Alai

Von Willebrand Factor, ADAMTS13 og trombotisk trombocytopenisk purpura

VWF syntetiseres fra et stort gen på kromosom 12p13.31, der strækker sig over 178 kb og indeholder 52 exoner.49 Det messenger-RNA (mRNA), der produceres af dette gen, specificerer et polypeptid på 2813 aminosyrer, som omfatter et signalpeptid på 22 aminosyrer, et propeptid på 742 aminosyrer og en sekvens på 2050 aminosyrer, der udgør den monomere byggesten i VWF, som findes i plasma. Efter spaltning af signalpeptidet i det endoplasmatiske reticulum disulfidbindes de propeptidholdige monomerer til dimerer gennem disulfidbindinger mellem kæderne, der involverer Cys-rester tæt på molekylets C-terminus. Disse dimerer transporteres derefter ind i Golgi-apparatet, hvor propeptidet katalyserer disulfidbindinger mellem disdimere mellem rester i D3-domænet, hvilket giver lange multimerer bestående af dimerer, der er forbundet hoved mod hoved og indeholder N-terminaler i begge ender. Propeptidet spaltes derefter af et furin-lignende enzym, og det meste af det resulterende ULVWF pakkes ind i lagringsgranulat til senere reguleret sekretion.

Der er kun to celletyper, der er kendt for at syntetisere VWF: endothelceller og megakaryocytter. I endothelceller lagres VWF i granula kaldet Weibel-Palade-legemer; i trombocytter lagres det i α-granula. Det meste VWF i blodet er af endothelial oprindelse. Mange stimuli kan fremkalde frigivelse af endothelial VWF, herunder adrenalin, desamino-vasopressin (DDAVP), histamin, thrombin, Shiga-toksiner og proinflammatoriske cytokiner, herunder tumornekrosefaktor (TNF)-α, interleukin (IL)-8 og IL-6 (i kompleks med IL-6-receptoren).50 Andre stoffer kan også fremkalde endothelial frigivelse af VWF, hvilket giver et fingerpeg om nogle af de inciterende faktorer i TTP. Disse agenser omfatter virus såsom adenovirus51 og oxidanter såsom superoxid.52 Oxidanter har ikke kun evnen til at inducere ULVWF-sekretion; de kan også oxidere VWF, så det ikke kan spaltes af ADAMTS1353 og bliver mere klæbende.54 Endvidere kan oxidanter, især dem, der produceres af neutrofiler og monocytter under inflammation, oxidere en afgørende methioninrest i det katalytiske ADAMTS13-domæne og inaktivere enzymet.55

Både endothelceller og trombocytter frigiver VWF-multimere, der er større end multimere i normalt plasma.56 Disse ULVWF multimerer er ikke blot meget større end dem, der normalt findes i plasma; de er også meget mere adhæsive og i stand til at binde blodpladernes VWF-receptor glycoprotein Ib (GPIbα; det største polypeptid i GPIb-IX-V-komplekset) spontant og med en højere bindingsstyrke end den, der opnås ved binding af plasma-VWF til GPIbα i tilstedeværelse af modulatorerne ristocetin eller botrocetin57 . In vivo betyder dette, at ULVWF er i stand til at binde trombocytter ved ingen eller lav shearstress, mens forarbejdet plasma-VWF kræver høj shearstress-induceret udfoldning for at binde trombocytter58 .

En del af nyligt frigivet ULVWF går direkte ind i det cirkulerende blod, mens en anden fraktion forbliver fastgjort til endothelet, hvor ULVWF-multimere kan selvassocieres til at danne strenge på flere hundrede mikrometer til flere millimeter i længden, der forbliver forankret til endotheloverfladen.59 Overfladebundne ULVWF-strenge er hyperadhæsive og binder spontant trombocytter til at danne trombocyt-dekorerede strenge med “perler på strenge”-udseende på endotheloverfladen. Under fysiologisk shearstress spaltes de blodplade-dekorerede ULVWF-strenge af ADAMTS13 og fjernes fra endotheloverfladen. Yderligere behandling, som endnu ikke er fuldt ud karakteriseret, gør VWF’en ude af stand til spontant at binde blodpladerne. Akkumulationen af trombocyt-dekorerede ULVWF-strenge på endoteloverfladen som følge af reducerede niveauer eller fravær af ADAMTS13 i cirkulationen initierer mikrovaskulær trombose, som fører til dannelse og aflejring af trombocytterige hyalintrombier i mikrovaskulaturen – et definerende kendetegn for TTP.

ULVWF-strenge består af bundter af VWF-multimere, og hver streng er bundet til endoteloverfladen ved flere ankersteder. I fravær af (eller i lave koncentrationer af Ca2+ og Mg2+) hæfter ULVWF-strenge sig til endotheloverfladen ved at binde sig til P-selectin60 . I tilstedeværelse af fysiologiske koncentrationer af tosidige kationer forankrer ULVWF-strenge sig til endotheloverfladen gennem deres interaktion med integrin αvβ3.61 Andre molekyler er utvivlsomt involveret i denne forankring af VWF-strenge, men de er endnu uidentificerede.

Evnen hos VWF eller ULVWF-multimere til at selvassociere sig til tykkere fibre og kabler bliver en vigtig mekanisme til regulering af VWF’s adhæsive egenskaber. Savage et al. viste, at VWF multimerer i væskefasen under shearstress og i tilstedeværelse af blodplader homotypisk og reversibelt associerer sig med VWF multimerer, der er immobiliseret på en kollagenoverflade; de selvassocierede VWF multimerer understøtter blodpladeadhæsion under shearstress62. VWF-multimere i væskefasen kan også associeres med ULVWF-strenge, der er fastgjort til endotheloverfladen,63 og selvassocieringen fremmes ved delvis udfoldning af VWF-molekylerne induceret af shearstress64,65 eller ved binding af ristocetin.66 De selvassocierede VWF-multimere danner et netværk af tværbundne fibre på kollagenoverflader64 eller i opløsning.66 Under shearstress kan VWF-multimere i væskefasen også associere sig med VWF-multimere, der er bundet til blodpladerne gennem interaktion med GPIbα på blodpladeoverfladerne.67 Selvassociering af VWF på trombocytoverflader kan udløse trombocytaktivering, fremme trombocytaggregation og øge trombusvækst.

V VWF’s evne til selvassociering gør det muligt at producere strenge, der konkurrerer med eller overgår længden og tykkelsen af de strenge, der produceres ved fibrinpolymerisation. I syntetiske mikrokar, der er induceret til at udskille VWF ved agoniststimulering, kan VWF, der udskilles fra karvæggen, samle sig til strenge, der er i stand til at spænde over karrets lumen, især ved bifurkationer og kurver68 . VWF’s evne til at danne tråde og kabler af så enorme dimensioner og snore disse kabler på tværs af strømningsvejen øger ikke kun chancerne for, at trådene fanger trombocytter, men forbedrer også deres evne til at flænse erytrocytter til skistocytter.

VWF-selv-association i sig selv reguleres ikke kun af shearstress, men også af plasmafaktorer, hvilket sandsynligvis kan ændre forløbet og sværhedsgraden af TTP-episoder. VWF-selv-association dæmpes af lipoprotein med høj densitet (HDL) og af apoliprotein (Apo) A-I, den vigtigste proteinkomponent i HDL. Begge reducerer signifikant længden og tykkelsen af de VWF-fibre, der er immobiliseret på endotheloverfladen. Trombocytadskillelsen til disse hyper-adhæsive strukturer reduceres også i forhold til reduktionen af selv-associeret VWF. I en model af TMA i ADAMTS13 knockout-mus mindskede HDL også signifikant den trombocytopeni, der blev induceret ved infusion af høje doser humant VWF.69 I overensstemmelse med ApoA-I’s evne til at modulere VWF-selv-association korrelerer dets plasmakoncentration omvendt med niveauet af hyperadhæsivt VWF hos patienter med TTP og sepsis. Disse resultater tyder på, at interferens med VWF-selv-association kunne være en ny tilgang til behandling af trombotiske lidelser, der er forbundet med hyperadhæsiv VWF, herunder TTP.

Den VWF-spaltende metalloprotease er det 13. medlem af en familie af 18 forskellige enzymer af ADAMTS-typen, der til dato er identificeret, og som har strukturelle ligheder.16,17 ADAMTS13 består af et N-terminalt metalloprotease-domæne af reprolysin-typen (M), efterfulgt af et disintegrin-domæne (D), et thrombospondin-1-lignende domæne (T), et cysteinrigt domæne (C), der indeholder en arginin-glycin-aspartat-sekvens, et spacerdomæne (S), syv yderligere thrombospondin-1-lignende domæner (T2-8) og to ikke-identiske domæner af CUB-typen (CUB1-2) i den C-terminale ende af molekylet (Fig. 24.2). CUB-domæner indeholder peptidsekvenser, der ligner komplementunderkomponenterne C1r/C1s, embryonalt søpindsvinsprotein egf og bone morphogenic protein-1.70 ADAMTS13 er et Zn2+- og Ca2+-krævende 190.000-dalton-glykoprotein, hvis gen befinder sig på kromosom 9q34 og produceres overvejende i leverens stellatceller.71,72 ADAMTS13 hæmmes af EDTA; derfor udføres funktionelle analyser af enzymet bedst på citreret plasma.12,14-17,73-77 Plasma, der er antikoaguleret med heparin, chloromethylketoner (f.eks. phenylalanin-prolin-aspartat-chloromethylketon ), hirudin og andre direkte trombininhibitorer (DTI’er), vil også være tilfredsstillende til testning. Serum, der er behørigt behandlet med proteasehæmmere, er også egnet til testning.78

AdAMTS13’s spaltning af VWF afhænger af konformationsændringer i VWF forårsaget af shear stress, en kraft, der ændrer konformationen af VWF multimere fra globulær til åben.79 Denne konformationsovergang efterfølges af udfoldning af et eller flere A2-domæner i VWF-multimeren, hvorved Tyr1605-Met1606-peptidbindingen udsættes for spaltning af ADAMTS1379 eller oxidation af Met1606 med hypoklorit.54 Ud over forskydningskraft fremmes overgangen til den tilgængelige konformation også af ændringer i A2-domænets struktur forårsaget af kulhydrattilhæftning,80 aminosyresubstitutioner i type 2A VWD, der destabiliserer A2-domænets foldning,81 og mutationer i type 2B VWD82 og binding af ristocetin,83 som begge samtidig eksponerer A1-domænet for trombocytbinding og ADAMTS13-spaltningsstedet.

Den genkendelse og spaltning af VWF af ADAMTS13 var blevet undersøgt indgående. Nylige beviser viser, at i det native ADAMTS13-molekyle er de C-terminale T8-CUB-domæner i kontakt med de N-terminale MDTCS-domæner, et intramolekylært samspil, der delvist hæmmer MDTCS-domænernes evne til at binde og kløve VWF-78-peptid-substratet. I denne native konformation er ADAMTS13 delvist autoinhiberet.84,85 ADAMTS13’s evne til at folde sig i denne konformation er tilsyneladende lettet af den fleksibilitet, som fire formodede linkersekvenser, der er placeret mellem T1 og T2, T2 og T3, T4 og T5, T8 og CUB1-domænerne, giver.86 Autoinhibitionen ophæves, når de C-terminale domæner enten er afkortede eller bundet af antistoffer eller multimer VWF, hvilket muliggør indgreb af MDTCS-domænerne i substratet.

Baseret på mutationsanalyser, bindingsundersøgelser, kinetiske analyser og brug af syntetiske peptid-substrater er flere interagerende steder mellem det konformationsmæssigt aktive ADAMTS13 og det udfoldede VWF A2-domæne blevet identificeret og sammenfattet i en molekylær lynlås-model,87 som skematisk afbildet i fig. 24.3. Ved eksponering af multimerisk VWF for et kritisk niveau af shearstress eksponeres først en exosit i A2-domænet. Denne exosit omfatter Glu1660-Arg1668-helixregionen, der ligger 65 aminosyrer C-terminalt for spaltningsstedet og binder til ADAMTS13’s spacerdomæne med høj affinitet (KD ~ 10 nM).88-90 Shearstress eksponerer også en anden exosit med lav affinitet i A2-domænet ved eller nær Asp1614 (P9′-stedet), som interagerer med Arg349 i ADAMTS13’s disintegrin-domæne.91 Interaktion af disse to exositter med komplementære regioner i ADAMTS13 placerer Tyr1605-Met1606-spaltningsstedet i VWF med det aktive center i ADAMTS13’s metalloprotease-domæne. Dette indebærer interaktion mellem Leu1603 (P3-sted) i VWF med komplementære Leu198, Leu232 og L272 (S3-sted) i ADAMTS13, Tyr1605 (P1-sted) i VWF med Leu151 og Val195 (S1-sted) i ADAMTS13 og Met1606 (P1′-sted) i VWF med Asp252-Pro256 (S1′-sted) i ADAMTS13.92 Phage display og tilfældig mutationsanalyse bekræfter og viser, at aminosyrer i P3-P2′- og P11′-regionen (Ile161616) også er vigtige for spaltning93. Således letter sekventiel interaktion mellem disse komplementære regioner i de to multidomæneproteiner specifik spaltning af den scissile binding.

Svigt i nedbrydningen af ULVWF-multimere har længe været mistænkt for at forårsage familiære og erhvervede idiopatiske typer af TTP eller for at prædisponere et individ til disse lidelser (Fig. 24.4).11,94 Kritiske eksperimenter, der blev udført for at verificere dette koncept, blev rapporteret i 1997 og 1998. Fire patienter med kronisk recidiverende TTP viste sig at have mangel på ADAMTS13-aktivitet i plasma.12 Da der ikke blev påvist nogen inhibitor af enzymet, blev denne mangel tilskrevet en abnormitet i produktionen, overlevelsen eller funktionen af proteasen. I løbet af det følgende år blev patogenesen for den mere almindelige erhvervede idiopatiske type TTP belyst.13-15 Patienter med erhvervet idiopatisk TTP havde ringe eller slet ingen plasma ADAMTS13-aktivitet under akutte episoder, men denne aktivitet steg mod det normale ved helbredelse. Selv om plasmaanalyserne i disse undersøgelser ikke var fysiologiske, var de ikke desto mindre innovative og informative. Immunoglobulin (Ig) G autoantistoffer mod enzymet var sandsynligvis årsag til den manglende proteaseaktivitet hos de fleste patienter med erhvervet idiopatisk TTP.13-15 Årsagerne til denne forbigående immundysregulering samt til den selektive antigeniske målretning af den VWF-spaltende protease kendes endnu ikke.

Patienter med familiær kronisk recidiverende TTP har ofte ULVWF multimerer i deres plasma.11,94 ULVWF multimere påvises ved hjælp af en følsom agarosegelelektroforese-metode i nogle patientplasmaprøver under akutte episoder af erhvervet idiopatisk TTP, men ikke efter bedring94 . Disse fund blev forklaret af forskere, der opdagede et kronisk fravær af ADAMTS13 i plasma i familiær kronisk recidiverende TTP samt en forbigående hæmning af enzymet under akutte episoder af erhvervet idiopatisk TTP.12-15

De fleste patienter med familiær TTP har mindre end 5 % af den normale ADAMTS13-aktivitet i deres plasma, uanset om plasmaet er fremstillet under eller efter akutte episoder (forudsat at de ikke for nylig har modtaget plasmainfusioner). De fleste patienter med erhvervet idiopatisk TTP har mindre end 5 % af den normale ADAMTS13-aktivitet i deres plasma kun under akutte TTP-episoder12 .-15,24,95 Alvorlig mangel på ADAMTS13-aktivitet i plasma fra patienter med TTP korrelerer med manglende evne til at spalte ULVWF-multimerer, når de kommer ud fra endothelcellers overflader (se Fig. 24.4).59 Som følge heraf forbliver ULVWF-multimerer, der udskilles af endothelceller, forankret til disse celler og selvassocierer sig til lange strenge59 og er i stand til at fange forbipasserende trombocytter ved at binde trombocyt-GPIbα (Fig. 24.5).68 (Trombocytter binder ikke spontant til de mindre VWF-former, der cirkulerer efter spaltning af ULVWF-multimere.)56 Yderligere trombocytter slutter sig efterfølgende til det voksende trombocytaggregat (rekrutteret til aggregatet via aktiveret αIIbβ3), som kan vokse til det punkt, hvor det okkluderer karret (se Fig. 24.4).59,96 Selv om de fleste tilfælde af idiopatisk TTP har alvorlig ADAMTS13-mangel, er der en undergruppe, som ikke har alvorlig mangel på enzymaktivitet som målt med de nuværende tilgængelige analyser.97 Det er endnu ikke klart, om dette skyldes interferens med enzymaktiviteten fra antistoffer, som ikke påvises af de tilgængelige analyser, VWF’s modstandsdygtighed over for spaltning (f.eks. på grund af oxidativ modifikation),53 eller andre årsager. Ikke desto mindre er det sandsynligt, at mange patienter i denne kategori stadig vil have gavn af plasmaudvekslingsbehandling.98 Det bør også understreges, at ADAMTS13-mangel hverken er følsom eller specifik (ADAMTS13-aktiviteten er nedsat i mange andre sygdomme)99 til at stille diagnosen erhvervet TTP.

ULVWF-strenge er i stand til at løsne sig fra endothelceller i fravær af ADAMTS13-aktivitet, idet de bliver mekanisk afskåret med den stigende spænding, der genereres af væskeskærestresset, når blodpladerne hæfter og aggregerer.59 De løsrevne ULVWF-trombocytstrenge kan okkludere nedstrøms mikrokar og bidrage til organiskæmi.

Plasma ADAMTS13-aktivitet er næsten altid fraværende eller stærkt nedsat hos patienter med familiær TTP,12,100,101 som følge af homozygote eller sammensatte heterozygote mutationer i ADAMTS13-genet.18,24,95,102,103 Mutationer i familiær TTP er blevet påvist i hele genet i regioner, der koder for forskellige domæner (se fig. 24.2). Ved alvorlig medfødt mangel på ADAMTS13-aktivitet begynder episoder af TTP normalt i spæd- eller barndommen. Hos nogle patienter udvikles åbenlyse TTP-episoder dog først i årevis (f.eks. under en første graviditet),102 hvis de overhovedet opstår. Sidstnævnte observation tyder på, at der hos nogle patienter fortsat er restaktivitet af ADAMTS13, og at akutte episoder af TTP udløses, når frigivelsen af ULVWF fra endothelceller overstiger deres ADAMTS13’s begrænsede kapacitet til at behandle dem. Et tilfælde, hvor dette kan ske med regelmæssighed, er under graviditet: VWF-niveauer er kendt for at stige under graviditeten.104-106 I overensstemmelse med denne opfattelse diagnosticeres kvinder med medfødt TTP ofte under deres første graviditet.29 Hos spædbørn med neonatal debut af medfødt TTP og mindre end 5 % ADAMTS13-aktivitet er forbigående eller progressiv nyresvigt ofte en fremtrædende komponent af sygdommen.107 Disse patienter ligner klinisk to patienter, der blev beskrevet i 1960 af Schulman og kolleger108 og i 1978 af Upshaw109; derfor omtales denne pædiatriske undergruppe undertiden som havende “Upshaw-Schulman syndrom.”

I mange patienter med erhvervet TTP er plasma ADAMTS13-aktiviteten enten fraværende eller stærkt reduceret under akutte episoder og stiger, når de kommer sig, hvad enten det drejer sig om enkeltstående eller tilbagevendende episoder.13-15 IgG autoantistoffer, der hæmmer plasma ADAMTS13-aktiviteten, kan påvises hos 44 % til 94 % af disse patienter.13-15,102,110,111 Disse resultater tyder på tilstedeværelsen af en forbigående eller intermittent tilbagevendende defekt i immunreguleringen hos mange patienter, der har erhvervet idiopatisk TTP associeret med ADAMTS13-mangel. Antistoffer, der hæmmer plasma-ADAMTS13, er også blevet identificeret hos nogle få patienter med ticlopidin- eller clopidogrel-associeret TTP.34,112 Det vides endnu ikke, om der forekommer en forbigående alvorlig defekt i ADAMTS13-produktion eller -overlevelse hos patienter med erhvervet TTP, som ikke har påviselige autoantistoffer mod enzymet. Alternativt kan den manglende påvisning af hæmmende autoantistoffer hos nogle patienter afspejle den begrænsede følsomhed af de testsystemer, der anvendes i øjeblikket. Ikke-inhiberende autoantistoffer, der kan binde og potentielt formidle immunclearing af ADAMTS13, påvises ikke af det nuværende testsystem.

En undersøgelse evaluerede ADAMTS13-epitoper, der genkendes af polyklonale autoantistoffer hos 25 patienter med erhvervet TTP,113 og fandt, at antistofmålene altid omfattede sekvensen cysteinrigt/spacerdomæne (CS); hos 3 patienter var dette den eneste region, der var mål for antistofferne. De øvrige 22 autoantistoffer reagerede med CS-domænesekvensen plus CUB-domænerne (64 %), metalloprotease/disintegrin-lignende/første thrombospondin-1-lignende domæne (MDT) sekvensen (56 %) eller regionen, der indeholder de anden til ottende thrombospondin-1-lignende gentagelser (T2-8, 28 %) (se fig. 24.2). Propeptidregionen blev også identificeret af 20 % af autoantistofferne,113 hvilket indikerer, at fjernelse af propeptidet ikke er påkrævet for sekretion af aktivt enzym.114 Autoantistoffer hæmmer aktiviteten af ADAMTS13 eller nedsætter dets overlevelse. I en anden undersøgelse af syv patienter identificerede Luken et al.115 autoantistoffer mod ADAMTS13 hos seks patienter, som udelukkende var bundet til spacerdomænet (S); hos den syvende patient var antistofferne bundet til både S-domænet og T2-8 gentagelser. Ved mutagenese fastslog disse forskere, at regionerne Thr572-Asn579 og Val657-Gly666 i spacerdomænet af ADAMTS13 var de fælles epitoper for autoantistofbinding.116 Når Arg660, Tyr661 eller Tyr665 blev substitueret med alanin, blev bindingen af autoantistofferne fra de seks TTP-patienter elimineret.117

Autoantistoffer mod ADAMTS13 hos patienter med erhvervet TTP hører overvejende til IgG-klassen,118 selv om IgM- og IgA-klasseantistoffer også er blevet påvist.119 Kloning og sekventering af de monoklonale antistoffer fra patienter med erhvervet TTP viser, at der er en præferentiel inkorporering af den tunge kædes gensegment VH1-69 i den variable region af immunoglobulinerne.120,121 Denne præference tyder på, at CDR2- eller CDR3-regionen af VH1-69 kan bidrage til specificiteten for en epitop på spacer-domænet af ADAMTS13. I en analyse af fordelingen af antistofsubtyper hos 58 patienter med akut erhvervet TTP blev der påvist antistoffer, der tilhører alle IgG-subtyper.118 IgG4 var den mest udbredte subtype og var til stede hos 90 % af patienterne, enten alene eller i kombination med andre IgG-subtyper.

Produktionen af ADAMTS13 autoantistoffer er næsten helt sikkert genetisk påvirket. Denne kendsgerning understreges af opdagelsen hos tvillingesøstre af erhvervet TTP forårsaget af ADAMTS13 autoantistoffer.122 Der forekommer tilbagefald hos 23 % til 44 % af patienterne med erhvervet TTP,102,110,123,124 ofte i løbet af det første år efter den første episode.102 Tilbagefald er mest almindeligt blandt patienter med de laveste ADAMTS13-aktivitetsniveauer (<10 %)

Graviditet og den postpartale periode udgør en særlig udfordring med hensyn til TTP. For det første har præeklampsi og HELLP-syndromet (hæmolyse, forhøjede leverenzymer, lave trombocytter) mange kliniske træk, der overlapper med TTP, og kan dele visse patofysiologiske træk som systemisk endotel dysfunktion og proteinuri (se kapitel 32).125 HELLP-syndromet kan være særligt vanskeligt at skelne fra TTP, idet det også manifesterer mikroangiopatisk hæmolytisk anæmi, forhøjede LDH-niveauer og trombocytopeni (dog normalt ikke så alvorlig som ved TTP).126 TTP under graviditet kan være forbundet med autoantistoffer mod ADAMTS13, og sygdommen manifesterer sig normalt nær termin eller postpartum.127 Skøn over risikoen for tilbagefald under efterfølgende graviditeter varierer meget, fra 26 % til 73 % pr. graviditet.102

Plasma ADAMTS13-aktivitet hos raske voksne varierer fra ca. 50 % til 178 % af normalt poolet plasma ved hjælp af aktuelt tilgængelige statiske assays. Der er også fundet nedsat ADAMTS13-aktivitet ved leversygdom, disseminerede maligniteter,128 systemiske inflammatoriske syndromer som f.eks. forårsaget af endotoxin,129 akut pancreatitis,130 alvorlig sepsis og septisk chok,131 sepsisinduceret DIC,132 og sepsisinduceret organdysfunktion.133-135 Desuden kan der findes lave ADAMTS13-niveauer under graviditet og hos nyfødte.136 Med undtagelse af de peripartumkvinder, der udvikler åbenlys TTP,102,110 er ADAMTS13-aktiviteten, der observeres hos patienter med disse tilstande, ikke reduceret til de ekstremt lave værdier (<5% af normalen), der findes hos de fleste patienter med familiær eller erhvervet TTP.

ADAMTS13-assays

ADAMTS13-assays bestemmer proteolytisk aktivitet, antigenniveau og niveauet af anti-ADAMTS13-autoantistoffer. Tidlige ADAMTS13-aktivitetsassays var baseret på nedbrydning af rensede VWF-multimere i tilstedeværelse af denatureringsmidler og kvantificering af spaltningsprodukterne ved immunoblotting,74,75 resterende kollagenbinding,137 eller reduceret ristocetin-induceret trombocytaggregation.138 Selv om disse assays er følsomme, er de besværlige og tidskrævende at udføre, og de indebærer brug af denatureringsmidler. Disse assays blev erstattet, efter at undersøgelser af de rekombinante VWF-fragmenter afslørede minimale sekvenser, der er nødvendige for aktivitetsmålinger. Kokame og kolleger udførte delvise deletioner af VWF A2-domænet og identificerede et minimalt peptid på 73 aminosyrer (VWF73, Asp1596-Arg1668), som blev effektivt spaltet af ADAMTS13 i fravær af denatureringsmidler under statiske forhold88 . Efterfølgende er der blevet udviklet flere assays baseret på spaltning af peptider, der omfatter VWF73, såsom fluorescensresonansenergioverførsel (FRET)97 , en HRP-bundet VWF78,139 ELISA,140 immunoblotting,141 og massespektrometri142 .

I 2008 blev der gennemført en anden international samarbejdsundersøgelse for at sammenligne ydeevnen af otte funktionelle og tre antigenassays for ADAMTS13.143 Sammenligningen af disse metoder viste, at spaltningsassays baseret på modificerede VWF-peptider som substrater gav høj nøjagtighed og reproducerbarhed og lav varians og variabilitet mellem metoderne. FRET-VWF73-assayet er siden blevet anvendt i vid udstrækning til at kvantificere ADAMTS13-aktivitet i patientprøver. Selv om det FRET-baserede assay er let at udføre, har det flere begrænsninger. For det første bør FRET-VWF73-spaltning med citratplasma som kilde til ADAMTS13 udføres ved temperaturer under 33 °C, da der ved 37 °C sker en betydelig irreversibel inaktivering af ADAMTS13 ved citratmedieret calciumchelatering. For det andet kræver optimal detektion af fluorescenssignalet, at FRET-VWF73-substratet spaltes ved pH 6,1, hvilket reducerer spaltningshastigheden. For det tredje danner nogle inhiberende autoantistoffer ved denne suboptimale pH-værdi ikke stabile komplekser med ADAMTS13, og disse antistoffer forbliver uopdagede i inhibitionsundersøgelser. For det fjerde forekommer der en betydelig interferens af fluorescenssignalet fra hæmoglobin og bilirubin på grund af spektral overlapning. Der er blevet udviklet et forbedret FRET-baseret peptid-substrat, FRETS-rVWF71. ADAMTS13-aktiviteten i serum og citreret eller hepariniseret plasma kan måles med dette forbedrede substrat ved fysiologisk pH, ionstyrke og calciumkoncentration uden interferens fra de endogene VWF-multimere eller bilirubin eller hæmoglobin i plasma.78 En anden begrænsning ved disse peptidbaserede aktivitetsassays er, at ADAMTS13’s evne til at kløve multimer VWF under shearstress ikke vurderes. Selv om det er blevet vist, at den shearstress, der frembringes ved konstant vortexing, fremmer spaltning af VWF-multimere,144 er kvantificering af spaltningsprodukterne ved immunoblotting fortsat tidskrævende. Der findes mindst fire kommercielle kits til måling af ADAMTS13-aktivitet baseret på rapporterede metoder. Disse kits er imidlertid ikke blevet evalueret i direkte sammenlignings- og standardiseringsundersøgelser.

ADAMTS13-antigenniveauer er blevet kvantificeret ved hjælp af monoklonale og polyklonale antistoffer.145,146 Indflydelsen af trunkering, mutationer og autoantistoffer på nøjagtigheden og følsomheden af disse test er uklar. Der findes fem kommercielle testsæt til måling af ADAMTS13-antigenniveauer, men der er ikke foretaget nogen validering og sammenligning med andre assays.

I 2015 blev den første internationale standard for ADAMTS13 etableret og testet i 32 laboratorier fra 14 lande for ADAMTS13-aktivitet og antigenniveauer i forhold til lokale standarder.147 Denne plasmastandard, der betegnes WHO IS (12/252), blev fremstillet af puljeplasma fra 38 normale raske donorer. Denne undersøgelse viste en konsensusmiddelværdi på 0,91 enheder/mL af ADAMTS13-aktivitet for dette plasma med en variabilitet mellem laboratorierne på 12,4 % og 0,92 enheder/mL af ADAMTS13-antigen med en variabilitet mellem laboratorierne på 16,3 %. Den store interlaboratorievariabilitet skyldtes ikke primært brugen af forskellige lokale standarder, men metodologiske forskelle mellem laboratorierne.

Analyser af anti-ADAMTS13 autoantistoffer udføres typisk ved at blande varmeinaktiveret patientplasma med en kendt mængde poolet normal plasma og måle den resterende ADAMTS13-aktivitet. Ikke-neutraliserende antistoffer påvises ved immunoblotting.148

Og selv om der hidtil ikke er blevet identificeret nogen ikke-antistof-ADAMTS13-specifik inhibitor, kan flere proteiner og peptider hæmme ADAMTS13-spaltning af VWF under særlige betingelser. Disse omfatter hæmoglobin, IL-6, thrombospondin-1 og neutrofile α-defensiner. I alle tilfælde binder de hæmmende stoffer tilsyneladende substratet, VWF, og forhindrer VWF i at blive spaltet af ADAMTS13. Det blev vist, at hæmoglobin virker på denne måde, idet det binder VWF-strenge på endoteloverfladen under flow og kompetitivt blokerer for spaltning af ADAMTS13.149 Denne mekanisme kan bidrage til de vaso-okluderende komplikationer hos patienter med seglcellesygdom med betydelig hæmolyse og yderligere komplicere TTP, når hæmolyseprocenten er høj. Høje koncentrationer af IL-6 (50 og 100 ng/mL) hæmmer også den ADAMTS13-medierede spaltning af endotheliale ULVWF-strenge under flow in vitro,50 hvilket tyder på, at denne mekanisme kan bidrage til trombose under cytokinstorm150 eller cytokinfrigivelsessyndromet.151 Thrombospondin-1, et rigeligt protein i α-granulerne af trombocytter, der frigives i cirkulationen ved aktivering af trombocytter, binder A2-A3-regionerne af VWF og blokerer og hæmmer konkurrencemæssigt spaltning af ADAMTS13 in vitro.152 Denne prothrombotiske egenskab af thrombospondin-1 er i overensstemmelse med defekt trombocytterekruttering til aktiveret eller skadet endothel og øget embolisering af trombocytetrombi observeret i thrombospondin-1 knockout-mus.153 Humane neutrofile peptider kendt som α-defensiner, der frigives fra aktiverede neutrofile, kan binde VWF A2-domænet og kompetitivt blokere ADAMTS13-medieret spaltning.154 Koncentrationerne af α-defensiner øges op til syv gange i plasmaet hos patienter med erhvervet TTP.