Alai

Coronavirus har forårsaget to store pandemier i de seneste to årtier, SARS og Mellemøstens respiratoriske syndrom (MERS)8,9. Man har generelt ment, at SARSr-CoV – som hovedsagelig findes hos flagermus – kunne forårsage et fremtidigt sygdomsudbrud10,11. Her rapporterer vi om en række tilfælde forårsaget af et uidentificeret lungesygdomsudbrud i Wuhan, Hubei-provinsen i det centrale Kina. Dette sygdomsudbrud – som startede på et lokalt marked for fisk og skaldyr – er vokset betydeligt og har inficeret 2 761 personer i Kina, er forbundet med 80 dødsfald og har ført til infektion af 33 personer i yderligere 10 lande pr. 26. januar 202012. De typiske kliniske symptomer hos disse patienter er feber, tør hoste, åndedrætsbesvær (dyspnø), hovedpine og lungebetændelse. Sygdommen kan føre til progressivt åndedrætsbesvær på grund af alveolær skade (som observeret ved tværgående computertomografiske billeder af brystkassen) og endog til døden. Sygdommen blev af klinikere bestemt til at være forårsaget af virusinduceret lungebetændelse ud fra kliniske symptomer og andre kriterier, herunder en stigning i kropstemperaturen, fald i antallet af lymfocytter og hvide blodlegemer (selv om niveauet af sidstnævnte undertiden var normalt), nye lungeinfiltrater på røntgenbilleder af brystet og ingen tydelig bedring efter behandling med antibiotika i tre dage. Det ser ud til, at de fleste af de første tilfælde havde været i kontakt med det oprindelige marked for fisk og skaldyr, men sygdommen er nu blevet smittet ved kontakt mellem mennesker.

Prover fra syv patienter med alvorlig lungebetændelse (hvoraf seks er sælgere eller leverandører fra markedet for fisk og skaldyr), som blev indlagt på intensivafdelingen på Wuhan Jin Yin-Tan Hospital i begyndelsen af udbruddet, blev sendt til laboratoriet på Wuhan Institute of Virology (WIV) med henblik på diagnosticering af det sygdomsfremkaldende patogen (Extended Data Table 1). Som et laboratorium, der undersøger CoV, brugte vi først pan-CoV PCR-primere til at teste disse prøver13 , da udbruddet fandt sted om vinteren og på et marked – det samme miljø som SARS-infektioner. Vi fandt fem prøver, der var PCR-positive for CoV’er. En prøve (WIV04), der blev indsamlet fra bronkoalveolær lavagevæske (BALF), blev analyseret ved metagenomisk analyse ved hjælp af næste generations sekventering for at identificere potentielle ætiologiske agenser. Af de 10 038 758 758 samlede læsninger – hvoraf 1 582 samlede læsninger blev tilbageholdt efter filtrering af læsninger fra det menneskelige genom – matchede 1 378 (87,1 %) sekvenser sekvenserne sekvensen af SARSr-CoV (Fig. 1a). Ved de novo samling og målrettet PCR opnåede vi et 29,891-basepar CoV-genom, der delte 79,6% sekvensidentitet med SARS-CoV BJ01 (GenBank accession nummer AY278488.2). Der blev opnået en høj genomdækning ved at genoverføre de samlede læsninger til dette genom (Extended Data Fig. 1). Denne sekvens er blevet indsendt til GISAID (https://www.gisaid.org/) (accession nummer EPI_ISL_402124). I overensstemmelse med det navn, som Verdenssundhedsorganisationen (WHO) har givet den, kalder vi den foreløbigt novel coronavirus 2019 (2019-nCoV). Fire yderligere genomsekvenser i fuld længde af 2019-nCoV (WIV02, WIV05, WIV06 og WIV07) (GISAID-adgangskodenumre EPI_ISL_402127-402130), som var mere end 99,9 % identiske med hinanden, blev efterfølgende opnået fra fire yderligere patienter ved hjælp af næste generations sekventering og PCR (Extended Data Table 2).

Virusgenomet består af seks større open-reading frames (ORF’er), som er fælles for coronavirusser, og en række andre accessoriske gener (Fig. 1b). Yderligere analyser viser, at nogle af 2019-nCoV-generne delte mindre end 80 % nukleotidsekvensidentitet med SARS-CoV. Aminosyresekvenserne af de syv bevarede replikase-domæner i ORF1ab, der blev anvendt til CoV-artsklassificering, var imidlertid 94,4 % identiske mellem 2019-nCoV og SARS-CoV, hvilket tyder på, at de to vira tilhører den samme art, SARSr-CoV.

Vi fandt derefter, at en kort region af RNA-afhængig RNA-polymerase (RdRp) fra et flagermus-coronavirus (BatCoV RaTG13) – som tidligere blev påvist i Rhinolophus affinis fra Yunnan-provinsen – udviste høj sekvensidentitet med 2019-nCoV. Vi foretog sekventering i fuld længde af denne RNA-prøve (GISAID-tilslutningsnummer EPI_ISL_402131). Simplot-analyse viste, at 2019-nCoV var meget lig RaTG13 i hele genomet (fig. 1c) med en samlet genom-sekvensidentitet på 96,2 %. Ved hjælp af de justerede genomsekvenser af 2019-nCoV, RaTG13, SARS-CoV og tidligere rapporterede SARSr-CoV’er fra flagermus blev der ikke påvist tegn på rekombinationsbegivenheder i 2019-nCoV’s genom. En fylogenetisk analyse af det fulde genom og gensekvenserne af RdRp og spike (S) viste, at – for alle sekvenser – RaTG13 er den nærmeste slægtning til 2019-nCoV, og at de danner en særskilt slægt fra andre SARSr-CoV’er (Fig. 1d og Extended Data Fig. 2). Det receptorbindende spikeprotein, der er kodet af S-genet, var meget divergerende fra andre CoV’er (Extended Data Fig. 2), med mindre end 75 % nukleotidsekvensidentitet med alle tidligere beskrevne SARSr-CoV’er, bortset fra en 93,1 % nukleotididentitet med RaTG13 (Extended Data Table 3). S-generne i 2019-nCoV og RaTG13 er længere end andre SARSr-CoV’er. De største forskelle i sekvensen af S-genet af 2019-nCoV er de tre korte indsættelser i det N-terminale domæne samt ændringer i fire ud af fem af de vigtigste rester i det receptorbindende motiv sammenlignet med sekvensen af SARS-CoV (Extended Data Fig. 3). Det skal undersøges yderligere, om insertionerne i det N-terminale domæne af S-proteinet i 2019-nCoV giver sialinsyrebindende aktivitet, som det er tilfældet i MERS-CoV. Den tætte fylogenetiske relation til RaTG13 giver beviser for, at 2019-nCoV kan være opstået hos flagermus.

Vi udviklede hurtigt en qPCR-baseret detektionsmetode på grundlag af sekvensen af det receptorbindende domæne i S-genet, som var den mest variable region i genomet (Fig. 1c). Vores data viser, at primerne kunne differentiere 2019-nCoV fra alle andre humane coronavirusser, herunder flagermus SARSr-CoV WIV1, som har 95 % identitet med SARS-CoV (udvidede data Fig. 4a, b). Af prøverne fra de syv patienter fandt vi, at seks BALF-prøver og fem mundsvaberprøver var positive for 2019-nCoV under den første prøvetagning, som vurderet ved qPCR og konventionel PCR. Vi kunne imidlertid ikke længere påvise viruspositive prøver i orale svaberprøver, analsvaberprøver og blodprøver, der blev taget fra disse patienter under den anden prøveudtagning (fig. 2a). Vi anbefaler dog, at der anvendes andre qPCR-mål, herunder RdRp- eller envelope (E)-generne, til rutinemæssig påvisning af 2019-nCoV. På baggrund af disse resultater foreslår vi, at sygdommen kan overføres ved luftbåren overførsel, selv om vi ikke kan udelukke andre mulige overførselsveje, da yderligere undersøgelser, herunder af flere patienter, er nødvendige.

Til serologisk påvisning af 2019-nCoV anvendte vi et tidligere udviklet nukleokapsid (N)-protein fra flagermus SARSr-CoV Rp3 som antigen til IgG- og IgM-enzymbundne immunosorbentassays (ELISA’er), da dette protein delte 92 % aminosyreidentitet med N-protein af 2019-nCoV (Udvidet datafigur. 5) og viste ingen krydsreaktivitet mod andre humane coronavirusser undtagen SARSr-CoV7. Vi var kun i stand til at få fem serumprøver fra de syv patienter med virusinfektioner. Vi overvågede virale antistofniveauer hos en patient (ICU-06) 7, 8, 9 og 18 dage efter sygdomsudbruddet (Extended Data Table 2). Der blev observeret en klar tendens i IgG- og IgM-titerne, som steg over tid, bortset fra at IgM-titeren faldt i den sidste prøve (fig. 2b). Som en anden analyse testede vi prøver fra 5 af de 7 viruspositive patienter omkring 20 dage efter sygdomsudbruddet for tilstedeværelsen af virale antistoffer (udvidede datatabeller 1, 2). Alle patientprøver – men ikke prøver fra raske personer – var stærkt positive for viralt IgG (Fig. 2b). Der var også tre IgM-positive prøver, hvilket indikerer en akut infektion.

Derpå lykkedes det os at isolere viruset (kaldet 2019-nCoV BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019) fra både Vero E6- og Huh7-celler ved hjælp af BALF-prøven fra patient ICU-06. Der blev observeret klare cytopatogene virkninger i cellerne efter inkubation i tre dage (Extended Data Fig. 6a, b). Identiteten af stammen WIV04 blev verificeret i Vero E6-celler ved immunofluorescensmikroskopi ved hjælp af det krydsreaktive virale N-antistof (Extended Data Fig. 6c, d) og ved metagenomisk sekventering, hvoraf de fleste læsninger kortlagde 2019-nCoV, og qPCR-analyse viste, at den virale belastning steg fra dag 1 til dag 3 (Extended Data Fig. 6e, f). Viruspartikler i ultratynde snit af inficerede celler viste en typisk coronavirus-morfologi, som visualiseret ved elektronmikroskopi (Extended Data Fig. 6g). For yderligere at bekræfte neutraliseringsaktiviteten af de virale IgG-positive prøver udførte vi serum-neutraliseringsassays i Vero E6-celler ved hjælp af de fem patientsera, der var IgG-positive. Vi viser, at alle prøverne var i stand til at neutralisere 100 TCID50 (50 % vævskultur-infektiøs dosis) af 2019-nCoV ved en fortynding på 1:40-1:80. Vi viser også, at dette virus kunne krydsneutraliseres af anti-SARS-CoV-serum fra heste (gave fra L.-F. Wang) ved fortyndinger på 1:40; potentialet for krydsreaktivitet med SARS-CoV-antistoffer skal dog bekræftes med anti-SARS-CoV-serum fra mennesker (Extended Data Table 4).

ACE2 er kendt for at være en cellereceptor for SARS-CoV14. For at afgøre, om 2019-nCoV også bruger ACE2 som en cellulær adgangsreceptor, udførte vi undersøgelser af virusinfektivitet ved hjælp af HeLa-celler, der udtrykte eller ikke udtrykte ACE2-proteiner fra mennesker, kinesiske hestesko-flagermus, civetdyr, svin og mus. Vi viser, at 2019-nCoV er i stand til at bruge alle ACE2-proteiner, undtagen mus ACE2, som en indgangsreceptor til at trænge ind i ACE2-udtrykkende celler, men ikke i celler, der ikke udtrykker ACE2, hvilket indikerer, at ACE2 sandsynligvis er den cellereceptor, gennem hvilken 2019-nCoV trænger ind i cellerne (Fig. 3). Vi viser også, at 2019-nCoV ikke bruger andre coronavirusreceptorer, såsom aminopeptidase N (APN) og dipeptidylpeptidase 4 (DPP4) (udvidede data fig. 7).

Undersøgelsen giver en detaljeret rapport om 2019-nCoV, det sandsynlige ætiologiske agens, der er ansvarlig for den igangværende epidemi af akut respiratorisk syndrom i Kina og andre lande. Virusspecifik nukleotid-positiv og viral-protein serokonversion blev observeret hos alle testede patienter og giver bevis for en sammenhæng mellem sygdommen og tilstedeværelsen af dette virus. Der er dog stadig mange presserende spørgsmål, som endnu ikke er blevet besvaret. Sammenhængen mellem 2019-nCoV og sygdommen er ikke blevet verificeret ved dyreforsøg for at opfylde Kochs postulater for at fastslå en årsagssammenhæng mellem en mikroorganisme og en sygdom. Vi kender endnu ikke denne virus’ overførselsrutine blandt værter. Det ser ud til, at virussen bliver mere og mere overførbar mellem mennesker. Vi bør nøje overvåge, om virussen fortsætter med at udvikle sig til at blive mere virulent. På grund af manglen på specifikke behandlinger og i betragtning af 2019-nCoV’s slægtskab med SARS-CoV vil nogle lægemidler og prækliniske vacciner mod SARS-CoV sandsynligvis kunne anvendes til behandling af dette virus. Endelig bør fremtidig forskning i betragtning af den store spredning af SARSr-CoV i deres naturlige reservoirer fokusere på aktiv overvågning af disse vira i større geografiske områder. På lang sigt bør der udarbejdes bredspektret antivirale lægemidler og vacciner mod nye smitsomme sygdomme, der forårsages af denne klynge af vira i fremtiden. Vigtigst af alt bør der indføres strenge regler mod domesticering og forbrug af vilde dyr og planter.

Note tilføjet i korrektur: Siden denne artikel blev accepteret, har ICTV udpeget viruset som SARS-CoV-215; desuden har WHO offentliggjort det officielle navn på den sygdom, der forårsages af dette virus, nemlig COVID-1916.