Los coronavirus han causado dos pandemias a gran escala en las dos últimas décadas, el SARS y el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS)8,9. En general, se ha pensado que el SARSr-CoV -que se encuentra principalmente en los murciélagos- podría causar un futuro brote de la enfermedad10,11. Aquí informamos de una serie de casos causados por un brote de neumonía no identificado en Wuhan, provincia de Hubei, en el centro de China. Este brote de la enfermedad -que se inició en un mercado local de marisco- ha crecido sustancialmente hasta infectar a 2.761 personas en China, está asociado a 80 muertes y ha provocado la infección de 33 personas en otros 10 países hasta el 26 de enero de 202012. Los síntomas clínicos típicos de estos pacientes son fiebre, tos seca, dificultades respiratorias (disnea), dolor de cabeza y neumonía. La aparición de la enfermedad puede dar lugar a una insuficiencia respiratoria progresiva debido al daño alveolar (como se observa en las imágenes de tomografía computarizada de tórax transversal) e incluso a la muerte. Los clínicos determinaron que la enfermedad estaba causada por una neumonía inducida por un virus según los síntomas clínicos y otros criterios, como el aumento de la temperatura corporal, la disminución del número de linfocitos y glóbulos blancos (aunque los niveles de estos últimos eran a veces normales), la aparición de nuevos infiltrados pulmonares en la radiografía de tórax y la ausencia de una mejora evidente tras el tratamiento con antibióticos durante tres días. Parece que la mayoría de los primeros casos tenían antecedentes de contacto con el mercado de marisco original; sin embargo, la enfermedad ha progresado hasta transmitirse por contacto de persona a persona.
Las muestras de siete pacientes con neumonía grave (seis de los cuales son vendedores o repartidores del mercado de marisco), que ingresaron en la unidad de cuidados intensivos del Hospital Wuhan Jin Yin-Tan al principio del brote, se enviaron al laboratorio del Instituto de Virología de Wuhan (WIV) para el diagnóstico del patógeno causante (Tabla 1 de datos ampliados). Como laboratorio que investiga el CoV, primero utilizamos cebadores de PCR pan-CoV para analizar estas muestras13, dado que el brote se produjo en invierno y en un mercado, el mismo entorno que las infecciones de SARS. Encontramos cinco muestras con resultados positivos en la PCR para CoV. Una muestra (WIV04), recogida del líquido de lavado broncoalveolar (BALF), se analizó mediante un análisis metagenómico utilizando la secuenciación de próxima generación para identificar posibles agentes etiológicos. De las 10.038.758 lecturas totales, de las cuales 1.582 fueron retenidas después de filtrar las lecturas del genoma humano, 1.378 (87,1%) secuencias coincidían con la secuencia de SARSr-CoV (Fig. 1a). Mediante el ensamblaje de novo y la PCR dirigida, obtuvimos un genoma del CoV de 29.891 pares de bases que compartía una identidad de secuencia del 79,6% con el SARS-CoV BJ01 (número de acceso del GenBank AY278488.2). Se obtuvo una alta cobertura del genoma mediante la reasignación de las lecturas totales a este genoma (Extended Data Fig. 1). Esta secuencia ha sido enviada a GISAID (https://www.gisaid.org/) (número de acceso EPI_ISL_402124). Siguiendo el nombre dado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), lo llamamos tentativamente nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV). Posteriormente se obtuvieron otras cuatro secuencias del genoma completo del 2019-nCoV (WIV02, WIV05, WIV06 y WIV07) (números de acceso GISAID EPI_ISL_402127-402130) que eran más de un 99,9% idénticas entre sí, a partir de otros cuatro pacientes, utilizando la secuenciación de nueva generación y la PCR (Tabla 2 de datos extendidos).
a, Análisis metagenómico de la secuenciación de próxima generación del BALF del paciente ICU06. b, Organización genómica del 2019-nCoV WIV04. M, membrana. c, Gráfico de similitud basado en la secuencia del genoma completo de 2019-nCoV WIV04. Se utilizaron como secuencias de referencia las secuencias genómicas completas de SARS-CoV BJ01, SARSr-CoV WIV1 de murciélago, coronavirus RaTG13 de murciélago y ZC45. d, Árbol filogenético basado en las secuencias de nucleótidos de los genomas completos de los coronavirus. MHV, virus de la hepatitis murina; PEDV, virus de la diarrea epidémica porcina; TGEV, virus de la gastroenteritis transmisible porcina.Las barras de escala representan 0,1 sustituciones por posición nucleotídica. Las barras de escala representan 1 sustitución por posición de nucleótidos. Las descripciones de los ajustes y el software que se utilizó se incluyen en los Métodos.
El genoma del virus consta de seis marcos de lectura abierta (ORF) principales que son comunes a los coronavirus y una serie de otros genes accesorios (Fig. 1b). Un análisis más detallado indica que algunos de los genes del 2019-nCoV compartían menos del 80% de identidad de secuencia nucleotídica con el SARS-CoV. Sin embargo, las secuencias de aminoácidos de los siete dominios conservados de la replicasa en ORF1ab que se utilizaron para la clasificación de las especies de CoV fueron 94,4% idénticas entre 2019-nCoV y SARS-CoV, lo que sugiere que los dos virus pertenecen a la misma especie, SARSr-CoV.
Encontramos entonces que una región corta de ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) de un coronavirus de murciélago (BatCoV RaTG13) -que se detectó previamente en Rhinolophus affinis de la provincia de Yunnan- mostraba una alta identidad de secuencia con el 2019-nCoV. Llevamos a cabo la secuenciación de longitud completa de esta muestra de ARN (número de acceso GISAID EPI_ISL_402131). El análisis de Simplot mostró que el 2019-nCoV era muy similar en todo el genoma al RaTG13 (Fig. 1c), con una identidad global de la secuencia del genoma del 96,2%. Utilizando las secuencias genómicas alineadas de 2019-nCoV, RaTG13, SARS-CoV y los SARSr-CoVs de murciélagos previamente reportados, no se detectó evidencia de eventos de recombinación en el genoma de 2019-nCoV. El análisis filogenético del genoma completo y de las secuencias genéticas de RdRp y spike (S) mostró que, para todas las secuencias, RaTG13 es el pariente más cercano de 2019-nCoV y que forman un linaje distinto de otros SARSr-CoV (Fig. 1d y Extended Data Fig. 2). La proteína pico de unión al receptor codificada por el gen S fue altamente divergente de otros CoVs (Extended Data Fig. 2), con menos del 75% de identidad de secuencia de nucleótidos con todos los SARSr-CoVs previamente descritos, excepto por una identidad de nucleótidos del 93,1% con RaTG13 (Extended Data Table 3). Los genes S de 2019-nCoV y RaTG13 son más largos que los de otros SARSr-CoV. Las principales diferencias en la secuencia del gen S del 2019-nCoV son las tres inserciones cortas en el dominio N-terminal, así como los cambios en cuatro de los cinco residuos clave en el motivo de unión al receptor en comparación con la secuencia del SARS-CoV (Extended Data Fig. 3). Hay que seguir estudiando si las inserciones en el dominio N-terminal de la proteína S del 2019-nCoV confieren una actividad de unión al ácido siálico como ocurre en el MERS-CoV. La estrecha relación filogenética con RaTG13 proporciona pruebas de que el 2019-nCoV puede haberse originado en murciélagos.
Desarrollamos rápidamente un método de detección basado en qPCR sobre la base de la secuencia del dominio de unión al receptor del gen S, que era la región más variable del genoma (Fig. 1c). Nuestros datos muestran que los cebadores podían diferenciar el 2019-nCoV de todos los demás coronavirus humanos, incluido el murciélago SARSr-CoV WIV1, que comparte un 95% de identidad con el SARS-CoV (Datos ampliados Fig. 4a, b). De las muestras obtenidas de los siete pacientes, encontramos que seis muestras de BALF y cinco de hisopos orales fueron positivas para el 2019-nCoV durante el primer muestreo, como se evaluó mediante qPCR y PCR convencional. Sin embargo, ya no pudimos detectar muestras positivas al virus en los hisopos orales, los hisopos anales y las muestras de sangre tomadas de estos pacientes durante el segundo muestreo (Fig. 2a). Sin embargo, recomendamos que se utilicen otras dianas de qPCR, incluidos los genes RdRp o de la envoltura (E), para la detección rutinaria del 2019-nCoV. Sobre la base de estos hallazgos, proponemos que la enfermedad podría transmitirse por vía aérea, aunque no podemos descartar otras posibles vías de transmisión, ya que se requiere más investigación, incluyendo más pacientes.
a, Detección molecular de 2019-nCoV en siete pacientes. La información de los pacientes se encuentra en las Tablas de Datos Ampliados 1, 2. Los métodos de detección se describen en los Métodos. AS, hisopo anal; OS, hisopo oral. b, Dinámica de los niveles de anticuerpos del 2019-nCoV en un paciente que mostró signos de enfermedad el 23 de diciembre de 2019 (UCI-06). Relación OD, densidad óptica a 450-630 nm. Los ejes y de la derecha e izquierda indican las relaciones de DO de ELISA para IgM e IgG, respectivamente. c, Prueba serológica de anticuerpos de 2019-nCoV en cinco pacientes (tabla de datos ampliada 2). El asterisco indica los datos recogidos del paciente ICU-06 el 10 de enero de 2020. b, c, El punto de corte fue a 0,2 para el análisis de IgM y a 0,3 para el análisis de IgG, según los niveles de los controles sanos.
Para la detección serológica del 2019-nCoV, se utilizó una proteína de la nucleocápside (N) previamente desarrollada del murciélago SARSr-CoV Rp3 como antígeno para los ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) de IgG e IgM, ya que esta proteína compartía un 92% de identidad de aminoácidos con la proteína N del 2019-nCoV (Extended Data Fig. 5) y no mostró reactividad cruzada contra otros coronavirus humanos, excepto el SARSr-CoV7. Sólo pudimos obtener cinco muestras de suero de los siete pacientes con infecciones virales. Controlamos los niveles de anticuerpos virales en un paciente (UCI-06) 7, 8, 9 y 18 días después del inicio de la enfermedad (Tabla 2 de datos ampliados). Se observó una clara tendencia en los títulos de IgG e IgM, que aumentaron con el tiempo, salvo que el título de IgM disminuyó en la última muestra (Fig. 2b). Como segundo análisis, analizamos muestras de 5 de los 7 pacientes positivos al virus alrededor de 20 días después del inicio de la enfermedad para detectar la presencia de anticuerpos virales (Tablas de datos ampliados 1, 2). Todas las muestras de los pacientes -pero no las de los individuos sanos- fueron fuertemente positivas para la IgG viral (Fig. 2b). También hubo tres muestras positivas para IgM, lo que indica una infección aguda.
A continuación aislamos con éxito el virus (denominado 2019-nCoV BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019) tanto en células Vero E6 como Huh7 utilizando la muestra de BALF del paciente ICU-06. Se observaron claros efectos citopatogénicos en las células tras la incubación durante tres días (Extended Data Fig. 6a, b). La identidad de la cepa WIV04 se verificó en células Vero E6 mediante microscopía de inmunofluorescencia utilizando el anticuerpo viral N de reacción cruzada (Extended Data Fig. 6c, d) y mediante secuenciación metagenómica, la mayoría de cuyas lecturas se asignaron a 2019-nCoV, y el análisis de qPCR mostró que la carga viral aumentó desde el día 1 hasta el día 3 (Extended Data Fig. 6e, f). Las partículas virales en las secciones ultrafinas de las células infectadas mostraron una morfología típica de coronavirus, como se visualizó por microscopía electrónica (Extended Data Fig. 6g). Para confirmar aún más la actividad de neutralización de las muestras virales IgG-positivas, realizamos ensayos de seroneutralización en células Vero E6 utilizando los cinco sueros de pacientes que eran IgG-positivos. Demostramos que todas las muestras fueron capaces de neutralizar 100 TCID50 (dosis infectiva de cultivo de tejidos del 50%) de 2019-nCoV a una dilución de 1:40-1:80. También demostramos que este virus podría ser neutralizado de forma cruzada por suero anti-SARS-CoV de caballo (regalo de L.-F. Wang) a diluciones de 1:40; sin embargo, el potencial de reactividad cruzada con los anticuerpos contra el SARS-CoV debe confirmarse con suero anti-SARS-CoV de humanos (Tabla de Datos Ampliados 4).
Se sabe que ACE2 es un receptor celular para el SARS-CoV14. Para determinar si 2019-nCoV también utiliza ACE2 como receptor de entrada celular, realizamos estudios de infectividad del virus utilizando células HeLa que expresaban o no proteínas ACE2 de humanos, murciélagos de herradura chinos, civetas, cerdos y ratones. Mostramos que 2019-nCoV es capaz de utilizar todas las proteínas ACE2, excepto la ACE2 de ratón, como receptor de entrada para entrar en las células que expresan ACE2, pero no en las células que no expresan ACE2, lo que indica que ACE2 es probablemente el receptor celular a través del cual 2019-nCoV entra en las células (Fig. 3). También mostramos que 2019-nCoV no utiliza otros receptores de coronavirus, como la aminopeptidasa N (APN) y la dipeptidil peptidasa 4 (DPP4) (Extended Data Fig. 7).
Determinación de la infectividad del virus en células HeLa que expresaban o no expresaban (sin transfectar) ACE2. La expresión del plásmido ACE2 con etiqueta S se detectó utilizando un anticuerpo monoclonal anti etiqueta S de ratón. hACE2, ACE2 humana; bACE2, ACE2 de Rhinolophus sinicus (murciélago); cACE2, ACE2 de civeta; sACE2, ACE2 porcina (cerdo); mACE2, ACE2 de ratón. Verde, ACE2; rojo, proteína viral (N); azul, DAPI (núcleos). Barras de escala, 10 μm.
El estudio proporciona un informe detallado sobre el 2019-nCoV, el probable agente etiológico responsable de la actual epidemia de síndrome respiratorio agudo en China y otros países. Se observó una seroconversión de nucleótidos y proteínas virales específicas en todos los pacientes analizados y proporciona pruebas de una asociación entre la enfermedad y la presencia de este virus. Sin embargo, aún quedan muchas preguntas urgentes por responder. La asociación entre el 2019-nCoV y la enfermedad no se ha verificado mediante experimentos con animales que permitan cumplir los postulados de Koch para establecer una relación causal entre un microorganismo y una enfermedad. Todavía no conocemos la rutina de transmisión de este virus entre los huéspedes. Parece que el virus es cada vez más transmisible entre humanos. Debemos vigilar de cerca si el virus sigue evolucionando para hacerse más virulento. Debido a la escasez de tratamientos específicos y teniendo en cuenta el parentesco del 2019-nCoV con el SARS-CoV, probablemente se podrían utilizar algunos fármacos y vacunas preclínicas contra el SARS-CoV para tratar este virus. Por último, teniendo en cuenta la amplia propagación del SARSr-CoV en sus reservorios naturales, la investigación futura debería centrarse en la vigilancia activa de estos virus para regiones geográficas más amplias. A largo plazo, deberían prepararse medicamentos antivirales de amplio espectro y vacunas para las enfermedades infecciosas emergentes causadas por este grupo de virus en el futuro. Y lo que es más importante, deberían aplicarse normas estrictas contra la domesticación y el consumo de animales salvajes.
Nota añadida en la prueba: Desde que se aceptó este artículo, el ICTV ha designado el virus como SARS-CoV-215; además, la OMS ha dado a conocer el nombre oficial de la enfermedad causada por este virus, que es COVID-1916.