Alai

I forbindelse med dette blogindlæg (der kommer mere om de forskellige typer fixeringsmidler…) vil vi primært fokusere på brugen af paraformaldehyd/formaldehyd, almindeligvis kaldet PFA, som er det mest almindeligt anvendte fixeringsmiddel i flowcytometri. PFA henviser specifikt til den faste, polymere form af formaldehyd (og opløses til monomer formaldehyd i vandig opløsning), så det, der normalt kanonisk omtales som “PFA-fiksering”, er faktisk anvendelse af den monomere, formaldehydopløsning. I dette tilfælde er PFA og formaldehyd synonyme og indbyrdes ombyttelige.
En opløsning på 1-4 % PFA anvendes typisk til fiksering af prøver til flowcytometri. Ved desinficering af infektiøse prøver kan koncentrationer på helt ned til 0,37 % effektivt desinficere prøver fra HIV-inficerede patienter1. Inkubation i op til 45-60 minutter med 1 % PFA og 15-20 minutter med 4 % PFA (f.eks. BioLegends buffer) er tilstrækkeligt til at fiksere cellerne fuldstændigt, og cellerne kan enten anvendes til behandling i efterfølgende led (permeabilisering for intracellulære mål) eller opbevares til fremtidig analyse på dette stadium.
Under en rutinemæssig flowcytometrifarvningsprocedure, der involverer farvning af overflademarkører, er der flere trin, hvor du kan beslutte at fiksere dine prøver – fiksere efter farvning af overflademarkører eller fiksere før.
I nogle tilfælde er beslutningen om, hvornår du kan fiksere, … fast. Hvis du f.eks. analyserer phospho-mål, kan binding af visse overfladeantigener med antistoffer ændre intracellulære signalveje kort tid efter kontakt og dermed føre til en artefakt i dine fosforyleringsresultater. I så fald bør du fiksere cellerne før tilsætning af overfladeantistofferne (hvilket er grunden til, at vores anbefalede protokol til brug af vores True-Phos™ Perm Buffer til analyse af intracellulære fosforyleringsmål er udformet således, at fikseringstrinnet går forud for andre procedurer). Hver metode har sine egne fordele og ulemper, men her er et par ting, man skal være opmærksom på i hvert tilfælde.