Virale stammer
HCoV-229E (VR-740) og HCoV-OC43 (VR-1558) blev opformeret i humane diploide MRC-5 fibroblaster fra lungerne (CCL-171) og WI-38 (CCL-75), (alle fra ATCC, Manassas, VA). Begge humane cellelinjer blev dyrket i MEM suppleret med 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 2 mM L-alanyl-L-glutamin, 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin (Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA). Virusinfektionsmediet bestod af MEM eller RPMI-1640 plus 2 % varmeinaktiveret FBS for henholdsvis HCoV-229E og HCoV-OC43. Virusstammerne blev opformeret ved inokulering af kolber indeholdende 24 timer gamle værtsceller, som var 80-90 % konfluente. Efter en times inkubation blev cellemonolaget vasket og inkuberet i frisk infektionsmedium i tre eller fire dage ved 35 °C for HCoV-229E og ved 33 °C for HCoV-OC43. Supernatanten, der indeholder den virale arbejdsoplagring, blev derefter opsamlet ved centrifugering (300 g i 15 minutter). Virustiteren blev bestemt ved 50 % vævskulturinficerende dosis TCID50 ved at vurdere cytopatiske effekter (CPE), som blev scoret i et lysfeltmikroskop (10×) som vacuolisering af cytoplasma, celleafrunding og afskalning.
Benchtop aerosolbestrålingskammer
Et dynamisk aerosol/virusbestrålingskammer med én passage blev anvendt til at generere, eksponere og indsamle aerosolprøver som tidligere beskrevet23. Viralaerosoler blev genereret ved at tilsætte en virusopløsning i en højtydende udvidet aerosolforstøver til respiratorisk terapi (Westmed, Tucson, AZ) og betjenes ved hjælp af en luftpumpe med en inputstrømningshastighed på 11 L/min. Virus flød ind i kammeret og blev blandet med tør og befugtet luft for at opretholde en luftfugtighed på ca. 50-70 %. Den relative fugtighed, temperaturen og aerosolpartikelstørrelsesfordelingen blev overvåget under hele driften. Aerosol blev udsat for fjern-UVC-lys og endelig opsamlet ved hjælp af en BioSampler (SKC Inc., Eighty Four, PA).
Den fjern-UVC-lampe blev placeret ca. 22 cm væk fra UV-eksponeringskammeret og rettet mod det 26 cm × 25,6 cm × 254 μm UV-transmitterende plastvindue (TOPAS 8007 × 10, TOPAS Advanced Polymers Inc., Florence, KY). I overensstemmelse med vores tidligere eksperimenter med dette kammer23 var strømningshastigheden gennem systemet 12,5 L/min. Volumenet af UV-eksponeringsområdet var 4,2 L, så hver aerosol blev eksponeret i ca. 20 sekunder, mens den passerede gennem vinduet. Hele bestrålingskammeret var indeholdt i et kabinet på biosikkerhedsniveau 2, og alle luftind- og udgange var udstyret med HEPA-filtre (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA) for at forhindre uønsket forurening i at komme ind i eller ud af systemet.
Bestrålingskammerets ydeevne
Det tilpassede bestrålingskammer simulerede overførsel af aerosoliserede vira, der produceres via menneskers hoste og vejrtrækning. Kammeret fungerede ved en gennemsnitlig relativ luftfugtighed på 66 % og en gennemsnitstemperatur på 24 °C i alle kørsler. Den gennemsnitlige partikelstørrelsesfordeling var 83 % mellem 0,3 μm og 0,5 μm, 12 % mellem 0,5 μm og 0,7 μm og 5 % >0,7 μm (tabel 3). Aerosoliserede vira blev effektivt overført gennem systemet, hvilket fremgik af kontrollen (nul eksponering), der viste tydelig virusintegration (figur 2 og 3, øverste venstre panel).
Far-UVC-lampe og dosimetri
Den far-UVC-kilde, der blev anvendt i denne undersøgelse, var et 12 W 222-nm KrCl excimerlampe modul på 222 nm fremstillet af USHIO America (artikel nr. 9101711, Cypress, CA). Lampen er udstyret med et proprietært optisk filtervindue for at reducere lampeemissioner uden for KrCl-emissionstoppen på 222 nm. Lampen blev anbragt 22 cm fra vinduet i eksponeringskammeret og rettet mod vinduets midte. Optiske effektmålinger blev udført ved hjælp af en 818-UV/DB lav-effekt UV-forstærket siliciumfotodetektor med en 843-R optisk effektmåler (Newport, Irvine, CA). Dosimetri blev udført før starten af et eksperiment for at måle fluensen i kammeret ved aerosolens position.
Afstanden mellem lampen og bestrålingskammeret gjorde det muligt for en enkelt lampe at bestråle hele eksponeringsvinduets område ensartet. Målinger ved hjælp af siliciumfotodetektoren viste en eksponeringsintensitet på ca. 90 μW/cm2 i hele eksponeringsområdet. Kammeret er udstyret med en reflekterende aluminiumsoverflade over for eksponeringsvinduet. Som i vores tidligere arbejde med dette kammer23 var denne overflades refleksivitet ca. 15 %. Vi har derfor forsigtigt anslået intensiteten over hele eksponeringsområdet til at være 100 μW/cm2. Med lampen placeret 22 cm fra vinduet og i betragtning af de 20 sekunder, det tager en aerosolpartikel at passere eksponeringsvinduet, har vi beregnet den samlede eksponeringsdosis til en partikel til 2 mJ/cm2. Vi brugte yderligere plader af UV-transmitterende plastvinduer for at reducere intensiteten ensartet i hele eksponeringsområdet for at skabe forskellige eksponeringsbetingelser. Mens vi i vores tidligere arbejde med disse plader målte en transmission tættere på 65 %23 , målte vi i disse forsøg en 222-nm-transmission på ca. 50 % for hver plade. Dette fald i transmissionen skyldes sandsynligvis plastens fotoforringelse over tid4. Tilføjelsen af et eller to ark af plast, der dækker eksponeringsvinduet, reducerer eksponeringsdosis til henholdsvis 1 og 0,5 mJ/cm2.
Eksperimentel protokol
Som tidligere beskrevet23 bestod virusopløsningen i forstøveren af 1 ml Modified Eagle’s Medium (MEM, Life Technologies, Grand Island, NY) indeholdende 107-108 TCID50 af coronavirus, 20 ml deioniseret vand og 0,05 ml Hank’s Balanced Salt Solution med calcium og magnesium (HBSS++). Bestrålingskammeret blev drevet med aerosoliserede viruspartikler, der strømmede gennem kammeret og bypass-kanalen i 5 minutter før hver prøveudtagning, for at etablere den ønskede RH-værdi. Prøveudtagningen blev indledt ved at ændre luftstrømmen fra bypass-kanalen til BioSampleren ved hjælp af et sæt trevejsventiler. BioSampleren blev indledningsvis fyldt med 20 ml HBSS++ for at opsamle aerosolerne. I løbet af hver prøveudtagning, som varede 30 minutter, blev det indre af bestrålingskammeret udsat for 222 nm fjern-UVC-lys, der trængte ind gennem plastvinduet. Variation af den far-UVC-dosis, der blev leveret til aerosolpartiklerne, blev opnået ved at indsætte yderligere UV-transparente plastfolier som beskrevet ovenfor, hvorved der blev leveret de tre testdoser på 0,5, 1,0 og 2,0 mJ/cm2. Nul-dosis kontrolundersøgelser blev udført med excimerlampen slukket. Efter prøvetagningsperioden var afsluttet, blev opløsningen fra BioSampleren brugt til virusinfektivitetsassays.
Virusinfektivitetsassays
TCID50
Vi brugte 50% vævskulturinficerende dosisassay til at bestemme virusinfektivitet28. Kort fortalt blev 105 værtsceller udplottet i hver brønd i 96-brønde plader dagen før forsøget. Cellerne blev vasket to gange i HBSS++, og serielle 1:10-fortyndinger i infektionsmedium af det eksponerede virus fra BioSampler blev overlejret på cellerne i to timer. Cellerne blev derefter vasket to gange i HBSS++, dækket med frisk infektionsmedium og inkuberet i tre eller fire dage ved 34 °C. Cytopatiske virkninger (CPE) blev scoret i et lysfeltmikroskop (10×) som vacuolisering af cytoplasma, celleafrunding og afskalning. TCID50 blev beregnet ved hjælp af Reed og Muench-metoden28,38. For at bekræfte CPE-scorerne blev prøverne fikseret i 100 % methanol i fem minutter og farvet med 0,1 % crystal violet. Resultaterne er rapporteret som et estimat af plakedannende enheder (PFU)/ml ved hjælp af konverteringen PFU/ml = 0,7 TCID50 ved anvendelse af Poisson-fordelingen29.
Immunofluorescens
For at vurdere, om stigende doser af 222-nm lys reducerede antallet af inficerede celler, udførte vi en standard fluorescerende immunfarvningsprotokol til påvisning af et viralt antigen i de menneskelige værtsceller23. Kort fortalt blev 2 × 105 værtsceller (MRC-5-celler for HCoV-229E og WI-38 for HCoV-OC43) udplottet i hver brønd af 48-brønde plader dagen før forsøget. Efter at have kørt gennem bestrålingskammeret i 30 minutter blev 150 μl virussuspension opsamlet fra BioSampler overlejret på monolaget af værtsceller. Cellerne blev inkuberet med virusset i en time, hvorefter de blev vasket tre gange med HBSS++ og derefter inkuberet natten over i frisk infektionsmedium. Inficerede celler blev derefter fikseret i 100 % iskold methanol ved 4 °C i 5 minutter og mærket med anti-human coronavirus spike glycoprotein (40021-MM07, Sino Biologicals US Inc., Chesterbrook, PA) 1:200 i HBSS++ indeholdende 1 % bovin serumalbumin (BSA; Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA) ved stuetemperatur i en time med let omrystning. Cellerne blev vasket tre gange i HBSS++ og mærket med gedeanti-mus Alexa Fluor-488 (Life Technologies, Grand Island, NY) 1:800 i HBSS++ indeholdende 1 % BSA ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke under let omrystning. Efter tre vask i HBSS++ blev cellerne farvet med Vectashield indeholdende DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindol) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og observeret med 10×-objektivet på et Olympus IX70 fluorescensmikroskop udstyret med et Photometrics PVCAM højopløseligt, højeffektivt digitalkamera og Image-Pro Plus 6.0-software (Media Cybernetics, Bethesda, MD). For hver 222-nm-dosis og virusslægt blev de repræsentative resultater gentaget to gange for hver 222-nm-dosis og virusslægt. For hver prøve blev der optaget op til ti synsfelt af sammensmeltede DAPI- og Alexa Fluor-488-billeder.
Dataanalyse
Den overlevende fraktion (S) af virus blev beregnet ved at dividere fraktionen PFU/ml ved hver UV-dosis (PFUUV) med fraktionen ved nul dosis (PFUcontrols): S = PFUUV/PFUcontrols. Overlevelsesværdierne blev beregnet for hvert gentaget forsøg og naturligt log (ln) transformeret for at bringe fejlfordelingen tættere på normalfordelingen39. Robust lineær regression ved hjælp af IWLS (iterated re-weighted least squares)40,41 blev udført i R 3.6.2-software ved hjælp af disse normaliserede ln-værdier som den afhængige variabel og UV-dosis (D, mJ/cm2 ) som den uafhængige variabel. Ved hjælp af denne fremgangsmåde blev virusoverlevelsen beskrevet ved førsteordens kinetik i henhold til ligningen4:
hvor k er UV-inaktiveringshastighedskonstanten eller modtagelighedsfaktoren (cm2/mJ). Regressionen blev udført med intercepttermen sat til nul, hvilket svarer til definitionen af 100 % relativ overlevelse ved UV-dosis nul, separat for hver undersøgt virusstamme. Dataene ved nul dosis, som pr. definition repræsenterer ln = 0, blev ikke medtaget i regressionen. Usikkerhederne (95 % konfidensintervaller, CI) for k-parameteren for hver virusstamme blev estimeret ved bootstrapping for hver regressionsmetode, fordi bootstrapping kan resultere i mere realistiske usikkerhedsestimater sammenlignet med den analytiske standardapproksimation baseret på asymptotisk normalitet i små datasæt som dem, der er anvendt her (n = 3 HCoV-229E og n = 4 for HCoV-OC43). God tilpasning blev vurderet ved hjælp af determinationskoefficienten (R2). Analyse af residualer for autokorrelation og heteroskedasticitet blev udført ved hjælp af henholdsvis Durbin-Watson-testen42 og Breusch-Pagan-testen (implementeret af R-pakken lmtest)43. Parameterestimater (k) for hver virusstamme blev sammenlignet med hinanden på grundlag af de 95 % CIs og direkte ved t-test ved hjælp af stikprøvestørrelser, k-værdier og deres standardfejl. Virusinaktiveringstværsnittet, D90, som er den UV-dosis, der inaktiverer 90 % af den eksponerede virus, blev beregnet som D90 = – ln/k. Andre D-værdier blev beregnet på samme måde.