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A mecânica das conchas finas em forma de haste

O crescimento em forma de torre requer, em última análise, uma quebra de simetria, que pode surgir da direcionalidade nas propriedades materiais da parede celular, das tensões, da organização da maquinaria de síntese, ou qualquer combinação destas. Modelos físicos para a morfogênese de células muradas consideram a célula como uma fina casca viscoelástica, que é uniformemente inflada a partir de dentro pela pressão turgor. Para prever a forma celular resultante de um determinado mecanismo de crescimento, é fundamental considerar a distribuição das forças devidas à pressão turgor, as forças de contrabalanço do alongamento da parede, e como as propriedades materiais da parede unem essas forças ao grau de extensão. Para um material elástico linear, a tensão σ (força por unidade de área) está relacionada com a tensão mecânica ε (estiramento fracionário) através do módulo de Young:

uma medida da rigidez intrínseca do material semelhante à constante de força k de uma mola (para a qual a lei de Hooke dita que k = F/x, onde F é a força necessária para esticar a mola por uma quantidade x). Em uma casca elástica fina, as tensões devem aumentar com o aumento do raio celular r e com a pressão turgor P, e diminuir com a maior espessura da parede celular d. Em uma casca esférica, as tensões são iguais em todas as direções. Em contrapartida, a geometria de uma concha cilíndrica dita que as tensões circunferenciais (σ r ) são duas vezes maiores que as tensões longitudinais (σ l ) (Figura 1c):

Equações combinadas 1 e 2, estas relações do modelo prevêem que as tensões circunferenciais e longitudinais (ε r e ε l , respectivamente) devem ser linearmente dependentes da largura e da pressão do turgor e inversamente dependentes da espessura da parede. Se o módulo de Young é igual em todas as direções (mecanicamente isotrópico), então ε r deve ser duas vezes maior que ε l .

Esta relação entre as deformações em diferentes direções tem sido usada para sondar as propriedades mecânicas da parede celular de células em forma de haste. Na levedura de fissão, medir o grau de contração das células quando a pressão turgor é reduzida revela esta relação de deformação prevista de 2:1, sugerindo que a parede celular nestas células se comporta como um material isotrópico (Atilgan e Chang, observações não publicadas). Em contraste, em bactérias em forma de bastão como E. coli e B. subtilis, as células apresentam um maior grau de alongamento longitudinal em vez de radial, indicando anisotropia mecânica (ou dependência direcional), com maior rigidez na circunferência em relação ao sentido longitudinal. Estas observações são consistentes com tomogramas crio-eletrônicos mostrando que a parede celular de E. coli está organizada com os componentes mais rígidos (fios de glicanos) orientados ao longo do sentido circunferencial . Será interessante descobrir se existe anisotropia mecânica nas paredes celulares das plantas, ou se elas são mais parecidas com a parede celular de levedura de fissão.

É importante notar que a anisotropia de crescimento (alongamento ao longo de apenas um eixo) pode ocorrer usando material de parede anisotrópica ou isotrópica; de fato, material isotrópico pode ser usado para construir praticamente qualquer forma celular. Além disso, as propriedades mecânicas da parede celular podem ser muito mais complexas do que as simples relações de escalonamento que descrevemos acima. Por exemplo, a relação entre tensões e deformações não seguirá mais a equação 1 em deformações suficientemente grandes; medidas recentes de microscopia de força atômica indicam que a parede celular de E. coli exibe propriedades não-lineares em seu estado pressurizado que podem ajudar a célula a resistir à expansão durante o choque hipoosmótico. A suposição de uma espessura constante através da casca fina também pode quebrar, particularmente durante a separação devido a diferenças no modo de construção da parede no septo . Em última análise, estas características mecânicas devem ser integradas com os padrões de inserção e remodelação da parede, o que pode alterar a espessura da parede celular e levar a uma resposta viscoelástica na qual o material da parede flui como um líquido viscoso quando estressado. Isto produz um conjunto diversificado de mecanismos potenciais de crescimento em células muradas. Modelos biofísicos podem fornecer previsões testáveis para as relações entre pressão turgor, padrões de crescimento, e a distribuição das deformações e taxa de crescimento através da superfície celular,.

Crescimento por alongamento cilíndrico

Em muitas bactérias, o crescimento celular é alcançado pela inserção de novo material da parede celular em locais ao longo da parte cilíndrica da parede celular, enquanto a inserção é diminuída em pólos celulares. O organismo mais bem estudado da perspectiva do crescimento da parede celular é a E. coli, com várias revisões focando a bioquímica, máquinas de síntese, morfologia e características físicas da parede celular. Como a maioria das bactérias, E. coli tem uma parede celular composta de peptidoglicano, uma rede macromolecular de fios de açúcar (glicanos) reticulados por pequenos peptídeos. Como foi observado acima, os fios de glicanos mais rígidos são orientados circunferencialmente, tornando a parede celular mecanicamente anisotrópica, além da anisotropia de crescimento da forma da haste. A proteína citoesquelética MreB, um homólogo da actina eucariótica, move-se de forma aproximadamente circunferencial ao longo da face interna da membrana citoplasmática, e o mecilinam antibiótico de alvos da parede celular inibe este movimento, sugerindo um modelo em que os rastros de MreB indicam os caminhos de inserção de novo material na parede lateral ,. Além disso, as células de E. coli torcem ao se alongarem de forma dependente de MreB, devido à orientação dos fios de glicoscópio com um ligeiro viés angular afastado do sentido circunferencial. Em B. subtilis, o acoplamento do movimento de MreB com a síntese da parede celular, e a torção (com mão oposta) tem sido observada, sugerindo regras comuns com E. coli para estabelecer a ordem dentro da parede, apesar da diferença na espessura da parede. Não se sabe se o padrão de inserção da parede celular guiado por MreB também ajuda a célula a determinar e/ou manter sua largura durante o crescimento, embora mutações em mreB possam resultar em hastes de diferentes tamanhos .

Uma consequência prevista do alongamento cilíndrico é o crescimento exponencial, no qual células longas individuais crescem mais rápido que as curtas. Na verdade, as células E. coli alongam exponencialmente quando a divisão é bloqueada , e parecem fazê-lo também durante o crescimento normal e divisão . O crescimento exponencial pode ser esperado de um organismo cuja zona de crescimento aumenta proporcionalmente à medida que a célula cresce; curiosamente, a natureza do crescimento exponencial (L = L02t/τ, onde τ é o tempo de duplicação) dita que 1/L (dL/dt) = (ln 2)/τ é constante independentemente de L, indicando que não há escala de comprimento preferida para um dado tempo de duplicação.

E. coli, juntamente com a bactéria curva Caulobacter crescentus, tem sido um tema principal de estudos teóricos e computacionais da morfogénese bacteriana. Os modelos têm caído em duas classes amplas e complementares: simulações de dinâmica molecular de grãos grosseiros de mecânica de paredes e crescimento, motivadas por mecanismos hipotéticos de coordenação molecular e/ou medidas experimentais de padrões de inserção de parede celular, e modelos mecano-químicos de elementos finitos que incorporam remodelação de paredes com relaxamento mecânico para prever potenciais instabilidades e relações de escala entre dimensões celulares e parâmetros de crescimento, -. Um modelo que considera o equilíbrio entre a energia química liberada durante a inserção e a mudança na energia de deformação devido à nova geometria após o crescimento prevê uma largura estável e uma taxa de crescimento para o crescimento em forma de bastão que concorda com as medições de E. coli e B. subtilis para escolhas razoáveis de parâmetros . Simulações baseadas neste modelo sugerem que o MreB exerce uma força interna na parede celular, impedindo instabilidades no crescimento devido à pressão do turgor . Modelos computacionais geralmente sugerem que a determinação robusta da forma requer coordenação da incorporação da parede celular, e simulações em escala molecular sugerem que o movimento do MreB pode ajudar a manter a largura celular ao longo do corpo celular, particularmente durante perturbações como choque osmótico .

Crescimento por extensão da ponta da célula

Em contraste com a E. coli, algumas células em forma de bastão crescem através da inserção de nova parede celular e membrana nas pontas da célula, enquanto a parede lateral é relativamente inerte. Mecanismos de crescimento da ponta têm sido investigados em muitos organismos murados, incluindo S. pombe, fungos hifais, musgo e tubos polínicos, bem como em bactérias como A. tumefaciens. Em geral, pensa-se que o crescimento da ponta é impulsionado pela alta pressão turgor que estende a parede celular na ponta, acoplado à adição de novo material e à remodelação do material antigo por uma variedade de fatores intracelulares (Figura 1b).

Modelos físicos de crescimento da ponta postularam que uma forma parecida com uma vara é formada pela inserção de uma parede parecida com um gel mais macio na própria ponta da célula, que então amadurece em uma rede mais rígida nos lados das células ,-. Os parâmetros morfogenéticos que definem a forma da ponta da célula são então inter-relacionados pelo equilíbrio entre maturação, pressão e inserção, com a conservação da massa como uma restrição. Alguns modelos biofísicos generalizados de crescimento da ponta foram abstraídos para além dos detalhes moleculares e da estrutura de um sistema particular, e por isso têm sido úteis para fornecer leis de escala relativas à forma da ponta, tamanho celular e taxa de crescimento que podem ser testadas e validadas usando estudos comparativos entre espécies (Figura 2) . Em um estudo recente, o raio máximo da ponta de curvatura R A é previsto para escala como 1/P enquanto o raio da célula é previsto para escala como (a2/P)1/3, onde a é o tamanho da região na qual o novo material é secretado. Isto dá uma relação entre as duas quantidades:

onde R e R A são facilmente mensuráveis a partir de imagens de células. Neste modelo, assume-se que a viscosidade da parede é uma função fixa de ângulo ao redor da ponta da célula, independente de outros parâmetros; resta ver o quão sensíveis as previsões são a esta suposição. No entanto, é intrigante que diferentes espécies de fungos e tubos de pólen vegetal apresentem todos uma relação linear entre R e R A (constante R A /R); assim, se a equação 3 se mantiver, estes dados implicam que o tamanho a da zona de inserção também se escalona com R, e as espécies intimamente relacionadas têm mesmo declives semelhantes. Consistentes com estes modelos, em tubos polínicos e em S. pombo, as síntases da parede celular são localizadas em pontas de células em crescimento, onde introduzem novo material de parede. Em tubos polínicos, as medidas de microscopia da força atômica revelaram um gradiente de rigidez da parede celular, no qual a parede no ápice é a mais macia. Embora tais medidas não tenham sido feitas em levedura de fissão, manchas de parede como o calcofluor branco também sugerem um gradiente de rigidez da parede celular,,. Além disso, padrões de migração de marcadores fiduciais ao longo da célula durante o crescimento são consistentes com modelos mecânicos de expansão de um hemisfério em um cilindro, ilustrando a utilidade da imagem de padrões dinâmicos de crescimento para a sondagem de mecanismos morfogenéticos,.

Em S. pombe, foram identificadas redes moleculares complexas que modulam a forma celular e, portanto, podem estar envolvidas em algum nível na regulação de máquinas de parede celular. Os principais processos celulares centrais incluem exocitose, endocitose, actina e citoesqueleto de microtubos e pequenos GTPases como Rho e Cdc42 (veja para uma revisão). O Cdc42 pode regular o tráfico de actina e membrana para visar vesículas secretoras contendo síntases de parede celular, precursores de parede celular e membrana para o local de crescimento (Figura 1b) . Embora se pense que tanto a actina como os microtubos exercem forças que empurram e distorcem a membrana plasmática nas células animais, há poucas evidências de que eles formem células muradas através do exercício direto de forças . Em vez disso, a actina desempenha pelo menos dois papéis críticos no crescimento celular polarizado: como pistas para o transporte de vesículas à base de miosina até à ponta da célula e para a endocitose. As microtubículas têm um papel direto no transporte polarizado de vesículas em alguns fungos, tais como Aspergillus e Ustilago. Em S. pombe, os microtubos desempenham um papel regulador na polaridade, depositando proteínas de chá que regulam a actina e o Cdc42 nas pontas celulares, e podem orientar a formação de um ramo em determinadas circunstâncias. Modelos matemáticos exploraram como as proteínas do Chá atuam como marcos para estabelecer gradientes de Cdc42 ativado. Curiosamente, a atividade do Cdc42 tem sido observada para oscilar entre as duas pontas celulares com uma escala de tempo de cerca de cinco minutos, que pode ser modelada usando loops de feedback positivo e negativo. Não se sabe se o crescimento da levedura de fissão varia com estas oscilações de Cdc42, embora os tubos polínicos e alguns fungos hifálicos apresentem crescimento da ponta em pulsos oscilatórios . Além disso, alguns mutantes com atividade Cdc42 alterada exibem larguras celulares alteradas, sugerindo um modelo no qual um gradiente de atividade Cdc42 nas pontas celulares é usado para especificar a largura da haste,,. Como padrões espaciais de fatores de polaridade como o Cdc42 controlam a forma celular através do crescimento da parede celular permanece mal compreendido.

As dimensões das hastes

Dimensões celulares como largura, comprimento e espessura da parede celular variam muito entre diferentes organismos, potencialmente impactando a distribuição de tensões e, portanto, a forma celular resultante. Assim, a quantificação da distribuição destas dimensões celulares, juntamente com características morfológicas como o perfil de curvatura do corpo celular e da ponta, será fundamental para o estudo e o contraste dos mecanismos de crescimento. Recentemente foram desenvolvidas ferramentas computacionais que permitem a análise rápida e automatizada de grandes populações de células com resolução sub-pixel. Para ilustrar a variabilidade no tamanho absoluto das células entre as espécies bacterianas e fúngicas, fizemos uma imitação das células e analisámos as suas formas utilizando uma estrutura computacional comum baseada em Matlab previamente aplicada à quantificação da largura das células em bactérias (Figura 3a) . Estas medições também nos permitiram medir a curvatura do contorno celular; notamos que em células cónicas (por exemplo, Schizosaccharomyces japonicus), os lados permaneceram rectos enquanto os pólos tinham diferentes curvaturas (Figura 3b). A razão de aspecto é aproximadamente conservada através das bactérias estudadas e em S. pombe, embora outros fungos como S. japonicus sejam um pouco mais agachados na razão de aspecto.

Medições quantitativas da pressão do turgor e propriedades da parede celular também são críticas para a compreensão dos mecanismos de determinação do formato da célula. Embora a pressão de turgor tenha sido medida diretamente em grandes células vegetais, os tamanhos menores de bactérias e leveduras necessitaram do desenvolvimento de métodos indiretos para estimar a pressão de turgor,,,. Os organismos murados parecem crescer sob pressões de turgor de algumas a dezenas de atmosferas,. Consistentes com a necessidade de suportar estas tensões turgor, suas paredes têm modulos Young de dezenas a centenas de MPa (1 atm = 0.1 MPa) ,,, e potencialmente endurecem sob estresse. A parede celular de E. coli tem módulo de Young de 25 a 100 MPa , e as células experimentam uma pressão turgor de aproximadamente 1 atm ,. Curiosamente, as células B. subtilis têm uma pressão turgor de aproximadamente 10 vezes maior que a de E. coli, e suas paredes têm um módulo similar de Young, mas são 10 vezes mais espessas, sugerindo que talvez suas formas similares possam surgir através de um equilíbrio mecânico comum de pressão turgor e tensões na parede. Estimativas recentes de células S. pombe colocam o módulo de Young em torno de 50 MPa e a pressão turgor em 10 a 15 atm (nossos dados não publicados).

Como o tamanho absoluto da célula é especificado é desconhecido em qualquer tipo de célula, e permanece uma das questões pendentes em morfogênese. Como as células especificam suas dimensões, e como um determinado tamanho (como a forma da célula) é vantajoso em termos evolutivos? É claro que muitas células mantêm o seu tamanho à medida que crescem e se dividem usando mecanismos homeostáticos. Por exemplo, algumas células se comprometem com a divisão ou replicação de DNA somente depois de atingir um tamanho mínimo de célula, sugerindo que elas têm a capacidade de sentir seu próprio tamanho ou geometria. As células de S. pombo crescem até 14 μm de comprimento antes de entrar na mitose e na divisão. Avanços recentes identificaram um sistema de fatores corticais incluindo Cdr2 e Pom1 que parecem monitorar a área da superfície da célula neste processo . Tamanhos similares têm sido propostos em bactérias . Fatores adicionais que afetam o tamanho da célula são considerações mecânicas, tais como estresse da parede celular e pressão de turgor. Para uma bactéria de tamanho micron, um aumento na largura da célula seria acoplado a um aumento no stress que implicaria um aumento no alongamento da parede; a menos que as propriedades mecânicas ou espessura da parede celular fossem ajustadas, uma bactéria provavelmente não poderia expandir-se para atingir o tamanho de uma célula S. pombe sem romper. Será interessante determinar como as propriedades mecânicas e a espessura da parede variam entre espécies estreitamente relacionadas de diferentes tamanhos, tais como Bacillus megaterium (que tem aproximadamente 1,5 μm de largura) ou a levedura de fissão maior S. japonicus (Figura 3a). Cada espécie pode assim atingir um certo tamanho que se adequa às suas propriedades mecânicas e de crescimento.

Formação de uma haste de uma esfera

Além da propagação da forma durante o crescimento, as células podem enfrentar o desafio do estabelecimento inicial da forma. Vários sistemas foram estabelecidos para examinar a formação da forma da haste de novo. Quando os esporos de S. pombo germinam, eles geralmente incham para uma forma quase esférica e depois crescem uma protrusão que eventualmente se estende até uma haste com a largura correta. A anisotropia mecânica causada por uma quebra na parede do esporo e uma acumulação local de atividade de Cdc42 pode desencadear o crescimento inicial da protrusão. No entanto, pouco se sabe sobre como as dimensões e a forma da haste protuberante são estabelecidas. Outro exemplo de formação de nova forma está na regeneração de esferoplastos. Ao remover a parede celular, o esferoplasto de S. pombo resultante é esférico; quando a parede se regenera, uma haste com a largura adequada se estende da célula redonda maior na primeira geração. As bactérias também são capazes de se regenerar em hastes. Ao contrário da levedura, os esferoplastos bacterianos transitam através de formas amorfas para formar células muradas, em forma de haste, ao longo de algumas gerações, e foi recentemente demonstrado que esta reversão para uma haste em forma de B. subtilis pode iniciar a partir de um estado completamente sem parede. Estes comportamentos demonstram que a forma e dimensões da célula são reguladas por mecanismos intracelulares robustos e não dependem apenas da forma das células nas gerações anteriores.

Manter a largura e manter a haste reta

Um desafio para as células em forma de haste é manter a largura da célula durante o crescimento. Para as bactérias em forma de bastão E. coli e B. subtilis, ambas alongadas ao longo da porção cilíndrica da célula, a largura da célula permanece constante mesmo em células filamentosas que crescem em comprimentos próximos a 100 microns ,. Manutenção similar da largura é vista em S. pombe- e em tubos polínicos de plantas. Nas hastes de cultivo da ponta, a zona de crescimento da ponta deve permanecer constante. Em bactérias como a E. coli, o crescimento deve ser coordenado com a extensão para que a largura seja mantida à medida que o comprimento da célula aumenta. Estudos de modelagem previram que a introdução de estresse no novo material durante a incorporação é necessária para evitar a expansão radial mediada pelo turgor; a despolimerização do MreB causa um aumento gradual na largura celular, indicando que o MreB pode desempenhar um papel na introdução desse estresse. Crítico para testar estes modelos será o desenvolvimento de métodos genéticos e químicos para sintonizar a largura celular sem perturbar a forma geral da haste.

Um outro desafio para as células em forma de haste é manter um eixo linear de crescimento durante o alongamento. Como pode uma célula monitorar a ‘linearidade’? Em células E. coli, o citoesqueleto MreB tipo actina localiza-se preferencialmente em regiões de curvatura Gaussiana negativa, sugerindo que os polímeros MreB sentem a curvatura celular e endireitam ativamente a célula direcionando a inserção da parede celular para locais específicos na superfície da célula com base na geometria local. Em S. pombe, o citoesqueleto do microtubo pode manter as células retas coordenando o crescimento da parede celular nas pontas da célula; os microtubos se estendem através do comprimento celular e transportam fatores de polaridade, como as proteínas do chá, para as pontas . Mutantes com microtubos anormalmente curtos ou que carecem de proteínas do chá frequentemente crescem em forma curva ou às vezes estabelecem uma zona de crescimento anormal no lado da célula, levando à formação de um fenótipo ramificado, em forma de ‘T’ , sugerindo que os microtubos contribuem para a retidão coordenando as zonas adequadas de crescimento nas pontas das duas células ,. Em conjunto, tanto em procariotas como eucariotas, o citoesqueleto é pelo menos parcialmente responsável pela manutenção da forma celular através da coordenação dos padrões locais de crescimento com a morfologia global .

Nova formação final: um mecanismo mecânico

As extremidades de muitas células em forma de bastão são aproximadamente hemisféricas, com dimensões de acordo com as porções cilíndricas da célula. Enquanto a extremidade crescente de uma célula em forma de ponta é regulada por muitos fatores intracelulares que modulam a remodelação progressiva da parede celular, a formação da nova extremidade da célula em S. pombe fornece um exemplo de como a própria pressão turgor pode moldar a parede celular. Durante a citocinese, um septo da parede celular é formado no local da divisão, guiado pelo anel contrátil baseado em actina. Depois disso, parte do septo é digerida para causar a separação celular; imediatamente após a separação, o septo muda de uma forma plana para a nova extremidade arredondada. Esta morfologia, que é distinta da forma ligeiramente mais pontiaguda da ponta da célula em crescimento, pode ser produzida por um mecanismo predominantemente mecânico no qual a pressão turgor infla a parede celular (nossas observações inéditas). Será interessante ver se alguma bactéria Gram-positiva, que tem uma parede celular mais espessa que os Gram-negativos, e forma um septo como em S. pombe, também forma suas novas extremidades de forma turgor-mediada. Em contraste, as células de E. coli se contraem no meio das células bem antes da separação celular. Esta constrição é mediada pelo homólogo tubulínico FtsZ , juntamente com a remodelação progressiva da parede celular para criar uma morfologia polar hemisférica .