Alai

Discussion

HELMで重要なパラメータの1つはビームの光軸に対する角度αで、これは励起の空間周波数uを決定するものです。

選択した値（55°）は良い妥協点であり、さらに、液浸対物レンズで干渉パターンを直接観察できる。

非等方性通過帯のため、ビーズの画像はビーズの端の近くで多少の異方性とオーバーシュートが見られる；最も顕著なのは図2Aの斜め方向の暗い領域である。 この効果は、それぞれ60°または45°の倍数で配向した6本または8本のレーザービームを使用することにより、ほぼ回避することができた。 この改善の根本的な理由の一つは、標準的な蛍光顕微鏡と比較したCFMの解像度向上が、発光光路に小さなピンホールを使用することによってのみ達成できることにある（5, 13, 14）。 このため、ノイズレベルと分解能をトレードオフする必要がある。 一方、HELMでは、レンズに入射するすべての光子をカメラで収集することが可能である

動体の研究において、イメージングスピードは大きな意味を持つ。 蛍光顕微鏡の撮像速度の基本的な限界は、励起状態の有限な寿命による蛍光体の最大発光速度である（「色素飽和」；文献15）。 HELM では、蛍光体のおよそ 1/2 が一度に干渉縞によって照らされるが、一般的なシングルポイント CFM では、蛍光体のごく一部のみが一度に照らされる (1,024 × 1,024 ピクセル画像で約 100 万分の 1)。 その結果、試料からの全光束は、CFM の順次動作の場合、HELM の並列動作の場合よりも数桁小さい値に制限される。 このため、HELM は CFM に比べ、高速に画像データを取得できる可能性がある。 また、1 ラインあたり 1 回の走査で済む CFM に対し、HELM は 5 回の走査で済むため、機械的な走査機構に起因する速度の問題 を軽減することができる。 しかし、CFMの色素飽和の問題や機械的な走査の困難さは、新しいマルチポイントスキャナーによって軽減することが可能である。 HELM（図2A）に必要な5枚の画像の合計取得時間は、共焦点画像（図2C）の6.5秒と比較して1.6秒であった。 非冷却の工業用CCDカメラで達成されるHELM画像のより高いS/N比を考慮すると、その差は明らかである。

実用上の関心事は、測定中に必要な干渉パターンの安定性の点である。 位相オフセット誤差はノーダル間隔の1/10(20nm)程度ならギリギリ許容範囲だが、それ以上の誤差は大幅な画像劣化につながることが分かった。 我々のセットアップの熱ドリフト（非温度制御の部屋では通常20nm/min）により、取得時間は数十秒に制限される。 しかし、この制限は、長時間の測定中に位相オフセットを再較正することで容易に克服することができる。 また、試料の屈折率不均一性は、干渉パターンの不要な位相誤差を引き起こし、この場合、空間依存性がある。 これらの誤差を許容範囲内に抑えるためには、屈折率不均質による波面歪みが数十ナノメートルを超えないようにすることが必要であることは前述と同様である。 HELM に適用される要件は、標準的な顕微鏡検査において、十分に補正された高 NA 対物レンズを用いた高解像度イメージングを保証する要件と大差ないことが予想される。 屈折率不均一性に対するHELMの感度を調べるには、さらなる実験データが必要です。

多くのアプリケーションでは、試料の3次元構造を調べることが大きな関心事となっています。 三次元画像データは、標識（16）または非標識（17、18）の試料にフォーカスを移動させることで取得することができる。 残念ながら、標準的な蛍光顕微鏡の軸方向の分解能は、点状の物体に対しては約0.9 μmに強く制限され、さらに悪いことに、任意の物体に対しては完全に破綻してしまうことがある(19)。 この問題は、3次元のOTFが原点のkz軸の周りに円錐が欠けていることに対応し、その結果、得られる3次元画像は潜在的なアーチファクトを示す。 一方、CFMは円錐の欠損がなく、0.8μm程度の軸方向の分解能で三次元画像を得ることができる（20）が、それでも横方向の分解能に劣る。 いわゆる4π顕微鏡(21)はCFMの派生型で、試料室の裏側へ伝播する光子も集めるために第二対物レンズをつけたものである。 軸方向の分解能は理論上100nmまで可能であるが、横方向の分解能はCFMと同等である。 4ππ 顕微鏡も走査型であるが、

非走査型はrefs.Non-Scanningに記載されている。 22と23に記載されている。 非走査方式は、22,23文献に記載されており、結節面と反結節面が像面に平行な干渉場により、軸方向の分離能力を強く向上させることが可能である。 この方法は、励起パターンの1周期よりも薄い物体によく適している。 7255>

後者の方法と4π顕微鏡の側面を共有するさらなる発展が最近示された（I5M 顕微鏡；文献24）。 I5M顕微鏡は、非コヒーレント光源によって生成されるより複雑な干渉場を用いて、物体面を選択的に照明する非走査法である。 軸方向の分解能は4π顕微鏡と同等（100nm）だが、横方向の分解能は全く上がらない。

軸方向の分解能を上げるには、例えば、グレーティングを試料に結像させて作る縞模様（25）や二つのレーザービームの干渉（26）で試料に光を当てればよい。 これらの方法では、図4の中央の透過円が省略され、物体情報が2つのサイドバンドのみで転送されるため、適用される再構成アルゴリズムが私たちのものとは大きく異なります(27)。 この場合、ピンぼけが少なくなることがわかる。

望ましいのは、走査方式でなくとも全空間方向に一様に100 nmの高い分解能を持つ顕微鏡である。 現在のセットアップで確立されたHELMは、標準的な蛍光顕微鏡と比較して軸方向の解像度を上げることはできない。 しかし、重要な考え方は、調和励起とここに述べたものと同様の再構成アルゴリズムが、物体平面と平行でない空間方向でも機能することである。 適切な空間方向に節面および反節面を有する高調波強度パターンを使用することにより、3次元OTFの追加コピーが任意の所望の方向に得られる。 7255>

将来的には、連続ビーム偏向装置（ガルバノメータや音響光学装置のようなもの）を用いて、空間内の特定の方向と様々な節点間隔で簡単に干渉パターンを生成することを考えています。 このような構成により、3次元イメージングが可能になると同時に、クローバーリーフ型の2次元OTFによる異方性の問題も解決できるだろう。