Alai

En kort historie om T. reesei

Den ældste bioteknologiske praksis med svampe til fremstilling af øl, vin og ost kan dateres flere årtusinder tilbage, dvs. helt tilbage til begyndelsen af den skriftsproglige civilisation. Derimod fandt opdagelsen af den filamentøse mesofile ascomycet Trichoderma reesei (dengang Trichoderma viride) for dens forbløffende potentiale til at producere ekstracellulære cellulaser sted for lidt over 70 år siden. I første omgang blev det destruktive potentiale af den oprindelige Trichoderma sp. isoleret fra rådnende udstyr fra den amerikanske hær på Salomonøerne under Anden Verdenskrig betragtet som temmelig problematisk. Ikke desto mindre gik der ikke lang tid, før forskere på Natick Army Research Laboratories under ledelse af Mary Mandels og Elwyn T. Reese, den navngivende forsker, forsøgte at omsætte dette problematiske potentiale til målrettede produkter . I en screening af 14.000 skimmelsvampe fra Quartermaster Collection Trichoderma sp. QM6a en fremragende evne til at nedbryde naturlig krystallinsk cellulose. Betegnelsen “QM6a” for det sidste tilbageværende originale Trichoderma-isolat, som identificerede det som den sjette af seks kulturer af svampen, der opbevares i Quartermaster Collection i Natick, blev bibeholdt. Denne stamme betragtes ikke blot som T. reesei-referencestammen, men er også den stamme, hvorfra alle de mutanter, der anvendes i industrien i dag, stammer.

Dengang og nu blev forskningen i T. reesei drevet frem af den idé, at dens udskilt cellulaser kunne have en afgørende betydning for den 200 år gamle kamp for økonomisk at producere brændstoffer fra vedvarende, lignocelluloseholdig biomasse. T. reesei-forskningen har siden da været banebrydende for konceptet om enzymatisk saccharificering af cellulose ved hjælp af en synergistisk kombination af forskellige cellulaseaktiviteter og har lagt grunden til vores nuværende forståelse af reguleringen af de involverede enzymer . Dens vigtigste cellobiohydrolase CBH1 (CEL7a) var også den første eukaryote cellulase, der blev klonet, og den første cellulase, hvis struktur blev opklaret . Et vigtigt skridt i retning af industriel anvendelse af T. reesei-cellulaser var udviklingen af effektive mutagenese- og screeningprocedurer for stammer i 1970’erne. I de følgende to årtier kunne titeren af ekstracellulært protein produceret af den oprindelige stamme QM6a øges med op til 20 gange ved hjælp af mutageneseprogrammer på Natick og Rutgers University. Sidstnævnte kulminerede med isolering af stamme RUT-C30 (hvor “RUT” står for Rutgers). Selv om guldstandarden for cellulaseproduktion i industrien blev rapporteret til at være højere end 100 g/L, er denne stamme stadig prototypen af cellulasehyperproducent, der er tilgængelig for offentligheden, med titre af ekstracellulært protein, der når op på 30 g/L på det cellulaseinducerende substrat laktose .

I begyndelsen blev der imidlertid udviklet andre kommercielle anvendelser for cellulaser, da det blev klart, at en effektiv og fuldstændig saccharificering af lignocelluloseholdig biomasse til gærbare sukkerarter kræver mange flere enzymatiske aktiviteter end oprindeligt forventet. Igen blev forskningen med T. reesei fortsat banebrydende inden for enzymologi i forbindelse med nedbrydning af både cellulose og hemicellulose, og det gør den stadig i dag . Ved hjælp af atomkraftmikroskopi med høj hastighed har man nu også visualiseret nedbrydningen af cellulose, hvilket viser, hvordan den vigtigste cellobiohydrolase CBH1/CEL7A glider ensrettet langs celluloseoverfladen . I begyndelsen af 1990’erne var man begyndt at få adgang til transformationsteknikker, der gør det muligt at foretage gensplejsning af T. reesei . I løbet af det kommende årti var disse teknologier medvirkende til at opnå ny indsigt i reguleringen af dens enzymer og til at ændre den enzymprofil, som svampen udskiller . På det tidspunkt var T. reesei også blandt de første værter til ekspression af pattedyrproteiner, hvilket blev illustreret ved ekspression af kalvechymosin under cbh1 (cel7a) ekspressionssignaler .

I slutningen af 1990’erne opdagede Kuhls et al. at Hypocrea jecorina faktisk er den seksuelle form af T. reesei, hvilket er årsagen til, at en række efterfølgende publikationer har brugt H. jecorina som artsnavn i stedet for T. reesei. En mere detaljeret undersøgelse af den seksuelle udvikling førte til den hypotese, at stamme QM6a faktisk er hunsteril, hvilket efterfølgende kunne knyttes til en mutation i det MAP-kinase-saffold-kodende gen ham5 .

Tusindårsskiftet, som for genetik kan ses som en vending væk fra studiet af isolerede gener og veje til studiet af hele genomer, så T. reesei ankomme i den såkaldte genomiske æra. Den første globale tilgang til undersøgelse af T. reesei genekspression i 2003 var en transkriptomisk undersøgelse af Foreman et al. , som konstruerede DNA-mikroarrays baseret på cDNA’er, der svarede til over 5 000 forskellige transkriptioner i T. reesei-genomet. Fem år senere lagde sekventeringen og analysen af genomet af det oprindelige T. reesei-isolat QM6a grundlaget for en bred anvendelse af genomviddeundersøgelser. I de følgende år førte en sammenlignende genomisk analyse af en række cellulasehyper- og -nulproducerende stammer til opdagelse af potentielle nye faktorer, der er involveret i cellulasehyperproduktion, såsom nukleocytoplasmatisk transport, vacuolær proteintrafik og mRNA-omsætning . Disse sammenlignende analyser var til gavn for det faktum, at alle T. reesei-stammer, der anvendes i den akademiske verden og i industrien, stammer fra stamme QM6a. 65 år efter Elwyn Reese’s første undersøgelser af T. reesei’s nedbrydning af cellulose er den installerede kapacitet til produktion af celluloseholdige biobrændstoffer på verdensplan nu 480,5 millioner liter ethanol om året (MMLY), hvoraf 380,5 MMLY (eller ca. 80 %) produceres ved hjælp af T. reesei enzymformuleringer som Accellerase og Cellic (fig. 1a). Denne indsats krævede uden tvivl en modning af den underliggende teknologi på flere niveauer, herunder procesteknik og forbehandling af substratet. Alligevel var og er produktionen og optimeringen af enzymformuleringer til biomasseforsukningstrinnet stadig en af de vigtigste faktorer, der er afgørende for omkostningseffektiviteten af celluloseethanolprocesser . Desuden er enzymproduktion ved hjælp af T. reesei på ingen måde begrænset til produktion af bioraffinaderienzymer. Faktisk produceres ca. 11 % af alle tekniske enzymformuleringer, der er registreret af Association of Manufacturers and Formulators of Enzyme Products, med T. reesei som ekspressionsvært (fig. 1b og c). Sidst, men ikke mindst, bevarer T. reesei stadig sin betydning i forskningen, hvilket eksemplificeres af mere end 100 forskningsartikler, der omhandler svampen eller dens enzymer, som offentliggøres hvert år (fig. 1d).

The T. reesei biomass enzyme mix: new insights and limitations

In nature lignocellulose deconstruction is rarely accomplished by a single organism. Det sker snarere gennem den sekventielle rækkefølge og den kollektive indsats af flere organismer, der producerer flere kulhydrataktive enzymer (CAZymes) til nedbrydning af de forskellige polymerer. Det er derfor ikke overraskende, at T. reesei’s cellulasemix måtte tilpasses betydeligt for at kunne levere en konkurrencedygtig enzymformulering til en fuldstændig lignocelluloseforsukning til konkurrencedygtige priser. Forskerne indså tidligt, at T. reesei-formuleringer manglede tilstrækkelig β-glucosidaseaktivitet, fordi det meste af aktiviteten er bundet til svampens cellevæg . Derfor forbedrede en øget β-glucosidaseaktivitet cellulose-nedbrydningen, fordi den modvirker produkthæmning gennem cellobiose, som igen frigøres ved samvirken mellem endoglucanaser og cellobiohydrolaser . Denne feedback-mekanisme bremser ellers celluloseforsukning alvorligt. Ligeledes hæmmer hemicelluloseafledte xylo- og mannooligosaccharider cellobiohydrolaser fra T. reesei, hvilket stærkt tyder på, at der kræves tilstrækkelig β-xylosidase- og β-mannosidaseaktivitet for at nedbryde lignocellulose effektivt. I 2003 beskrev Foreman et al. to proteiner, der er co-induceret med de vigtigste cellulaser, og kaldte dem celluloseinduceret protein 1 og 2 (CIP1 og CIP2). Det er siden blevet påvist, at de er vigtige for en effektiv nedbrydning af lignocellulose . Nylige resultater viser, at CIP1 har strukturelle ligheder med lyaser, selv om lyaseaktivitet ikke kunne påvises , og at CIP2 er en glucuronoylesterase af CE15-familien . Et andet vigtigt sekretet protein er swollenin SWO1, som indeholder et kulhydratbindingsmodul (CBM) forbundet med et ekspansinlignende domæne . På trods af celluloseopløsende aktivitet øger SWO1 synergistisk endoxylanaseaktiviteten snarere end endoglucanase- eller cellobiohydrolaseaktiviteten under enzymatisk hydrolyse af forbehandlet majsstubbe . En foreslået virkningsmåde er, at den gør xylandelen af lignocellulose mere tilgængelig for nedbrydning af xylanaser og dermed indirekte fremmer cellulasernes virkning. Den største revolution i de senere år inden for nedbrydning af cellulose var vel nok opdagelsen af de lytiske polysaccharidmonooxygenaser (LPMO). Disse enzymer introducerede en ny, oxidativ mekanisme for nedbrydning af polysaccharider. Ved nedbrydning af cellulose antages det, at LPMO’er virker på overfladen af krystallinske cellulosefibriller og derved gør dem mere tilgængelige for cellulaser . Det er interessant, at disse enzymer kan få de nødvendige elektroner til denne proces fra lignin i plantecellevæggen via langtrækkende elektronoverførsel og dermed vende plantens forsvarsmekanismer imod det . Alternativt kan GMC oxidoreduktaser eller cellobiose dehydrogenaser fungere som elektrondonorer . Dette fund kunne godt forklare, hvordan T. reesei forsyner sine LPMO’er med brændstof, da det tidligere er blevet vist, at flere sådanne GMC-oxidoreduktaser faktisk induceres af hvedestrå . Denne oxidative mekanisme er imidlertid på ingen måde begrænset til depolymerisering af cellulose. LPMO’er, der oprindeligt blev påvist for chitin , spiller også en rolle i nedbrydningen af xyloglucan og amylose . I CAZy-databasen er enzymer, der tilhører denne gruppe, blevet omklassificeret til “hjælpeaktiviteter” (AA) i modsætning til deres tidligere klassifikation som glykosidhydrolaser (f.eks. GH61) og findes i AA-familierne 9-11 og 13 . Som tidligere skitseret er hemicellulolytiske aktiviteter vigtige for en fuldstændig lignocelluloseforsukning (gennemgået af Harris et al. ). Der kræves forskellige mængder af individuelle aktiviteter afhængigt af de hemicellulosetyper, der er til stede i substratet . Det er derfor bemærkelsesværdigt, at T. reesei’s enzymatiske repertoire har nogle klare begrænsninger for visse typer af hemicellulose-specifikke bindinger. En af disse manglende aktiviteter er α-xylosidase. Tilføjelse af α-xylosidase til en kommerciel T. reesei enzymformulering forbedrede xylose- og glukosefrigivelsen fra forbehandlet majsstørrelse . Tilsvarende forbedrede tilsætning af en GH familie 5 cellulase med aktivitet mod glucomannan og xylan et syntetisk T. reesei enzympræparat betydeligt . Andre aktiviteter, der er fraværende eller meget begrænsede i T. reesei-cellulaseblandingen, omfatter endo-arabinase og flere pektinaseaktiviteter . Supplering af kommercielle cellulaseblandinger med disse enzymaktiviteter forbedrede følgelig forsukreficeringen af forskellige substrater . Et andet spørgsmål, der endnu ikke er besvaret, er den in vivo funktion af de sekreterede laccase-lignende multikobberoxidaser, der er kodet i T. reesei-genomet.

Forbedring af T. reesei som vært for proteinproduktion

I betragtning af, at cellulaserne og størstedelen af de andre lignocellulose nedbrydende enzymer udtrykkes koordineret og betinget, udgør deres transkriptionelle regulering et logisk mål for teknikken til forbedring af svampens cellulaseproduktion. En af hovedregulatorerne er den C2H2-transskriptionsfaktor CRE1, der formidler kulstofkatabolit-repression, som er af C2H2-typen. CRE1 lukker ned for transkriptionen af sine målgener, når der er mere gunstige kulstofkilder som f.eks. glukose til stede. Dens trunkering er en af hovedårsagerne til den forbedrede cellulaseproduktion, der er opnået ved hjælp af tilfældige mutageneseprogrammer af T. reesei QM6a, som fører til stammen RUT-C30, der viser både et højere basalniveau og et højere induceret niveau af cellulaseproduktion . På samme måde reducerer udskiftning af CRE1-bindingsmotiver i promotorområdet for den vigtigste cellobiohydrolase cel7a med motiverne fra en kendt cellulaseaktivator kulstofkatabolit-repression og øger cel7a-transkriptionen under aktiverende og undertrykkende forhold . Desuden afhænger transkriptionen af cellulase, xylanase og en række andre gener, der koder for enzymer, der er involveret i nedbrydning af lignocellulose, strengt af den transkriptionelle aktivator XYR1 af Zn(II)2Cys6-typen . Dette er i modsætning til andre svampe, herunder Sordariomyceterne Neurospora crassa og Fusarium fujikuroi, hvor XYR1-ortologet udelukkende modulerer xylanase-genekspressionen . En mutation, der fører til en afkortet form af XYR1, har vist sig at forårsage den cellulase-negative fænotype hos stamme QM9136, som stammer fra mutageneseprogrammet på Natick . Følgelig har cellulaseover- og -hyperproducerende mutanter forhøjede niveauer af mRNA for de transkriptionelle aktivatorer xyr1 . Det er også blevet påvist, at overekspression af XYR1 fører til en højere ekspression af cellulaser og ophæver deres katabolitrepression i tilstedeværelse af glukose . Desuden fører en punktmutation inden for en formodet regulatorisk region af XYR1 til et tilsvarende dereguleret ekspressionsmønster . Ud over XYR1 og CRE1 regulerer tre transkriptionsfaktorer ACE1, ACE2 og ACE3 ekspressionen af cellulase og xylanase i T. reesei . I lighed med CRE1 er ACE1 en C2H2-zinkfinger-repressor, og dens deletion forbedrer derfor produktionen af både cellulaser og xylanaser . ACE2 og ACE3 er, ligesom XYR1, transkriptionsaktivatorer af Zn(II)2Cys6-typen . Når ace2 er fraværende, reduceres transkriptionen af cellulaser og xylanaser tilsvarende, selv om cellulaseinduktion af sophorose tilsyneladende forbliver upåvirket. Udskillelse af ace3 ophæver fuldstændig cellulasetranskriptionen, men reducerer kun xylanase-transkriptionen. Mens overekspression af ACE2 endnu ikke er blevet forsøgt, fører overekspression af ACE3 til øget aktivitet af begge typer enzymer, ligesom overekspression af seks andre hidtil ukarakteriserede regulatorer . Disse omfatter yderligere to Zn(II)2Cys6-transskriptionsfaktorer af Zn(II)2Cys6-typen samt to WD40-proteiner, et bromodomain-protein og en gcn5-relateret acetyltransferase. Alle tre Zn(II)2Cys6-transkriptionelle aktivatorer (XYR1, ACE2 og ACE3) ligner det velkarakteriserede Gal4-protein fra S. cerevisiae. Det er veletableret, at Gal4 rekrutterer det Gcn5-holdige SAGA-kompleks og derved fremmer transkriptionen af sine målgener gennem histonacetylering og dannelse af euchromatin. Faktisk er Gcn5-ortologet i T. reesei uundværligt for cellulaseekspression og involveret i acetylering af histoner i cbh1-promotoren . I de seneste år er der opstået et billede, der viser, at transkriptionen af cellulaser og beslægtede CAZymer i svampe styres af en kombination af mange transkriptionsfaktorer, der repræsenterer et komplekst transkriptionelt reguleringsnetværk, som påvirkes af modvirkende aktivatorer og repressorer. I Penicillium oxalicum f.eks. modulerer tyve transkriptionsfaktorer aktiveringen eller repressionen af cellulasegener. Blandt disse blev ClrB identificeret som en nøgleintegrator for alle andre regulatorer og deres målgener . Homologer af disse regulatorer findes i T. reesei, men i betragtning af mangfoldigheden af tilpasninger i plantecellevægsreguleringen forventes det, at andre og forskellige regulatorer også vil spille en vigtig rolle. En anden vigtig aktør i cellulasereguleringen er T. reesei-ortologen af den gådefulde Aspergillus LaeA, som er involveret i reguleringen af sekundære metabolitgenklynger i forskellige svampe . Mens deletion af denne formodede proteinmethyltransferase fører til en stærk nedregulering af forskellige cellulase- og andre CAZyme-gener, kan dens overekspression kraftigt fremme deres ekspression . Lignende virkninger blev fundet for det LAE1-interagerende VEL1-protein fra VELVET-komplekset .

De fleste af de ovennævnte undersøgelser giver grundlæggende indsigt i reguleringen af cellulasedannelsen. Da de fleste af disse undersøgelser blev udført enten i det oprindelige T. reesei isolat QM6a eller den moderat overproducerende stamme QM9414, er det fortsat uklart, om og i hvilket omfang disse virkninger kan gennemføres i hyperproducerende stammer. I disse stammer kan processer som oversættelse, sekretion og omsætning af sekreterede enzymer snarere end transkription begrænse en yderligere forøgelse af cellulaseproduktionen. Det vil være interessant at se, om flere af de rapporterede måder at forbedre cellulase-genekspressionen på kan stables, og hvordan sådanne stammer vil klare sig sammenlignet med de hyperproducerende stammer, der er fremkommet ved tilfældig mutagenese.

Den simple forøgelse af transkriptionen af det pågældende gen fører ikke altid til forbedret produktdannelse, især ikke i tilfælde af ikke-svampede proteiner. En vellykket strategi til at omgå lav produktdannelse er fusionsgenmetoden, som ud over promotor- og terminatorregionen af et højt udtrykt gen også anvender det kodede protein som ekspressionsforstærker. For T. reesei er dette cellobiohydrolase, der koder for cel7A, som er det protein, der udtrykkes mest kraftigt under cellulaseinducerende forhold . Det antages, at disse genfusioner generelt øger mRNA-stabiliteten, importen til ER og passagen gennem den sekretoriske vej. Med henblik herpå udnyttes CEL7A’s modulære struktur bestående af et katalytisk modul, en linker og et CBM ofte, hvorved det C-terminale CBM erstattes af det pågældende gen. Der findes nu variationer af denne genfusionsmetode, som målretter proteinet mod ER med henblik på korrekt foldning, disulfidbrodannelse og glykosylering, men som efterfølgende sigter mod intracellulær proteinakkumulering for at undgå nedbrydning af det ønskede produkt af ekstracellulære proteaser. En af disse strategier anvender hydrophobiner med et tilknyttet ER-retentionssignal som bærer. Disse fusionsproteiner samler sig selv til micellignende strukturer og kan oprenses ved hjælp af et overfladeaktive stoffer-baseret vandigt tofasesystem . En anden strategi til at målrette proteiner mod ER’et anvender γ-zeinpeptidet (ZERA), der er afledt af majsoplagringsproteinet. På samme måde danner disse selvsamlende fusionsproteiner proteinlegemer omgivet af ER-membran, som beskytter dem mod proteolyse . Udviklingen af svampe som effektive produktionsværter for pattedyrproteiner kræver også inaktivering af de hyppigt forekommende proteaser i gæringsbouillonen. I en systematisk undersøgelse blev forskellige sekreterede proteaser, der er relateret til nedbrydning af biofarmaceutiske produkter, herunder antistoffer, interferon α 2b og insulinlignende vækstfaktor, identificeret, og flere af dem blev inaktiveret . Dette førte ikke blot til en drastisk reduktion af proteaseaktiviteten, men også til en stærk forøgelse af stabiliteten af alle tre rekombinante proteiner, idet antistoffet viste den mest udprægede effekt. Selv om man tidligere har forsøgt at manipulere N-glykosyleringsmønsteret med henblik på fremstilling af terapeutiske proteiner af høj værdi, synes det ikke muligt at skabe et autentisk humant glykosyleringsmønster i en svampeekspressionsvært på nuværende tidspunkt. Det er derfor tvivlsomt, om sådanne biofarmaceutiske produkter vil blive fremstillet af svampecellefabrikker i fremtiden, især i betragtning af den hurtige udvikling af CHO-celler .

De ovennævnte hydrofobiner er en anden gruppe af proteiner, som har fået stor opmærksomhed på grund af deres overfladeaktive egenskaber . Disse små, ekstracellulære proteiner samler sig selv til proteinlag ved hydrofobiske/hydrofile grænseflader på grund af deres amfifile egenskaber og gør hydrofobiske overflader vådbare eller hydrofile overflader hydrofobiske. De har et bredt potentiale inden for fødevare- og medicinske anvendelser til at dispergere hydrofobiske materialer, stabilisere skum eller målrette forskellige molekyler til overflader . Cerato-plataniner er en anden gruppe af små, sekreterede proteiner med fire bevarede cysteiner. De binder sig til chitin og N-acetylglucosaminoligosaccharider og har selvsamlingsegenskaber ved hydrofobiske/hydrofile grænseflader. I modsætning til hydrofobiner forbedrer cerato-plataniner snarere overfladers polaritets/apolaritetsegenskaber. CBM’er, der findes i forskellige CAZymer, tilskrives også en målrettet funktion. De kan forbedre den hydrolytiske aktivitet af det katalytiske domæne, som de er knyttet til, og føre til et mere gunstigt pH- og temperaturoptimum . Deres kulhydratbindende egenskaber kan desuden udnyttes til affinitetsrensning af fusionsproteiner ved hjælp af f.eks. cellulosekolonner . Den brede vifte af andre anvendelser af rekombinante CBM’er er for nylig blevet gennemgået andetsteds.

Trichoderma reesei til konsolideret bioprocessing og helcellekatalyse

Konsolideret bioprocessing (CBP) forstås klassisk som integrationen af cellulolytisk enzymproduktion, enzymatisk hydrolyse og fermenteringstrin i en celluloseholdig ethanolproduktionsproces i en enkelt enhedsoperation. Det ville derfor være ønskeligt med en enkelt organisme med gode cellulolytiske egenskaber og en effektiv ethanolfermenteringsvej. Ikke desto mindre har brugen af mikrobielle konsortier også fået en vis opmærksomhed . Desværre findes der i øjeblikket ingen enkeltorganisme, der opfylder begge krav (fig. 2). Derfor har man forsøgt at manipulere ethanologer til at blive cellulolytiske eller cellulolytiske organismer til at blive ethanologiske. I forbindelse med det første scenario har T. reesei ofte fungeret som CAZyme-gendonor, især for cel5a og cel7b, der koder for to af dens endoglucanaser, og for dens to cellobiohydrolaser cel6a og cel7a (tabel 1). I alle offentliggjorte undersøgelser har den relativt lave sekretoriske kapacitet hos S. cerevisiae begrænset substratkonverteringen af de sekretede eller membranforankrede heterologe CAZymer. Derfor var det nødvendigt at supplere med kommercielle T. reesei enzymcocktails for at opnå et højt ethanoludbytte med realistiske celluloseholdige substrater. Selv om der nu gøres en indsats for at forbedre sekretions- og overfladebelægningskapaciteten hos manipulerede S. cerevisiae-stammer, har de cellulasefremkaldende stammer, der er til rådighed på nuværende tidspunkt, allerede potentiale til at føre til en væsentlig reduktion af den nødvendige enzymbelastning til forsukretisering af biomasse . I forbindelse med det andet scenario udgør T. reesei selv en lovende målorganisme. Men selv om denne svamp naturligt har evnen til at omsætte alle de biomasserelaterede sukkerarter til ethanol, er udbyttet lavt, og der dannes eddikesyre som et uønsket biprodukt . På den anden side er fermenteringsregimer i stor skala for T. reesei veletablerede på grund af dens brede anvendelse i kommerciel enzymproduktion, og de molekylære værktøjer til dens genteknologi er også meget veludviklede . En af de resterende store udfordringer i forbindelse med anvendelsen af T. reesei som CBP-organisme er, at flere af dens cellulaser og glykolytiske gener undertrykkes af hypoxi , hvilket er nødvendigt for ethanolproduktion. Desuden udgør den transkriptionelle undertrykkelse af cellulaser i tilstedeværelse af ethanol en yderligere udfordring, der skal overvindes. Den cellulasehyperproducerende stamme RUT-C30 har imidlertid en højere ethanoltolerance sammenlignet med stamme QM9414 fra Natick-linjen og udgør derfor en perfekt platformsstamme til udvikling af T. reesei som en CBP-organisme, især fordi den også er kulstofkatabolitafdæmpet . Desuden udviser RUT-C30 i tilstedeværelse af en lignocelluloseholdig papirmasse en pelletagtig morfologi i de tidlige stadier af fermenteringen , som kan opnås på en vækstuafhængig måde ved tilsætning af det overfladeaktive stof Triton X-100 og derefter også fører til en højere enzymproduktion . Dette er vigtigt, fordi dårlig blandbarhed og lav maksimal celletæthed som følge af filamentøs vækst hidtil har hindret brugen af T. reesei som CBP-organisme. Mere generelt kan konsolideret bioprocessing også bruges til at beskrive andre integrerede processer, hvor substratet ikke nødvendigvis er lignocellulosebiomasse, men en anden biopolymer som f.eks. chitin eller stivelse, og hvor produktet ikke er ethanol, men en hvilken som helst anden metabolit . Med henblik herpå er der for nylig gennemført en række undersøgelser med henblik på at overproducere forskellige metabolitter ved hjælp af teknik af T. reesei (tabel 2). De udbytter, der kunne opnås, var dog i de fleste tilfælde langt fra kommercialisering og krævede derfor yderligere optimering.

Værktøjer til celledesign og -teknik

Mens to omfattende oversigter over den molekylære værktøjskasse for T. reesei og andre Trichoderma-arter først er blevet givet for nylig , ønsker vi at opdatere disse med de seneste fremskridt på området. Målrettet stammeudvikling med henblik på forbedret cellulaseproduktion eller til metabolisk udvikling kræver effektive metoder til at indføre målrettede genetiske ændringer i organismen. Den generelt lave effektivitet af gene targeting har i lang tid været en stor udfordring for at opnå et rimeligt antal transformanter ved homolog integration af en deletions- eller ekspressionskassette. Dette problem er hovedsagelig blevet løst ved at inaktivere komponenter i den ikke-homologe end joining (NHEJ)-vej for DNA-reparation som f.eks. tku70 eller tmus53 . Tku70-deletionerede stammer viser forbedret genmålretning, selv om effektiviteten af homolog integration i disse stammer stadig kan variere afhængigt af det målrettede locus og således kan falde til 30 % . På grundlag af denne forbedring blev der udviklet en række nye metoder til at indsætte ekspressionskassetter i en defineret genomisk region, hvorved man undgår plejotropiske virkninger forårsaget af tilfældig integration. Ved hjælp af en tku70-baggrund har Jorgensen et al. udviklet en ekspressionsplatform, der anvender det let screenbare ade2-lokus som det foretrukne integrationssted. Ved integration af ekspressionskassetten i dette locus ødelægges ade2, og de resulterende transformanter udvikler en tydelig rød pigmentering. I en anden undersøgelse blev pyr4- og asl1-loci valgt for at udvikle en stamme med uridin- og l-argininin-auxotrofi, der muliggør stedbestemt integration på disse steder. Ouaedraogo et al. fulgte en anden strategi og udtrykte S. cerevisiae I-SceI meganuclease i T. reesei. I-SceI genererer kunstige dobbeltstrengsbrud på et I-SceI-genkendelsessted, som på forhånd blev introduceret på et foruddefineret locus, og forbedrede både transformations- og homolog integrationseffektiviteten. I en opfølgende undersøgelse blev I-SceI-formidlede dobbeltstrengsbrud kombineret med en tku70-deletion . Her favoriserer den manglende evne til at reparere dobbeltstrengsbrud via NHEJ integration af kassetten, hvilket fører til homologe rekombinationseffektiviteter på op til 100 %. En revolution inden for genteknologi eller genomredigering blev indført med CRISPR-systemet (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9-systemet . Dette system, der både understreger behovet for en sådan teknologi og den stigende betydning som enzymproducent, blev først afprøvet til filamentøse svampe i T. reesei . Det indfører specifikke DNA-dobbeltstrengsbrud for at stimulere genmålretning og er kun afhængig af en Cas9-nuklease (CRISPR-associeret), som bruger et enkelt chimært guide-RNA til målretning. Den nøjagtige målretning af dette RNA-vejledte Cas9 til en specifik DNA-sekvens opnås ved hjælp af protospacer-sekvensen i det vejledende RNA via simpel baseparring. Ved at anvende 200 bp op- og nedstrøms flankerende regioner til gen-deletionskonstruktionen kunne der opnås HR-frekvenser på over 90 %. Dobbeltdeletioner og tredobbeltdeletioner opstod med en hyppighed på henholdsvis 45 % og 4 % efter en enkelt transformationsrunde. Mens in vitro transskriberede guide RNA’er i denne undersøgelse blev cotransformeret med deletionskassetten i en Cas9-eksprimerende T. reesei, brugte Nødvig et al. to flankerende ribozymsekvenser til at frigøre guide RNA’er fra et større transkript, der også koder for Cas9-enzymet i forskellige Aspergilli. Et andet vigtigt værktøj, der er nødvendigt for både rekombinant proteinekspression og stammeudvikling, er promotorer, der muliggør genekspression på en kontrollerbar måde. Selv om der findes en række inducerbare og repressible promotorer med de forskellige cellulasepromotorregioner, har de normalt ulemper, da deres ekspression er knyttet til værtsmetabolismen, og aktivatorer kan være begrænsende på grund af promotorens titreringseffekter. Nyttige alternativer omfatter et sæt l-methionin-repressible T. reesei-gener med forskellig basal ekspressionsstyrke . Det blev vist, at en af disse promotorer kan drive undertrykkelig ekspression af forskellige reportergener på flere kulstofkilder, herunder hvedestrå. I en lignende undersøgelse blev promotoren af et kobberpermease-gen fra T. reesei anvendt til at kontrollere ekspressionen af den vigtigste cellulase- og hemicellulase-regulator xyr1 i fravær af kobber . I betragtning af, at kobberholdige enzymer fra AA-familie 9 er vigtige komponenter i T. reesei cellulasemixet , er det dog tvivlsomt, om dette system kan anvendes i et cellulaseproduktionsscenarie.

Suden disse spændende molekylære værktøjer er der nu også nogle ældre tricks fra den klassiske genetik til rådighed. Stammeudvikling af T. reesei blev i lang tid hæmmet af, at man troede, at svampen var aseksuel, hvilket forhindrede stamme-krydsning. En milepæl i denne henseende var opdagelsen af, at QM6a har et MAT1-2 parringstypelokus og let kan krydses med visse MAT1-1 T. reesei-isolater af vild type . Men da QM6a’s MAT1-2 locus blev erstattet af dets MAT1-1 modstykke, blev der ikke dannet stromata ved konfrontation med den oprindelige MAT1-2 QM6a stamme. Det var derfor umuligt at udnytte parring til stammeudvikling i de forskellige akademiske og industrielle T. reesei-stammer, der stammer fra QM6a. Ved hjælp af en systembiologisk tilgang blev det manglende gen, der er ansvarlig for kvindelig sterilitet, identificeret som ham5 . I N. crassa koder ham-5 for et protein, der tjener som et MAP-kinase-stillads under cellefusionen . Genindførelse af et funktionelt ham5 genopretter stromata-dannelsen i stamme QM6a og gør det muligt at genoprette kvindelig frugtbarhed i andre stammer, der stammer fra QM6a-baggrunde . Dette fund er især vigtigt, fordi krydsning med de førnævnte H. jecorina-isolater kan føre til segmentalt aneuploide afkom . Med dette værktøj i hånden er grundlaget for at identificere relevante mutationer, der f.eks. fører til cellulasehyperproduktion, lagt. Dette er vigtigt, da traditionelle komplementationsmetoder til at identificere gen(er), der forårsager mutantfænotyper, stort set ikke har haft succes hos arter som T. reesei. Og selv om sekventering med høj kapacitet og sammenlignende genomanalyse let kan identificere mutationer i QM6a-stammen af cellulasehyper- og -nulproducenter, har dette kun i få tilfælde ført til en sammenkædning af en mutation med en bestemt fænotype. Men i de tilfælde, hvor der blev fundet et stort antal mutationer, eller hvor mutationerne påvirkede gener med ukendt funktion, afslørede den sammenlignende sekvensanalyse ikke arten af de ønskede målgener . Flere forskere har derfor med succes anvendt bulk segregantanalyse i kombination med næste generations sekventering til at identificere relevante mutationer. Ved denne metode krydses mutanten med en referencestamme, og genomisk DNA fra de segreganter, der viser den ønskede fænotype, samles og sekventeres. Ved at sammenligne genomet af denne pulje af sekventeret DNA med genomet af forældrestammerne kan man så afsløre konserverede mutationer, der er relevante for fænotypen. Mutationer, der ikke er relateret til fænotypen, vil være underrepræsenteret. Selv om det ikke kan forventes, at denne fremgangsmåde vil føre til identifikation af en enkelt mutation, fordi mutationer tæt på den relevante mutation sædvanligvis er sam-segregeret, reduceres antallet af mål for yderligere undersøgelser betydeligt.