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La mecánica de las cáscaras delgadas en forma de varilla

El crecimiento en forma de varilla requiere, en última instancia, una ruptura de la simetría, que puede surgir de la direccionalidad en las propiedades materiales de la pared celular, de las tensiones, de la organización de la maquinaria de síntesis o de cualquier combinación de éstas. Los modelos físicos de la morfogénesis de las células con pared consideran que la célula es una fina cáscara viscoelástica, que se infla uniformemente desde el interior por la presión de turgencia. Para predecir la forma de la célula resultante de un determinado mecanismo de crecimiento, es fundamental tener en cuenta la distribución de las fuerzas debidas a la presión de turgencia, las fuerzas de contrapeso del estiramiento de la pared y cómo las propiedades del material de la pared acoplan esas fuerzas al grado de extensión. Para un material elástico lineal, la tensión σ (fuerza por unidad de superficie) está relacionada con la deformación mecánica ε (estiramiento fraccionado) a través del módulo de Young:

una medida de la rigidez intrínseca del material similar a la constante de fuerza k de un muelle (para el que la ley de Hooke dicta que k = F/x, donde F es la fuerza necesaria para estirar el muelle en una cantidad x). En una cáscara delgada y elástica, las tensiones deberían aumentar con el aumento del radio de la célula r y con la presión de turgencia P, y disminuir con un mayor grosor de la pared de la célula d. En una cáscara esférica, las tensiones son iguales en todas las direcciones. Por el contrario, la geometría de una cáscara cilíndrica dicta que las tensiones circunferenciales (σ r ) son dos veces mayores que las longitudinales (σ l ) (Figura 1c):

Combinando las ecuaciones 1 y 2, estas relaciones del modelo predicen que las tensiones circunferenciales y longitudinales (ε r y ε l , respectivamente) deben depender linealmente de la anchura y de la presión de turgencia e inversamente del espesor de la pared. Si el módulo de Young es igual en todas las direcciones (mecánicamente isotrópico), entonces ε r debería ser dos veces mayor que ε l .

Esta relación entre las deformaciones en diferentes direcciones se ha utilizado para sondear las propiedades mecánicas de la pared celular de las células en forma de varilla. En la levadura de fisión, la medición del grado de contracción de las células cuando se reduce la presión de turgencia revela esta relación de deformación predicha de 2:1, lo que sugiere que la pared celular en estas células se comporta como un material isótropo (Atilgan y Chang, observaciones no publicadas). En cambio, en las bacterias con forma de bastón, como E. coli y B. subtilis, las células presentan un mayor grado de estiramiento longitudinal que radial, lo que indica una anisotropía mecánica (o dependencia direccional), con una mayor rigidez en la dirección circunferencial respecto a la longitudinal. Estas observaciones son coherentes con los tomogramas crioelectrónicos que muestran que la pared celular de E. coli está organizada con los componentes más rígidos (filamentos de glicanos) orientados a lo largo de la dirección circunferencial. Será interesante descubrir si existe anisotropía mecánica en las paredes celulares de las plantas, o si son más parecidas a la pared celular de la levadura de fisión.

Es importante señalar que la anisotropía del crecimiento (elongación a lo largo de un solo eje) puede producirse utilizando material de pared anisotrópico o isotrópico; de hecho, el material isotrópico puede utilizarse para construir prácticamente cualquier forma celular. Además, las propiedades mecánicas de la pared celular pueden ser mucho más complejas que las simples relaciones de escala que hemos descrito anteriormente. Por ejemplo, la relación entre las tensiones y las deformaciones ya no seguirá la ecuación 1 a deformaciones suficientemente grandes; recientes mediciones de microscopía de fuerza atómica indican que la pared celular de E. coli presenta propiedades no lineales en su estado presurizado que pueden ayudar a la célula a resistir la expansión durante el choque hipoosmótico. La suposición de un grosor constante a lo largo de la cáscara delgada también puede romperse, particularmente durante la septación, debido a las diferencias en el modo de construcción de la pared en el septo . En última instancia, estas características mecánicas deben integrarse con los patrones de inserción y remodelación de la pared, que pueden tanto alterar el grosor de la pared celular como dar lugar a una respuesta viscoelástica en la que el material de la pared fluye como un líquido viscoso cuando se estresa. Esto da lugar a una serie de posibles mecanismos de crecimiento en las células amuralladas. Los modelos biofísicos pueden proporcionar predicciones comprobables para las relaciones entre la presión de turgencia, los patrones de crecimiento y la distribución de las tensiones y la tasa de crecimiento a través de la superficie de la célula ,.

Crecimiento por elongación cilíndrica

En muchas bacterias, el crecimiento de la célula se logra mediante la inserción de nuevo material de la pared celular en sitios a lo largo de la parte cilíndrica de la pared celular, mientras que la inserción disminuye en los polos de la célula. El organismo más estudiado desde la perspectiva del crecimiento de la pared celular es E. coli, con varias revisiones centradas en la bioquímica , la maquinaria de síntesis , la morfología , y las características físicas de la pared celular. Como la mayoría de las bacterias, E. coli tiene una pared celular compuesta de peptidoglicano, una red macromolecular de filamentos de azúcar (glicanos) reticulados por péptidos cortos. Como se ha señalado anteriormente, las hebras de glicanos más rígidas están orientadas circunferencialmente, lo que hace que la pared celular sea mecánicamente anisotrópica, además de la anisotropía de crecimiento de la forma de varilla. La proteína del citoesqueleto MreB, un homólogo de la actina eucariótica, se mueve de forma aproximadamente circunferencial a lo largo de la cara interna de la membrana citoplasmática, y el antibiótico que ataca la pared celular, mecillinam, inhibe este movimiento, lo que sugiere un modelo en el que las huellas de MreB indican las vías de inserción de nuevo material en la pared lateral ,. Además, las células de E. coli se retuercen a medida que se alargan de forma dependiente de MreB, debido a la orientación de las hebras de glicanos con un ligero sesgo angular fuera de la dirección circunferencial . En B. subtilis, se ha observado un acoplamiento similar del movimiento de MreB a la síntesis de la pared celular, y la torsión (con sentido opuesto), lo que sugiere reglas comunes con E. coli para establecer el orden dentro de la pared a pesar de la diferencia en el grosor de la misma. Se desconoce si el patrón de inserción de la pared celular guiado por MreB también ayuda a la célula a determinar y/o mantener su anchura durante el crecimiento, aunque las mutaciones en mreB pueden dar lugar a varillas de diferentes tamaños.

Una consecuencia prevista de la elongación cilíndrica es el crecimiento exponencial, en el que las células individuales largas crecen más rápido que las cortas. De hecho, las células de E. coli se alargan exponencialmente cuando se bloquea la división , y parece que también lo hacen durante el crecimiento y la división normales . El crecimiento exponencial podría esperarse de un organismo cuya zona de crecimiento aumenta proporcionalmente a medida que la célula crece; curiosamente, la naturaleza del crecimiento exponencial (L = L02t/τ, donde τ es el tiempo de duplicación) dicta que 1/L (dL/dt) = (ln 2)/τ es constante independiente de L, lo que indica que no hay una escala de longitud preferida para un tiempo de duplicación dado.

E. coli, junto con la bacteria curva Caulobacter crescentus, ha sido un tema principal de los estudios teóricos y computacionales de la morfogénesis bacteriana. Los modelos se han dividido en dos clases amplias y complementarias: simulaciones de dinámica molecular de grano grueso de la mecánica y el crecimiento de la pared, motivadas por mecanismos hipotéticos de coordinación molecular y/o mediciones experimentales de los patrones de inserción de la pared celular, y modelos mecanoquímicos de elementos finitos que incorporan la remodelación de la pared con la relajación mecánica para predecir posibles inestabilidades y relaciones de escala entre las dimensiones celulares y los parámetros de crecimiento. Un modelo que tiene en cuenta el equilibrio entre la energía química liberada durante la inserción y el cambio en la energía de deformación debido a la nueva geometría después del crecimiento predice una anchura y una tasa de crecimiento estables para el crecimiento en forma de varilla que concuerda con las mediciones de E. coli y B. subtilis para elecciones razonables de los parámetros . Las simulaciones basadas en este modelo sugieren que la MreB ejerce una fuerza hacia el interior de la pared celular, evitando inestabilidades en el crecimiento debido a la presión de turgencia . Los modelos computacionales han sugerido en general que la determinación robusta de la forma requiere la coordinación de la incorporación de la pared celular, y las simulaciones a escala molecular sugieren que el movimiento de MreB puede ayudar a mantener la anchura de la célula a lo largo del cuerpo celular, en particular durante perturbaciones como el choque osmótico.

Crecimiento por extensión de la punta de la célula

A diferencia de E. coli, algunas células con forma de bastón crecen mediante la inserción de una nueva pared celular y una membrana en las puntas de la célula, mientras que la pared lateral es relativamente inerte. Los mecanismos de crecimiento de las puntas se han investigado en muchos organismos con pared, como S. pombe, hongos hifales, musgos y tubos de polen, así como en bacterias como A. tumefaciens. En general, se cree que el crecimiento de la punta es impulsado por una alta presión de turgencia que extiende la pared celular en la punta, junto con la adición de nuevo material y la remodelación del material antiguo por una variedad de factores intracelulares (Figura 1b).

Los modelos físicos del crecimiento de la punta han postulado que se forma una forma parecida a una varilla mediante la inserción de una pared más blanda y gelatinosa en la misma punta de la célula, que luego madura en una red más rígida en los lados de las células ,-. Los parámetros morfogenéticos que definen la forma de la punta de la célula están entonces interrelacionados por el equilibrio entre la maduración, la presión y la inserción, con la conservación de la masa como restricción. Algunos modelos biofísicos generalizados del crecimiento de la punta se han abstraído más allá de los detalles moleculares y la estructura de un sistema particular, y por lo tanto han sido útiles para proporcionar leyes de escala que relacionan la forma de la punta, el tamaño de la célula y la tasa de crecimiento que pueden ser probados y validados utilizando estudios comparativos entre especies (Figura 2) . En un estudio reciente, se predice que el radio máximo de curvatura de la punta R A se escala como 1/P, mientras que se predice que el radio de la célula se escala como (a2/P)1/3, donde a es el tamaño de la región en la que se segrega nuevo material. Esto da una relación entre las dos cantidades:

donde R y R A son fácilmente medibles a partir de imágenes de las células. En este modelo, se supone que la viscosidad de la pared es una función fija del ángulo alrededor de la punta de la célula, independiente de otros parámetros; queda por ver cuán sensibles son las predicciones a esta suposición. No obstante, es intrigante que diferentes especies de hongos y tubos de polen de plantas muestren una relación lineal entre R y R A (constante R A /R); por tanto, si la ecuación 3 es válida, estos datos implican que el tamaño a de la zona de inserción también escala con R, y especies estrechamente relacionadas incluso tienen pendientes similares. De acuerdo con estos modelos, en los tubos de polen y en S. pombe, las sintasas de la pared celular se localizan en las puntas de las células en crecimiento, donde introducen nuevo material de pared. En los tubos de polen, las mediciones de microscopía de fuerza atómica han revelado un gradiente de rigidez de la pared celular, en el que la pared del ápice es la más blanda. Aunque no se han realizado mediciones de este tipo en la levadura de fisión, las tinciones de la pared, como el blanco de calcoflúor, también sugieren la existencia de un gradiente de rigidez de la pared celular. Además, los patrones de migración de los marcadores fiduciales a lo largo de la célula durante el crecimiento son coherentes con los modelos mecánicos de la expansión de una semiesfera en un cilindro ,, lo que ilustra la utilidad de las imágenes de los patrones de crecimiento dinámico para sondear los mecanismos morfogenéticos ,,.

En S. pombe se han identificado complejas redes moleculares que modulan la forma de la célula y, por lo tanto, pueden estar implicadas a algún nivel en la regulación de la maquinaria de la pared celular. Los procesos celulares clave incluyen la exocitosis, la endocitosis, los citoesqueletos de actina y microtúbulos, y pequeñas GTPasas como Rho y Cdc42 (véase una revisión). Cdc42 puede regular el tráfico de actina y de membrana para dirigir las vesículas secretoras que contienen sintasas de la pared celular, precursores de la pared celular y la membrana al lugar de crecimiento (Figura 1b). Aunque se cree que tanto la actina como los microtúbulos ejercen fuerzas que empujan y distorsionan la membrana plasmática en las células animales, hay pocas pruebas de que den forma a las células amuralladas ejerciendo fuerzas directamente . En cambio, la actina desempeña al menos dos funciones críticas en el crecimiento celular polarizado: como vías para el transporte de vesículas a la punta de la célula basado en la miosina, y para la endocitosis . Los microtúbulos tienen un papel directo en el transporte polarizado de vesículas en algunos hongos, como Aspergillus y Ustilago. En S. pombe, los microtúbulos desempeñan un papel regulador de la polaridad al depositar proteínas Tea que regulan la actina y Cdc42 en las puntas de las células , y pueden dirigir la formación de una rama en determinadas circunstancias ,. Los modelos matemáticos han explorado cómo las proteínas Tea actúan como puntos de referencia para establecer gradientes de Cdc42 activado ,. Curiosamente, se ha observado que la actividad de Cdc42 oscila entre las dos puntas de la célula con una escala de tiempo de unos cinco minutos, lo que puede modelarse utilizando bucles de retroalimentación positiva y negativa . No se sabe si el crecimiento de la levadura de fisión varía con estas oscilaciones de Cdc42, aunque los tubos de polen y algunos hongos hifales exhiben el crecimiento de la punta en pulsos oscilantes . Además, algunos mutantes con actividad de Cdc42 alterada presentan anchuras celulares alteradas, lo que sugiere un modelo en el que un gradiente de actividad de Cdc42 en las puntas celulares se utiliza para especificar la anchura de la varilla ,,. Todavía no se sabe cómo los patrones espaciales de los factores de polaridad, como Cdc42, controlan la forma de la célula a través del crecimiento de la pared celular.

Las dimensiones de las varillas

Las dimensiones celulares, como la anchura, la longitud y el grosor de la pared celular, varían en gran medida en los distintos organismos, lo que puede influir en la distribución de las tensiones y, por tanto, en la forma celular resultante . Así, la cuantificación de la distribución de estas dimensiones celulares, junto con características morfológicas como el perfil de curvatura del cuerpo y la punta de la célula, será clave para estudiar y contrastar los mecanismos de crecimiento . Recientemente se han desarrollado herramientas computacionales que permiten un análisis rápido y automatizado de grandes poblaciones de células con una resolución inferior al píxel ,. Para ilustrar la variabilidad de los tamaños absolutos de las células entre las especies bacterianas y fúngicas, obtuvimos imágenes de las células y analizamos sus formas utilizando un marco computacional común basado en Matlab y aplicado previamente a la cuantificación de la anchura de las células en las bacterias (Figura 3a) . Estas mediciones también nos permitieron medir la curvatura del contorno celular; observamos que en las células cónicas (por ejemplo, Schizosaccharomyces japonicus), los lados permanecían rectos mientras que los polos tenían diferentes curvaturas (Figura 3b). La relación de aspecto se conserva aproximadamente en todas las bacterias estudiadas y en S. pombe, aunque otros hongos como S. japonicus tienen una relación de aspecto algo más achaparrada.

Las mediciones cuantitativas de la presión de turgencia y de las propiedades de la pared celular también son fundamentales para comprender los mecanismos de determinación de la forma celular. Aunque la presión de turgencia se ha medido directamente en grandes células vegetales, los tamaños más pequeños de las bacterias y las levaduras han hecho necesario el desarrollo de métodos indirectos para estimar la presión de turgencia. Los organismos con paredes parecen crecer bajo presiones de turgencia de unas pocas a decenas de atmósferas ,. En consonancia con la necesidad de soportar estas tensiones de turgencia, sus paredes tienen módulos de Young de decenas a cientos de MPa (1 atm = 0,1 MPa) ,,, y potencialmente se endurecen bajo tensión . La pared celular de E. coli tiene un módulo de Young de 25 a 100 MPa y las células experimentan una presión de turgencia de aproximadamente 1 atm. Curiosamente, las células de B. subtilis tienen presiones de turgencia aproximadamente 10 veces superiores a las de E. coli, y sus paredes tienen un módulo de Young similar pero son 10 veces más gruesas, lo que sugiere que quizás sus formas similares podrían surgir a través de un equilibrio mecánico común de la presión de turgencia y las tensiones de la pared. Estimaciones recientes de las células de S. pombe sitúan el módulo de Young en torno a 50 MPa y la presión de turgencia entre 10 y 15 atm (nuestros datos no publicados).

Se desconoce cómo se especifica el tamaño celular absoluto en cualquier tipo de célula, y sigue siendo una de las cuestiones pendientes en la morfogénesis. ¿Cómo especifican las células sus dimensiones, y cómo un determinado tamaño (como la forma de la célula) es ventajoso en términos evolutivos? Está claro que muchas células mantienen firmemente su tamaño a medida que crecen y se dividen mediante mecanismos homeostáticos. Por ejemplo, algunas células se comprometen a dividirse o a replicar el ADN sólo después de alcanzar un tamaño celular mínimo, lo que sugiere que tienen la capacidad de percibir su propio tamaño o geometría. Las células de S. pombe crecen hasta 14 μm de longitud antes de entrar en mitosis y dividirse. Avances recientes han identificado un sistema de factores corticales, incluyendo Cdr2 y Pom1, que parecen controlar la superficie de la célula en este proceso . Se ha propuesto la existencia de clasificadores similares en las bacterias. Otros factores que afectan al tamaño de la célula son las consideraciones mecánicas, como la tensión de la pared celular y la presión de turgencia. En el caso de una bacteria de tamaño micrométrico, un aumento de la anchura de la célula iría unido a un aumento de la tensión que conllevaría un aumento del estiramiento de la pared; a menos que se ajusten las propiedades mecánicas o el grosor de la pared celular, una bacteria probablemente no podría expandirse hasta alcanzar el tamaño de una célula de S. pombe sin romperse. Será interesante determinar cómo varían las propiedades mecánicas y el grosor de la pared en especies estrechamente relacionadas de diferentes tamaños, como Bacillus megaterium (que tiene una anchura de aproximadamente 1,5 μm) o la levadura de fisión más grande S. japonicus (Figura 3a). Así, cada especie puede alcanzar un tamaño determinado que se adecue a sus propiedades mecánicas y de crecimiento.

Formación de una varilla a partir de una esfera

Además de la propagación de la forma durante el crecimiento, las células pueden enfrentarse al reto del establecimiento inicial de la forma. Se han establecido varios sistemas para examinar la formación de la forma de varilla de novo. Cuando las esporas de S. pombe germinan, por lo general se hinchan hasta adquirir una forma casi esférica y luego crecen una protuberancia que finalmente se prolonga en una varilla de la anchura correcta. La anisotropía mecánica causada por una rotura en la pared de la espora y una acumulación local de actividad Cdc42 pueden desencadenar el crecimiento inicial de la protuberancia . Sin embargo, se sabe poco sobre cómo se establecen las dimensiones y la forma de la varilla que sobresale. Otro ejemplo de formación de forma de novo se da en la regeneración de esferoplastos. Al eliminar la pared celular, el esferoplasto resultante de S. pombe es esférico; cuando la pared se regenera, una varilla de la anchura adecuada se extiende desde la célula redonda más grande de la primera generación . Las bacterias también son capaces de regenerarse en varillas. A diferencia de la levadura, los esferoplastos bacterianos pasan de tener formas amorfas a formar células con paredes en forma de varilla en el transcurso de unas pocas generaciones, y recientemente se ha demostrado que esta reversión a una forma de varilla en B. subtilis puede iniciarse a partir de un estado completamente sin paredes. Estos comportamientos demuestran que la forma y las dimensiones de la célula están reguladas por robustos mecanismos intracelulares y no dependen únicamente de la forma de las células en las generaciones anteriores.

Mantener la anchura y mantener la varilla recta

Un reto para las células con forma de varilla es mantener la anchura de la célula durante el crecimiento. En el caso de las bacterias con forma de bastón E. coli y B. subtilis, que se alargan a lo largo de la porción cilíndrica de la célula, la anchura de la célula se mantiene constante incluso en células filamentosas que crecen hasta longitudes cercanas a las 100 micras. Un mantenimiento similar de la anchura se observa en S. pombe- y en los tubos de polen de las plantas. En las varillas que crecen en punta, la zona de crecimiento de la punta debe permanecer constante. En bacterias como E. coli, el crecimiento debe coordinarse con la extensión para que la anchura se mantenga a medida que aumenta la longitud de la célula. Los estudios de modelización han predicho que la introducción de tensión en el nuevo material durante la incorporación es necesaria para evitar la expansión radial mediada por la turgencia ,,; la despolimerización de MreB provoca un aumento gradual de la anchura de la célula , lo que indica que MreB puede desempeñar un papel en la introducción de esta tensión. Para probar estos modelos será fundamental el desarrollo de métodos genéticos y químicos para ajustar la anchura de la célula sin alterar la forma general de varilla.

Otro reto para las células con forma de varilla es mantener un eje de crecimiento lineal durante la elongación. ¿Cómo puede una célula controlar la «rectitud»? En las células de E. coli, el citoesqueleto MreB, similar a la actina, se localiza preferentemente en las regiones de curvatura gaussiana negativa, lo que sugiere que los polímeros MreB detectan la curvatura de la célula y la enderezan activamente dirigiendo la inserción de la pared celular a sitios específicos de la superficie celular en función de la geometría local. En S. pombe, el citoesqueleto de microtúbulos puede mantener las células rectas coordinando el crecimiento de la pared celular en las puntas de la célula; los microtúbulos se extienden a lo largo de la célula y transportan factores de polaridad, como las proteínas Tea, a las puntas . Los mutantes con microtúbulos anormalmente cortos o que carecen de proteínas Tea a menudo crecen de forma curvada o a veces establecen una zona de crecimiento anormal en el lado de la célula, lo que lleva a la formación de un fenotipo ramificado en forma de «T» , lo que sugiere que los microtúbulos contribuyen a la rectitud coordinando las zonas adecuadas de crecimiento en las dos puntas celulares ,. En conjunto, tanto en procariotas como en eucariotas, el citoesqueleto es responsable, al menos en parte, de mantener la forma de la célula coordinando los patrones de crecimiento local con la morfología global .

Formación de nuevos extremos: un mecanismo mecánico

Los extremos de muchas células con forma de vara son aproximadamente semiesféricos, con dimensiones acordes a las porciones cilíndricas de la célula. Aunque el extremo creciente de una célula que crece en punta está regulado por muchos factores intracelulares que modulan la remodelación progresiva de la pared celular, la formación del nuevo extremo de la célula en S. pombe proporciona un ejemplo de cómo la propia presión de turgencia puede dar forma a la pared celular. Durante la citocinesis, se forma un tabique en la pared celular en el lugar de la división, guiado por el anillo contráctil basado en la actina. Después, una parte del tabique se desprende para provocar la separación de la célula; inmediatamente después de la separación, el tabique pasa de tener una forma plana al nuevo extremo redondeado. Esta morfología, que es distinta de la forma ligeramente más puntiaguda del extremo de la célula en crecimiento, puede ser producida por un mecanismo predominantemente mecánico en el que la presión de turgencia infla la pared celular (nuestras observaciones no publicadas). Será interesante ver si alguna bacteria Gram-positiva, que tiene una pared celular más gruesa que las Gram-negativas, y que forma un septo muy parecido al de S. pombe, también da forma a sus nuevos extremos de una manera mediada por la turgencia. Por el contrario, las células de E. coli se constriñen en la mitad de la célula mucho antes de la separación celular. Esta constricción está mediada por el homólogo de la tubulina FtsZ , junto con la remodelación progresiva de la pared celular para crear una morfología polar semiesférica .