Diskuze
Jedním z důležitých parametrů v HELM je úhel α paprsku vůči optické ose, který určuje prostorovou frekvenci buzení u. Na obr. 4 je vidět, že volba u vyžaduje obchodování s maximální mezní frekvencí podél osy kx a ky vs. maximální mezní frekvence. anizotropie výsledného propustného pásma.
Zvolená hodnota (55°) je dobrým kompromisem a navíc umožňuje přímé pozorování interferenčního obrazce imerzními objektivy.
V důsledku neizotropního propustného pásma vykazují obrazy kuliček určitou anizotropii a převýšení v blízkosti okrajů kuliček; nejvíce patrné jsou tmavé zóny v diagonálních směrech na obr. 2A. Tomuto efektu by se dalo do značné míry zabránit použitím šesti nebo osmi laserových paprsků orientovaných v násobcích 60°, resp. 45°.‡
V porovnání s CFM je poměr signálu k šumu obrazu HELM lepší, přestože časově integrovaný výkon laseru byl u obrazu CFM na obr. 2C více než 100krát vyšší. Jeden ze základních důvodů tohoto zlepšení spočívá ve skutečnosti, že zvýšení rozlišení CFM ve srovnání se standardní fluorescenční mikroskopií lze dosáhnout pouze použitím malé dírky v dráze emisního světla (5, 13, 14). Toto uspořádání vyžaduje kompromis mezi úrovní šumu a rozlišením. Naopak u HELM mohou být všechny fotony vstupující do čoček zachyceny kamerou.
Pro studium dynamických objektů je rychlost zobrazování velmi důležitá. Základní omezení rychlosti zobrazování ve fluorescenční mikroskopii je dáno maximální rychlostí emise fluoroforů způsobenou konečnou dobou života excitovaného stavu („nasycení barviva“; cit.15 ). V HELM je interferenčním obrazcem v jednom okamžiku osvětlena zhruba polovina fluoroforů, zatímco v běžném jednobodovém CFM je v jednom okamžiku osvětlen pouze nepatrný zlomek fluoroforů (≈1 na milion pro obraz 1 024 × 1 024 pixelů). V důsledku toho je celkový tok fotonů ze vzorku omezen na hodnoty, které jsou u sekvenční operace CFM o několik řádů nižší než u paralelní operace HELM. Vzhledem k tomu, že pro určitou úroveň odstupu signálu od šumu je nutný minimální počet fotonů na snímek, má HELM potenciál získávat obrazová data mnohem rychleji než CFM. Kromě tohoto zásadního hlediska HELM snižuje problémy s rychlostí spojené s mechanickými skenovacími mechanismy, protože na rozdíl od CFM, kde je vyžadováno jedno skenování na řádek, se provádí pouze pět skenů na obraz. Jak problém s nasycením barviva, tak potíže s mechanickým skenováním u CFM však mohou být redukovány novějšími vícebodovými skenery.
Výhody v oblasti rychlosti zobrazování jsou patrné i z našich experimentálních dat. Celková doba akvizice pěti snímků potřebných pro HELM (obr. 2A) byla 1,6 s ve srovnání s 6,5 s pro konfokální zobrazení (obr. 2C). Vezmeme-li v úvahu vyšší poměr signálu k šumu obrazu HELM, kterého se dosahuje s nechlazenou CCD kamerou průmyslové třídy, je rozdíl zřejmý.
Prakticky zajímavým bodem je požadovaná stabilita interferenčního obrazce během měření. Zjistili jsme, že chyby fázového posunu o velikosti 1/10 vzdálenosti uzlů (20 nm) jsou právě tolerovatelné, ale větší chyby vedou k výraznému zhoršení obrazu. Teplotní drift naší sestavy (typicky 20 nm/min v místnosti s nekontrolovanou teplotou) omezuje dobu akvizice na několik desítek sekund. Toto omezení však lze snadno překonat rekalibrací fázových posunů během dlouhodobého měření. Heterogenita indexu lomu vzorku vede také k nežádoucím fázovým chybám interferenčního obrazce, které jsou v tomto případě závislé na prostoru. Stejně jako dříve, aby se tyto chyby omezily na přijatelné hodnoty, nemělo by zkreslení vlnoplochy způsobené heterogenitou indexu lomu překročit několik desítek nanometrů. Očekáváme, že požadavky platné pro HELM se příliš neliší od požadavků zaručujících zobrazování s vysokým rozlišením pomocí dobře korigovaných objektivů s vysokou NA ve standardní mikroskopii. Ke studiu citlivosti HELM vůči heterogenitě indexu lomu v praxi budou zapotřebí další experimentální údaje.
Pro mnoho aplikací má velký význam zkoumání trojrozměrné struktury vzorku. Trojrozměrná obrazová data lze získat krokováním ohniska přes označený (16) nebo neoznačený vzorek (17, 18). Bohužel axiální rozlišení standardní fluorescenční mikroskopie je silně omezeno na přibližně 0,9 μm pro bodové objekty a, což je ještě horší, může se zcela rozpadnout pro libovolné objekty (19). Tento problém odpovídá skutečnosti, že trojrozměrný OTF má chybějící kužel kolem osy kz v počátku, a v důsledku toho výsledný trojrozměrný obraz vykazuje potenciální artefakty. CFM naproti tomu nemá chybějící kužel a umožňuje získat trojrozměrné obrazy s axiálním rozlišením přibližně 0,8 μm (20), které je však stále horší než laterální.
Byly popsány různé metody, jak axiální rozlišení dále zlepšit. Takzvaný 4π mikroskop (21) je derivátem CFM s druhým objektivem, který sbírá i fotony šířící se směrem k zadní straně komory vzorku. Axiální rozlišení může teoreticky dosahovat až 100 nm, zatímco laterální rozlišovací schopnost se rovná CFM. Mikroskop 4π je rovněž skenovací.
Neskenovací přístup je popsán v refs. 22 a 23. Silně zvýšené axiální separační schopnosti je dosaženo pomocí interferenčního pole, jehož uzlové a antinodální roviny jsou rovnoběžné s rovinou obrazu. Tato metoda je vhodná pro objekty, které jsou tenčí než jedna perioda budicího obrazce. Zobrazování tlustších vzorků může vést k artefaktům, protože ve výsledném propustném pásmu stále chybí kužel na počátku (9).
Nedávno byl demonstrován další vývoj, který sdílí aspekty posledně uvedené metody a mikroskopie 4π (mikroskopie I5M; ref. 24). Mikroskopie I5M využívá složitější interferenční pole generované nekoherentním zdrojem světla k selektivnímu osvětlení roviny objektu a jedná se o neskenovací metodu. Axiální rozlišení se rovná rozlišení mikroskopie 4π (100 nm), ale laterální rozlišení se vůbec nezvyšuje.
Zvýšeného axiálního rozlišení lze dosáhnout také osvětlením vzorku pomocí třásňového obrazce vytvořeného například zobrazením mřížky na objektu (25) nebo interferencí dvou laserových paprsků (26). U těchto metod se použitý rekonstrukční algoritmus výrazně liší od našeho, protože se vynechává centrální přenosový kruh na obr. 4 a protože informace o objektu se přenáší pouze ve dvou postranních pásmech (27). Lze ukázat, že v tomto případě dochází ke snížení rozostření.
Žádoucí je mikroskop s rovnoměrně vysokým rozlišením 100 nm ve všech prostorových směrech bez nutnosti použití skenovací metody. HELM, jak byl zaveden v našem současném uspořádání, nezvyšuje axiální rozlišení ve srovnání se standardní fluorescenční mikroskopií. Klíčovou myšlenkou však je, že harmonická excitace spolu s rekonstrukčním algoritmem podobným zde popsanému funguje i v prostorových směrech, které nejsou rovnoběžné s rovinou objektu. Použitím harmonických vzorů intenzity, které mají své uzlové a antinodální roviny v příslušných prostorových směrech, lze získat další kopie trojrozměrného OTF v libovolném požadovaném směru. Takové dodatečné oblasti propustného pásma by se mohly překrýt do jednoho rozšířeného propustného pásma s vysokou mezní frekvencí v celém recipročním prostoru.
Naší představou pro budoucí uspořádání je použití jednotek pro kontinuální vychylování paprsku (jako jsou galvanometry nebo akusticko-optická zařízení), aby bylo možné snadno vytvářet interferenční obrazce ve vybraných orientacích v prostoru a s různými uzlovými vzdálenostmi. Takové uspořádání by umožnilo trojrozměrné zobrazování a současně by vyřešilo problémy s anizotropií způsobené dvourozměrným OTF ve tvaru trojlístku.
.