipo salvaje en los leucocitos circulantes de pacientes esporádicos con RTT42,43. Con respecto a este punto, sería un gran desafío abordar si los pacientes que muestran o no un bajo número de glóbulos rojos con mitocondrias también muestran un deterioro menos significativo de la mitofagia o el XCI no aleatorio, lo que llevaría a la selección positiva de progenitores hematológicos que llevan el alelo MeCP2 de tipo salvaje.

Por lo tanto, dada la complejidad de la patología del RTT, preferimos afirmar que los pacientes del RTT, junto con los pacientes afectados por el Síndrome de Pearson, podrían representar los primeros casos de retención de mitocondrias en los GR humanos maduros44.

Evidencia de autofagia defectuosa en el cerebelo de ratones nulos para Mecp2

Dado que el RTT es un trastorno del neurodesarrollo, para apoyar aún más nuestros resultados que apuntan a una autofagia defectuosa sistémica, realizamos análisis inmunohistoquímicos para p62 y ubiquitina del cerebelo (i.Es decir, un órgano en el que se han observado alteraciones de las mitocondrias y otras anomalías histológicas importantes)21,45 de ratones de tipo salvaje de 9 semanas y de ratones Mecp2 -/y de 5 semanas (asintomáticos) y 9 semanas (sintomáticos). Para cada condición experimental, se analizó el órgano aislado de tres animales. En comparación con el wt, el cerebelo RTT mostró un aumento en la intensidad de la tinción de p62 (Fig. 5a) y Ub (Fig. 5b) en todas las capas (es decir, gránulos, Purkinje y capas corticales), que fue lineal con la edad de los animales. Además, las estructuras hiperteñidas parecían agregados intracelulares. Según la evaluación semicuantitativa de la intensidad de la tinción de p62/SQSTM1 y Ub, las diferencias entre el cerebelo de los animales de 5 semanas frente a los animales sanos, y de los animales de 9 semanas frente a los de 5 semanas fueron estadísticamente significativas (p < 0.05).

La diferencia histológica entre los animales asintomáticos y los sintomáticos sugiere que la alteración de la autofagia podría estar ausente o ser débil al nacer, mientras que aumenta progresivamente durante las primeras semanas de vida (y posiblemente cuando la actividad de MeCP2 alcanza un pico), dando lugar a los síntomas.