Spectroscopic Methods
Absorbance Spectroscopy. For nogle enzymassays er det muligt at måle reaktanten eller produktet direkte på grundlag af dets absorbansegenskaber Fersht (1999). I den reaktion, der katalyseres af glukose-6-fosfatdehydrogenase (EC 1.1.1.1.49), absorberer et produkt (NADH) lys ved 340 nm, hvilket gør det muligt at overvåge reaktionen ved at følge stigningen i absorbansen ved denne bølgelængde.
Glukose-6-fosfat + NAD+ → 6-fosfogluconat + NADH + H+
I andre tilfælde måles en reaktant eller et produkt indirekte. Med acetylcholinesterase (EC 3.1.1.1.7) anvendes f.eks. acetylthiocholin som et substrat, der frigør thiocholin ved eksponering for enzymet. Thiocholinen reagerer med Ellmans reagens og giver et farvet produkt, hvilket gør det muligt at overvåge reaktionen ved at følge stigningen i absorbansen.
Acetylthiocholin + H2O → acetat + H+ + thiocholin
Thiocholin + Ellmans reagens → farvet derivat
Koblede assays anvendes undertiden til at overvåge enzymaktiviteten. I dette tilfælde er den enzymatiske reaktion af interesse parret med en anden reaktion, der er koblet til en praktisk måling. Et eksempel herpå er assayet for hexokinase (EC 2.7.1.1.1). I dette tilfælde indgår et overskud af glukose-6-fosfatdehydrogenase og NAD+ i assayblandingen, og absorbansen ved 340 nm overvåges.
Reaktion I: Glukose + ATP → glukose-6-fosfat + ADP
Reaktion II: Glukose-6-fosfat + NAD+ → 6-fosfogluconat + NADH + H+
I dette eksempel skal reaktion I være hastighedsbegrænsende, og koncentrationen af glukose-6-fosfat skal nå en stabil tilstand efter en forsinkelsesperiode. Cleland Cleland (1979) formulerede en procedure til at sikre, at det koblede assay giver en nøjagtig måling af enzymets reaktionshastighed. Hvis det er muligt, er det at foretrække at overvåge en reaktion kontinuerligt. Med de ovenfor beskrevne assays kan spektrofotometeret programmeres til at give en kontinuerlig aflæsning som en funktion af tiden. Ved separationsteknikker, som kan omfatte anvendelse af radioaktivitet, elektroforese eller kromatografi, anvendes diskontinuerlige eller endepunktsanalyser. Når der er fastlagt en lineær tidsperiode for en analyse, måles en parameter på et enkelt tidspunkt inden for den lineære tidsperiode (fortrinsvis et tidspunkt nær midten af den lineære fase). Hastigheden bestemmes derefter ud fra forskellen i signalet på dette tidspunkt og på tidspunktet for reaktionens start. Der skal udvises forsigtighed med slutpunktsanalyser, og tidsforløbene skal kontrolleres for at bekræfte lineariteten. Ændringer i inkubationsbetingelserne, f.eks. temperatur, pH-værdi eller substratkoncentration, kan ændre lineariteten af et assay. Ved rutinemæssige enzymassays indeholder reaktionsbeholderen alle komponenter undtagen én, og reaktionen startes ved at tilsætte den manglende komponent (enzymet eller et af substraterne). De øvrige komponenter skal være afbalanceret med hensyn til pH, temperatur og ionstyrke. Reaktionen indledes normalt ved tilsætning af en lille mængde af en koncentreret stamopløsning af den manglende komponent. En lille mængde sikrer, at denne tilsætning ikke forstyrrer de allerede etablerede ligevægtsforhold. Når det ikke er muligt at tilsætte en lille komponent, skal de adskilte komponenter være ved samme temperatur, ionstyrke og p H. Selv om de to komponenter skal blandes fuldstændigt, bør kraftig omrystning undgås, da det kan denaturere enzymproteinet. Blandingen kan opnås ved at vende et rør med en fastgjort prop eller en kuvette med en Parafilmforsegling. Fortyndede proteiner er ofte mindre stabile end mere koncentrerede proteiner, og analyser udføres ofte i tilstedeværelse af et inert protein, f.eks. bovin serumalbumin (0,25 mg/ml), for at stabilisere det rensede enzym. Der bør udføres forsøg for at sikre, at proteinet er inert. Da albumin f.eks. kan binde sig til hydrofobiske substrater, er det måske ikke altid hensigtsmæssigt til dette formål. Til diskontinuerlige assays kan timeren indstilles, og prøverne kan aspireres med bestemte tidsintervaller efter blanding. I de fleste spektrofotometre startes detektionen manuelt ved hjælp af et instrumentpanel eller et computertastatur. For at tilsætte en komponent til en kuvette kræves der ca. 20 sekunder til at placere kuvetten i et spektrofotometer og til at starte detektionen ved at trykke på en computertast. Denne tid er normalt ikke af stor betydning, da assayet for de fleste reaktioner kører mellem 10 og 30 minutter. Kontrolmålinger omfatter en blindprøve uden enzymindhold og en blindprøve uden substratindhold. Sådanne kontroller sikrer, at der ikke forekommer utilsigtede reaktioner. Kontrolhastigheden (den ikke-enzymfri blindprøve) trækkes fra den dato, der genereres af eksperimentet, for at få den faktiske hastighed af den enzymatiske reaktion. Ved mange assays er det nødvendigt at slukke eller stoppe reaktionen på et bestemt tidspunkt for at forhindre yderligere produktion af produkt. Der kan f.eks. udtages prøver med 5 minutters mellemrum i et forudbestemt tidsrum, og produktet måles ved HPLC.
Den enkelte kromatografiske analyse kan tage 30 minutter. Metoderne til at afslutte reaktionen omfatter normalt denaturering af enzymet ved tilsætning af syre eller nedsænkning i et kogende vandbad. Aktiviteten af nogle metalloenzymer kan slukkes med EDTA eller en anden metalionchelator. De fleste enzymassays er baseret på spektroskopiske teknikker, hvoraf de to mest almindeligt anvendte er absorption og fluorescens Fersht (1999). Den bølgelængde, der anvendes til at følge reaktionshastigheden, bør være den bølgelængde, der giver den største forskel i absorption mellem substratet og produktet. Absorptionsmålinger udføres med et standardspektrofotometer med prøverne i specialiserede celler eller kuvetter. Der findes i handelen engangskuvetter af plast, som kan indeholde 1 eller 3 ml prøver. Deres anvendelse er begrænset til det synlige bølgelængdeområde (350-800 nm). Ved målinger ved bølgelængder under 350 nm skal der anvendes kvartskuvetter (glas og plast absorberer lys i UV-området). Vejlængden for kuvetterne oplyses af producenten. De gængse vejlængder er 1,00 cm, 0,40 cm og 0,20 cm. Et stigende antal assays udføres med 96 brønde mikrotiterplader med plast- eller kvartsbund. Koncentrationen af et stof, der absorberer lys ved bestemte bølgelængder, kan bestemmes ud fra Beers lov:
A = εcl,
hvor A er prøvens absorbans ved en bestemt bølgelængde, c er prøvens koncentration, l er vejlængden, og ε er extinktionskoefficienten eller den molære absorptivitet. ε har enhederne M-1 cm-1 eller mM-1 cm-1. Hvis værdien af ε er kendt for et bestemt stof, er det muligt at beregne koncentrationen af dette stof i en opløsning ved at måle dets absorption i denne opløsning. Ved hjælp af Beers lov er det muligt at beregne koncentrationsændringshastigheden i løbet af en reaktion. En potentiel fejl ved brug af absorptionsmålinger skyldes en afvigelse fra Beers lov, fordi den kun gælder for et begrænset interval af absorptionsværdier. Da den muligvis ikke kan anvendes ved absorbanser på mere end 1, bør assays derfor udformes således, at de eksperimentelle værdier er mindre end dette. Det kan være muligt at omgå nogle af disse problemer ved at anvende kuvetter med kortere vejlængder. En prøve med en absorbans på 1,00 i en kuvette med en vejlængde på 1,00 cm vil have en absorbans på 0,20 i en kuvette med en vejlængde på 0,20 cm. Generelt er det at arbejde med en absorbans på omkring 0,5 et kompromis mellem at minimere den optiske støj, der er indbygget i et spektrofotometer, og at have et rimeligt signal at måle. En opløsnings turbiditet kan sprede lyset og give en tilsyneladende absorbans. Filtrering eller centrifugering kan anvendes til at fjerne disse partikler. Selv om ændringer i vejlængden forhindrer visse afvigelser fra linearitet (dvs. når absorbansen er så høj, at spektrofotometeret ikke kan foretage en nøjagtig måling), skyldes afvigelserne ofte intermolekylære interaktioner mellem de absorberende arter. Dimerisering (eller dannelse af eximere af højere orden) forekommer ved højere koncentrationer af de absorberende arter. I disse tilfælde vil Beer’s lov blive overholdt, hvis koncentrationen af produktet nedsættes. Dette kan opnås enten ved at bremse reaktionen (ved at sænke enzymkoncentrationen) eller ved at foretage målinger over en kortere periode (før der opstår afvigelser fra Beers lov)
.