Alai

Den vacuolære ATPase (V-ATPase) er en multi-subunit ATP-drevet protonpumpe, der forsyrer intracellulære vesikler og ekstracellulære miljøer og dermed er involveret i en lang række biologiske funktioner. Tidligere oversigter har på elegant vis beskrevet strukturen og funktionen af V-ATPase . Her gennemgår vi den seneste litteratur vedrørende V-ATPase-funktion og bidrag til forskellige celleprocesser i normal fysiologi med vægt på kræft. Vi præsenterer også i detaljer reguleringen af Notch og andre signalveje af V-ATPase, der afslører en hidtil mindre kendt funktion af V-ATPase i cellesignalering.

Underenhedsisoformer

Strukturelt er V-ATPase en roterende nanomotor, der består af flere underenheder, hver med flere isoformer. Underenhederne er arrangeret i to domæner: et perifert V1-domæne, der er ansvarlig for ATP-hydrolyse, og et integralt membrandomæne VO, der fungerer i protonetranslokation. Strukturen af V-ATPase er meget velbevaret blandt alle eukaryote celler og er involveret i forskellige funktioner på tværs af arter. Hos pattedyr har V1-domænet otte forskellige underenheder (A, B, C, D, E, F, G og H), mens VO-domænet består af seks forskellige underenheder (a, c, c’, c’, c”, d, e) . De forskellige krav til forsuring i intracellulære vesikler og det ekstracellulære miljø er afgørende for V-ATPase-funktion og -regulering. For at mindske eller øge pumpens effektivitet kontrollerer V-ATPase koblingen mellem ATP-hydrolyse og protonpumpning. Denne proces sker ved hjælp af V-ATPasens “a”-underenhed . På samme måde er V-ATPase’s celle- og rumspecifikke målretning også afhængig af isoformerne af a-underenheden. VOa er et 100 kDa integreret membranprotein med en N-terminal cytosolisk hale og 9 transmembrandomæner. Der er identificeret fire isoformer af a-underenheden (a1, a2, a3 og a4) med forskellig vesikulær fordeling og celletypefordeling. VOa1 udtrykkes på synaptiske vesikler, og VOa2 udtrykkes på intracellulære vesikler som golgi- og tidlige endosomer. VOa3 udtrykkes på plasmamembranen i osteoklaster, mens VOa4 udtrykkes på plasmamembranen i de interkalerede celler i nyrerne. Endvidere er N-terminus af underenhed “a” et vigtigt motiv, der binder V1-domænet til membranen, og det er også blevet rapporteret, at det er en unik pH-sensor i lysosomer . Ekspressionen og isoformlokaliseringen af underenhed ‘a’ er afgørende for V-ATPasens funktion.

Fysiologisk funktion af V-ATPase

V-ATPase er ubiquitært udtrykt og udfører forskellige biologiske funktioner i celler i de fleste væv gennem vesikulær, luminal og ekstracellulær forsuring . For at opnå adskillige cellulære funktioner letter V-ATPase den lokaliserede koncentration af protoner i sure vesikler i de endocytiske og exocytiske veje.

Vesikulær forsuring

Endosomer og lysosomer

V-ATPase er bedst kendt for sin rolle i forsuring af intracellulære vesikler som endosomer og lysosomer. På overfladen af endosomer forsyrer V-ATPase og modulerer derved vigtige cellulære processer som receptorendocytose og vesikulær trafficking . V-ATPase’s forsuring af endosomer er afgørende for endocytisk internalisering af receptor-ligandkomplekser. Efter at signalering er indledt, frigør den lavere pH-værdi i endosomerne liganden, som genanvendes til plasmamembranen . I lysosomer er V-ATPaser med til at opretholde den lave pH-værdi på 4,5 og er også vigtige for transporten af nysyntetiserede syrehydrolaser fra Golgi til lysosomer. Endvidere er phagosomer og autofagosomer i henholdsvis makrofager og tumorceller også afhængige af den sure pH, der opretholdes af V-ATPase for aktiviteten af de nedbrydende enzymer i disse kompartmenter .

Golgi

Sorteringen af det exocytiske og endocytiske maskineri begynder i Golgi-komplekset. Det er vigtigt, at de fleste proteiner gennemgår glykosylering, en afgørende posttranslationel modifikation i golgi-apparatet . Mutationer i a2-underenheden af V-ATPase resulterer i cutis laxa, et autosomalt recessivt rynket hudsyndrom, hvor der observeres nedsat glykosylering af ekstracellulære matrixproteiner . Selv om V-ATPase er blevet genetisk korreleret med glykosyleringsdefekt, er det nøjagtige forhold mellem golgiforsuring og proteinmodning ikke blevet undersøgt.

Specialiserede vesikler

V-ATPase er et vigtigt protein, der udtrykkes i specialiserede rum i specifikke celletyper. Under neurotransmission leverer V-ATPase den afgørende protonmotivationskraft, der er nødvendig for dannelsen af synaptiske vesikler og efterfølgende akkumulering af neurotransmittere . I bugspytkirtelceller er V-ATPase-afhængig forsuring vigtig for insulinekocytose . V-ATPase styrer også fission-fusionsbalancen i vesikulære systemer ved at interagere med Soluble NSF Attachment protein Receptor (SNARE) og GTPase .

Luminal forsuring

V-ATPaser blev oprindeligt identificeret på intracellulære vesikler, men betydningen af V-ATPaser på plasmamembranen er vokset enormt . I epitelcellerne i den proximale tubulus i nyren opretholder V-ATPasens a4-isoform den sure basebalance og forsuring af urinen (systemisk acidose) . På samme måde syrer V-ATPase i de klare celler i epididymis plasmamembranen det luminale rum og bidrager til modning og lagring af sædceller . I osteoklaster i knoglerne translokaliseres lysosomal V-ATPase til plasmamembranen under knogleresorptionen for at forsure lakunerne . Plasmalemmal V-ATPase er afgørende for driften af øreets interdentalceller, næseepitelceller og synet . V-ATPase-dysfunktion er forbundet med patologiske tilstande som f.eks. renal tubulær acidose, døvhed, nedsat lugtesans og osteoporose En skematisk oversigt over V-ATPasens rolle i vesikulær og luminal forsuring er vist i fig. 1.

Rolle i kræftformer

Nu er plasmamembranens V-ATPase blevet udførligt undersøgt i kræft, hvor de er med til at opretholde et alkalisk intracellulært miljø, der er gunstigt for vækst, og et surt ekstracellulært miljø, der er gunstigt for invasion . I tumorer har V-ATPase-ekspression vist sig at være højere mod den forreste kant af prolifererende kræftceller af bryst-, prostata-, lunge-, ovarie-, lever-, bugspytkirtel-, melanom- og esophagealcancer . Specielt brystkræftceller udtrykker V-ATPase på plasmamembranen for at forsure det ekstracellulære rum, og den kvantitative ekspression af V-ATPase korrelerer med cellecellelinjens invasivitet og metastatiske potentiale . Det nøjagtige bidrag fra V-ATPase til den voksende tumor opnås gennem dens indflydelse på de molekylære mekanismer/veje, der diskuteres nedenfor.

Immunmodulation

Den a2 isoform af Vacuolar ATPase (VOa2 eller a2V) har en immunmodulerende rolle i graviditet og kræft. Undersøgelser, der involverer a2V i reproduktionsbiologi, har afdækket en hidtil ukendt rolle for dette molekyle i normal modning og produktion af sædceller ud over embryonimplantation . I tumormikromiljøet polariserer det N-terminale domæne af a2V makrofager til tumorassocierede makrofager (M2-typen) og stimulerer forskellige monocytundergrupper gennem endocytosevejen . Efter disse resultater blev det yderligere påvist, at a2V-mangel i tumorceller ændrer den residente makrofagpopulation i tumormikromiljøet og påvirker tumorvæksten in vivo . a2V udtrykkes på neutrofilernes primære granula og bidrager til at opretholde pH-værdien i den exocytiske vej under neutrofilaktivering . Behandling af humane neutrofiler med rekombinant N-terminalt peptid af a2V (a2NTD) fremmer neutrofil migration og polarisering . Tilsammen fremhæver disse undersøgelser den immunmodulerende rolle af V-ATPase i fremkaldelse af potente immunresponser.

Warburg-effekt

Et kendetegn for kræft er Warburg-effekten, hvor celler skifter fra oxidativ fosforylering til aerob glykolyse . Flere undersøgelser peger på den hypotese, at kræftceller er mere afhængige af V-ATPase end af andre pH-regulatorer som Na+H+-vekslere, bikarbonattransportører og proton-laktat-symportere for at opnå en gunstig alkalisk intracellulær pH og en sur ekstracellulær pH . Alkalisering af cytosol aktiverer glykolysen, mens oxidativ fosforylering undertrykkes . Endvidere reguleres nogle glykolyserelaterede onkogener som Hypoxia Induced Factor (HIF-1) af pH-ændring induceret af V-ATPase .

Syre proteaser

Følger af ekstracellulær forsuring i tumorer er aktivering af syreproteinaser, som er enzymer, der spalter den ekstracellulære matrix under tumorinvasion. Disse enzymer tilhører klassen af syreproteinaser som kathepsiner , Matrix Metallo Proteinaser (MMP) og gelatinaser og er aktive ved sur pH . Desuden øges aktiviteten af intracellulære enzymer som γ-sekretase, der er aktive ved sur pH, også med øget aktivitet af V-ATPase i vesikler . Efterfølgende fører dette til dysregulering af onkogene veje som Notch.

Medicinresistens og V-ATPase-hæmmere

Forandret pH-værdi i tumormikromiljøet kan påvirke følsomheden over for kemoterapeutiske lægemidler . Anthracykliner og alkaloider har en pKa på 7 til 8 og internaliseres til det endosomale rum . Nylige data tyder på, at brugen af V-ATPase-hæmmere ikke kun forårsager cytosoliske pH-ændringer, der fører til celledød, men også forbedrer optagelsen af lægemidler, hvorved de bliver en effektiv komponent i kombinationsbehandling af kræft . I kræft i æggestokke udtrykkes a2V på den forreste kant af kræftceller og modulerer aktiviteten af MMP9. Endvidere bidrager a2V til cisplatinmedieret lægemiddelresistens i ovariecancer, og selektiv hæmning af a2V kunne tjene som en effektiv strategi til behandling af kemoresistent ovariecancer . V-ATPase-hæmmerne bafilomycin og concanamycin tilhører en klasse af pleomakrolider, der er rettet mod VO-sektoren og effektivt hæmmer V-ATPase-aktiviteten. For nylig er apicularen og archazolider blevet rapporteret som værende potente og specifikke inhibitorer af V-ATPase . Alle tilgængelige små molekylære inhibitorer har imidlertid en betydelig toksicitet i betragtning af V-ATPasens rolle i den normale cellefysiologi . Derfor kunne udvikling af specifikke neutraliserende antistoffer mod isoformen af a-underenheden, som har cellespecifik ekspression, være et effektivt alternativ til direkte hæmning af V-ATPase og samtidig indirekte bekæmpelse af multiresistens over for flere lægemidler ved hjælp af kombinatorisk brug .

Autofagi

Autofagi er en proces med selektiv nedbrydning eller genanvendelse af gods, der leveres af autofagosomer til lysosomer . Tumorceller viser varierende afhængighed af autofagi, efterhånden som de udvikler sig fra primær tumor til den højmetastatiske solide tumor . Cellulær last, der er markeret til nedbrydning, leveres til lysosomerne ved hjælp af autofagiske processer. V-ATPase’s protonpumpningsaktivitet er ansvarlig for aktivering af lysosomale syrehydrolaser, som nedbryder den fragt, der optages fra autofagosomer . Selv om undersøgelser peger på, at autofagi kræver funktionel V-ATPase, og V-ATPase-inhibitoren Bafilomycin anvendes som en klassisk inhibitor af autofagi, er V-ATPase’s nøjagtige rolle i membrandynamikken i autofagisk flux ikke kendt. I en nylig undersøgelse blev det rapporteret, at behandling med Bafilomycin, som hæmmer aktiviteten af både V-ATPase og Ca2+-pumpen SERCA-pumpen, førte til blokering af autofagisk flux, mens lysosomer med V-ATPase-mangel stadig var i stand til at fusionere med autofagosomer . Disse resultater tyder på, at V_ATPase er involveret i nedbrydning af autofagisk last i lysosomer end i autofagisk flux og fremhæver behovet for at udvikle specifikke inhibitorer og genmanipulationsteknikker for at undersøge den nøjagtige rolle af V-ATPase i forskellige vigtige celleprocesser.

Signalering

Den endolysosomale vej er vigtig for både positiv og negativ regulering af signalveje . Den første kendte rapport om inddragelse af V-ATPase i signalering kom fra en undersøgelse, der viste, at hæmning af V-ATPase med Bafilomycin påvirkede internalisering af EGFR . Siden da er V-ATPase blevet forbundet med signaltransduktion i forbindelse med m-TOR (mammalian Target Of Rapamycin), Wnt, TGF-β og Notch-signalregulering.

Notch-signalering

Den måske mest velundersøgte signalvej, der reguleres af V-ATPase, er Notch. Dette kan tilskrives det faktum, at Notch-signalering afhænger af den endolysosomale vej for dens aktivering, vedligeholdelse og nedbrydning af centrale vejmediatorer . V-ATPase opretholder den cellulære pH-balance og spiller en vigtig rolle i endocytose, proteaseaktivering og proteinnedbrydning. Specielt a2V (V-ATPase-underenhed VOa2) er tidligere blevet lokaliseret til tidlige endosomer – stedet for receptorendocytose . Efter ligandbinding tager Notch-receptoren den endocytiske vej og spaltes af proteaser med henblik på aktivering. Senere nedbrydes receptorerne i lysosomet . I Drososphila medfører mutationer i Vps25, en komponent i ESCRT-maskineriet, der regulerer endosomal sortering af signalreceptorer, en ophobning af Notch-receptoren i endosomer og øger Notch-signaleringen . I en undersøgelse, der analyserer drosophila-mutationer af Hrs, en anden komponent af ESCRT, akkumuleres Notch i endosomer, men forårsager ikke ektopisk aktivering af Notch-signalering . Tab af autofagi fører til aktivering af Notch-signalering i Drosophila ovariefollikelcellerne på grund af forstyrrelse af Notch-nedbrydning . I modsætning til disse rapporter fandt en uafhængig undersøgelse, at mutationer i Rabconnection-3 forstyrrer protonpumpningsaktiviteten af V-ATPase og akkumulerer Notch i sene endosomer efter S2-spaltning og reducerer dermed Notch-signalering i Drosophila og pattedyrceller . Disse resultater blev fulgt op af rapporter i Drosophila, der yderligere antyder, at V-ATPase gennem forsuring af den endolysosomale vej er nødvendig for aktivering af Notch i endosomer såvel som for nedbrydning af Notch i lysosomer . Under pattedyrs udvikling reducerede ekspression af en dominerende negativ underenhed af V-ATPase i neurale forstadier Notch-signalering og udtømte neurale stamceller, hvilket førte til neuronal differentiering . For nylig blev det i undersøgelser af astrocytter i nethinden hos Nuc1-muterede rotter påvist, at de dysregulerer Notch-signalering. Reduktionen i Notch-signalering skyldtes muteret βA3/A1-crystallin, som regulerer V-ATPase-aktiviteten, hvilket resulterer i nedsat endosomal forsuring og γ-sekretaseaktivitet og dermed påvirker hastigheden af Notch-receptorbehandling . Dette er et interessant resultat i betragtning af, at V-ATPase’s rolle i synet nu er ved at blive kendt . Tilsammen tyder disse resultater på, at reguleringen af Notch-signalering ved V-ATPase kan have både positive og negative resultater afhængigt af den påvirkede cellulære lokalisering af V-ATPase-aktiviteten (endosomer vs. lysosomer) og afhængigheden af Notch-receptorbehandling af den endosomale vej . Selv om V-ATPase- og Notch-crosstalk er blevet undersøgt i forbindelse med V-ATPase-afhængig endolysosomal forsuring, der påvirker Notch-signalering, tyder en nyere rapport på, at reguleringen også kan være omvendt. Specifikt foreslår forfatterne, at Presinilin1 (PS1), en komponent af γ-sekretase-enzymkomplekset, der er ansvarlig for spaltning af Notch-receptor og β-amyloidpeptid, fysisk interagerer med VOa1-isoformen af V-ATPase og målretter den fra det endoplasmatiske reticulum til lysosomerne . Vores undersøgelser har identificeret, at V-ATPase regulerer Notch-signalering i brystkræft og brystkirteludvikling . a2V udtrykkes på overfladen af prolifererende brystepitelceller og Triple Negative Breast Cancer (TNBC) celler, hvilket indikerer dens rolle i celleproliferation under normal udvikling og sygdom. I TNBC forbedrer a2V-hæmning Notch-signalering ved at blokere lysosomal og autofagisk nedbrydning af Notch-receptor . Tab af a2V i musemammekirtler fører til unormal Notch-aktivering og forringer duktal morfogenese, hvilket forårsager laktation defekter . Notch-signalering aktiveres under for tidlig fødsel induceret af infektion med PGN + poly (I:C), hvilket resulterer i opregulering af proinflammatoriske reaktioner, og dens hæmning forbedrer in-utero-overlevelsen af levende fostre. Endvidere blev der ved for tidlig fødsel forårsaget af inflammatorisk respons på LPS-injektion observeret opregulering af Notch-relateret inflammation og nedregulering af angiogenesefaktorer . I både infektions- og inflammatoriske præterm fødselsmodeller var vi i stand til at redde fænotypen ved at behandle med γ-sekretasehæmmere (GSI) . Dette baner vejen for en vigtig fremtidig retning, især da GSI er en effektiv inhibitor af Notch-signalering og i øjeblikket er i kliniske forsøg for flere kræftformer. Dermed viser det sig, at V-ATPase- og Notch-crosstalk er vigtig under normal udvikling og ved sygdomme som Alzheimers og forskellige kræftformer.

Wnt-signalering

Den Wnt-signalvej spiller en vigtig rolle i celle- og vævsvedligeholdelse, polaritet og differentiering. Hos mennesker er dysregulering af Wnt-signalering blevet impliceret i kræft . Et klassisk eksempel på dysreguleret Wnt-signalering er kolorektal cancer, hvor tabet af Adenomatous Polyposis Coli (APC), en negativ regulator af Wnt-signalering, udløser tumorigenese . Under signaleringen virker Wnt-ligander på målcellerne ved at binde sig til Frizzed, Fz og LRP (low density-lipoprotein), et receptorkompleks på celleoverfladen, hvilket fører til adskillelse af Glycogen Synthase Kinas (GSK-3) og efterfølgende frigivelse af β-catenin. β-catenin er den vigtigste downstream mediator for Wnt-banen, som aktiverede Wnt-mål onkogene gener som f.eks. c myc og cyclinD1 . (P) RR, Pro Renin Receptor, også kaldet ATP6ap2, fungerer som et adaptormolekyle mellem V-ATPase og Wnt-receptorkomplekset LRP 5/6 . I Xenopus og Drosophila er det blevet vist, at V-ATPase interagerer med LRP 5/6-receptorkomplekset, og både genetisk knockdown og farmakologisk hæmning af V-ATPase forstyrrer signaltransduktionen og reducerer det cellulære respons på Wnt-signalering betydeligt . Endvidere er det påvist, at V-ATPase indirekte regulerer Wnt-signalmediatoren β-catenin og Notch-mediatoren NICD gennem autofagi.

TGF-β-signalering

Mutationer i a2V-genet forårsager Autosomal recessivt Cutis Laxa (ACL) syndrom, hvor patienterne har en nedsat mængde ekstracellulære matrixproteiner som kollagen, hvilket resulterer i en rynket hudfænotype. En mekanistisk undersøgelse af de mutationer, der er ansvarlige for cutis laxa hos mennesker, har understøttet disse resultater og identificeret a2P405L-mutationen som værende ustabil og defekt i golgi-trafikken sammenlignet med vildtypen . Endvidere peger rapporter på en glykosyleringsdefekt i ACL, der resulterer i forhøjet fremmer signalering af transformerende vækstfaktor-beta (TGF-β) hos disse patienter med a2V-mutationer . V-ATPase fremmer TGF-β induceret epithelial-mesenchymal overgang af rotte proximale tubulære epithelceller . Ud over sin virkning på Notch-signalering aktiverede a2V-hæmning Wnt-banen i TNBC og TGF-β-banen i mammarieepitelceller . Dette tyder på, at a2V’s rolle i modulering af signalformidlere ikke udelukkende er begrænset til Notch. Endvidere viste disse mus også en reduktion af total kollagen på grund af forringet glykosylering .

mTOR-signalering

I mTOR-signalering, Serin threonin kinase mTOR og andre komponenter af mTOR-komplekset 1 (mTORC1) føler aminosyretilgængelighed cellulær stress og modulerer vækst .Ved aminosyrestimulering aktiverer V-ATPase Guanine Exchange Factor (GEF)-aktivitet af Ragulator over for RagA, som igen fremmer RagC GTP-hydrolyse af RagC . Den GTP-bundne RagA og den GDP-belastede RagC rekrutterer sammen mTORC1 til den lysosomale overflade . Aktiveret mTORC1 reagerer på vækstfaktorsignalering og styrer det regulatoriske skift fra celledød til proliferation . En nylig rapport foreslog, at osteoklastprotonpumpe-regulator Atp6v1c1 er involveret i at øge brystkræftvækst ved at aktivere mTORC1-vejen og knoglemetastase ved at øge V-ATPase-aktiviteten .