8.3 Kemiske tests
Visualisering af PHGs komponenter på TLC-plader er mulig ved brug af generelle reagenser for phenoler; jern(III)chlorid, vanillin og saltsyre (giver en række lyserøde farver med resorcinol- eller phloroglucinolderivater) eller ved hjælp af mere specifikke tests med 2,4-dinitrophenylhydrazin (detekterer aldehyder). Folin-Ciocalteus reagens er også nyttigt til påvisning af phenoler med catechol- eller hyrochinonkerner (der opstår blå pletter umiddelbart efter sprøjtning af TLC-pladen) eller til påvisning af andre phenoler, som viser blå til grå pletter, når pladen røgsyres med ammoniakdamp. Gibbs-reagens (2 % 2,6-dichlorquinon-chlorimid i chloroform) efterfulgt af røgning af pladen med 2M NH4OH giver forskellige farver (f.eks. er det muligt at skelne vanillinsyre – lyserød farve – og isovanillinsyre – blå). Cinnaminsyrederivater giver en karakteristisk lyseblå fluorescens, når de undersøges under UV (366 nm). Cis- og transisomerer af cinnaminsyre præsenteres på TLC-plader, når ekstraktet chromatograferes i vandige opløsningsmidler i to retninger (2D-TLC). Spektrofotometriske metoder til vurdering af phenolindholdet anvendes hyppigt, f.eks. metode med Arnows reagens eller den tidligere nævnte Folin-Ciocalteu-reagens .
Nogle kvalitative test viser kumariner i planteekstrakter, f.eks, Lactonringtest (kumariner, der hydrolyseres af fortyndet alkali, danner gul opløsning af O-kumarsyresalte, som kan vendes efter forsuring eller mætning med CO2); eller Azo-koblingstest (rød farve udvikles som følge af reaktionen med diazoteringssulfanilsyre i en alkalisk opløsning). Cumariner kan let påvises under UV-lys (365 nm), da de giver en karakteristisk farvefluorescens (undtagen simpel usubstitueret cumarin, som ikke har nogen fluorescens). De kan påvises ved deres blå, violette, brune, grønne eller gule farve. En 10 % opløsning af KOH i methanol eller en 20 % opløsning af antimonklorid i chloroform kan forstærke farven. Hydroxycoumariner udviser ikke bathochrome spektrale forskydninger i alkalisk opløsning . I HPLC-analyse med diode array-detektion giver forskellige UV-spektre af cumariner mulighed for hurtig identifikation af forbindelser.
Chromoner reagerer i alkaliopløsninger for at give O-hydroxy-β-diketoner uden regenerering af γ-pyronringen og også farvede forbindelser med koncentreret syre og koncentreret alkali. Chromoner er også synlige i UV-lys (blå, gul, grøngul, grønlig gul, brun fluorescens ved 365 nm).
Favonoiders tilstedeværelse af den aktive phenylring (chromophor) gør dem lette at påvise i UV-lys. Deres UV-spektre er særligt informative, idet de giver strukturelle oplysninger, der kan skelne mellem fenoltypen og oxidationsmønsteret. Forskellige kemiske reaktioner ved sprøjtning af TLC-kromatogrammer er mulige; f.eks. visualisering i tilstedeværelse af ammoniakdamp (chalconer og auroner bliver henholdsvis orange og røde) eller sprøjtning med Naturstoff Reagenz A (1% opløsning af ester af 2-aminoethanol og diphenylborsyre) og oversprøjtning med 5% methanolopløsning af polyethylenglycol 4000 (PEG 4000), hvilket øger følsomheden af denne reaktion. Efter derivatisering kunne forbindelserne observeres i UV-lys (fluorescens fra lysegul til grøn). Andre tests omfatter sprøjtning med jern(III)chlorid, diazoteret sulfanilsyre (begge er reaktioner for phenoler) og den specifikke reaktion; cyanidin med magnesiumpulver i tilstedeværelse af saltsyre (indikerer tilstedeværelsen af flavanoner og dihydroflavanoler) . Til kvantitativ kolorimetrisk bestemmelse af flavonoider anvendes reaktion med aluminiumchlorid (AlCl3) (absorbansen måles ved 425 nm). Flavonoider opløst i alkaliske opløsninger giver en intens gul farve, som aftager efter tilsætning af syre. UV-spektre af flavonoidforbindelser viser to hovedbånd (absorptionsmaksima): bånd I ved højere bølgelængde (som tilskrives cinnamoyldelen af flavonoidstrukturen) og bånd II ved lavere bølgelængde (som skyldes benzoyldelen). Bånd I ligger normalt ved 304-350 nm for flavoner (H ved C-3 i C-ringen), ved 352-385 nm for flavonoler (OH-gruppe ved C-3) og ved 328-357 nm for 3-substituerede flavonoler (O-substitution ved C-3). Bånd II for de fleste strukturer ligger ved ca. 250-280 nm. En ekstra phenolgruppe (-OH) i ring A forårsager den bathochrome forskydning (forskydning til længere bølgelængder) i bånd II, og en ekstra -OH-gruppe i ring B genererer en lignende effekt i bånd I .
De fleste anthrakinoner eller deres glykosider danner gule eller orangerøde krystaller og kan vise fluorescens afhængig af pH . Den vigtigste farvereaktion er Bornträger’s test, som udføres ved at opløse quinonen i et alkalisk vandigt medium. Farvereaktionen varierer fra orangerød til purpurviolet (afhængig af quinonets struktur og substituenter). Anthraquinoner giver en rød farve ved denne reaktion. For 1,8-dihydrochinoner anvendes også reaktion med magnesiumacetat. Anthraquinoner kan påvises på TLC-plader efter påsprøjtning med 10% methanolisk KOH-opløsning. De oprindelige gule eller gulbrune farver ændres til rød, violet, grøn eller lilla . Pulveriseret rabarber kan undersøges i UV-lys for at påvise tilstedeværelsen af raponthicin (stilbenoidglycosid, som er giftigt). I original rabarber (Rheum palmatum) forekommer en rødbrun fluorescens, men der ses ingen lysende blåviolette pletter (som i årsag af rhapontisk rabarber-Rheum rhaponticum).
Som tidligere nævnt er saponiner overfladeaktive forbindelser (modificerer overfladespændingen) og har emulgerende egenskaber. Til en hurtig kvalitativ kontrol af, om en plante har SPG’er, anvendes almindeligvis en skumtest ved at ryste plantemateriale med vand. Saponiner har membranpermeabiliserende egenskaber. Lave koncentrationer af saponiner er i stand til at ødelægge erytrocytmembraner (hvilket kan udfælde det kolesterol, der findes i de røde blodlegemers membraner), hvilket forårsager hæmolyse af blod in vitro. Denne evne har ført til den udbredte anvendelse af hæmolyse (hæmolytisk indeks – IH) som en metode til bestemmelse af biologisk aktivitet. IH er defineret som mængden af 2 % isotonisk suspension af okseblod (i mL), som undergår hæmolyse, når den behandles med 1 g af det testede plantemateriale (eller det testede ekstrakt). Som reference blev anvendt Gypsophila paniculata saponinblanding (IH=30 000) eller Saponin Album (Merck) (IH=15 000). Som beskrevet af Hostettmann og Marston varierer saponosidernes hæmolytiske aktivitet betydeligt med glykosiddelens struktur. Monodesmosidiske saponiner (undtagen acylglycosider og glycyrrhizin) er stærkt hæmolytiske. Der er ingen farvereaktion, der er særlig specifik for SPG’er. Der findes dog Lieberman-reaktion (med eddikesyreanhydrid i tilstedeværelse af svovlsyre), hvor farverne varierer afhængigt af aglyconens type (triterpen-pink til rød -eller steroid-blå-grøn) .
Kemiske reaktioner til identifikation af CRG’er i plantemateriale kan skyldes aglykonerne eller sukkerstofferne. Liebermann’s og Salkoviski’s test indikerer steroide dele, og den er derfor ikke specifik for CRG’er. Keller Kiliani’s og Xanthidrole-testen indikerer begge deoxy-sukkerstoffer (digitoxose eller cymarose). Kedde- eller Baljet-reaktionen er mere specifik, fordi den er knyttet til tilstedeværelsen af α,β-umættet lactonring. Fluorescerende reaktion af CRG’er er også mulig, f.eks. eliminerer digoxinhydroxylgruppen ved C-14 og C-16 vand med H2SO4 med dannelse af to yderligere dobbeltbindinger. Dette resulterer i et konjugeret system (med en dobbeltbinding i lactonringen), som gør digoxin fluorescerende i UV-lys. Jensen-reaktionen (efter sprøjtning med trichloreddikesyre i ethanol) anvendes til at visualisere CRG’er på TLC-kromatogrammer .
Direkte måling af det samlede HCN ved syrehydrolyse af cyanogene glycosider, der findes i fødevarer, samt nedbrydning af de mellemliggende cyanohydriner til HCN har den fordel, at den kan anvendes på alle typer prøver, selv om ikke alt potentielt HCN fra cyanogene glycosider sandsynligvis er tilgængeligt in vivo. Visualisering af tilstedeværelsen af disse forbindelser i planter er mulig på filterpapir, der er imprægneret med reagenser som f.eks. picronsyre/natriumcarbonat eller benzidin/cupric acetat. Disse reagenser er i stand til at give farvereaktioner med HCN, der frigives fra knust plantevæv. Det imprægnerede papir anbringes i et rør over det knuste plantemateriale og inkuberes ved 40 °C i 2 timer. En farveændring fra gul til rødbrun indikerer enzymatisk frigivelse af HCN. Picratpapiret er ikke helt specifikt for cyanogen (flygtige isothiocyanater fra Brassica-arter reagerer også på denne reaktion). Derfor anvendes også en anden test, hvor der anvendes en blanding (1:1) af frisk fremstillede opløsninger af 1 % 4,4-tetramethyldiamin-diphenylamin i kloroform (w/v) og 1 % kobberethylacetoacetat i kloroform (w/v). Farvereaktionen skifter fra svagt blågrøn til en lysegrøn farve. En anden mulig metode er destillation af plantevævet i surt vand og titrering af det frigjorte HCN med sølvnitrat. Kromatografiske metoder såsom HPLC/MS eller GC/MS af trimethylsilylderivater er effektive til analyse af individuelle cyanogene glycosider eller cyanohydriner og giver kemisk karakterisering samt kvantificering af forbindelserne .
På grund af de mange forskellige produkter, der dannes i planter af glucosinolater (afhængigt af aglyconstrukturen), kan estimering af isothiocyanater ved den spektrofotometriske metode (hvor farveprodukterne 1,3-benzodithiol-2-tiones dannes ved isothiocyanatkondensation med 1,2-benzen-dithiol) være utilstrækkelig til at bestemme glucosinolatindholdet i planter .