Alai

Kravet om pålidelige bicistroniske eller multicistroniske vektorer i genoverførselssystemer er på forkant med bio-/biomedicinsk teknologi. En metode, der giver en effektiv samekspression af flere heterologe proteiner, ville være værdifuld for mange anvendelser, især inden for lægevidenskab til behandling af forskellige typer sygdomme. I denne undersøgelse har vi designet og konstrueret en bicistronisk ekspressionsvektor ved hjælp af et selvspaltende 2A-peptid, der stammer fra et virus fra insektet Thosea asigna (T2A). Dette udviste den mest effektive spaltning af 2A-sekvensen. Der blev konstrueret to versioner af den T2A-baserede vektor ved at skifte DNA-sekvenserne, der koder for proteinerne af interesse, det N-myristoylerede protein og det nuklear-hjem-protein, opstrøms og nedstrøms for henholdsvis 2A-linkeren. Vores resultater viste, at der blev fundet lignende niveauer af mRNA-ekspression, og der blev observeret en 100 % spaltningseffektivitet af T2A. Ikke desto mindre rapporterede vi også det klare bevis for, at det N-myristoylerede protein ikke kan placeres nedstrøms for 2A-sekvensen. Da proteinproduktet ikke translokaliseres til plasmamembranen på grund af den ændrede myristoyleringsproces, er genpositionen af den T2A-baserede vektor meningsfuld for den subcellulære lokalisering af det N-myristoylerede protein. Derfor blev observationen markeret som en forsigtighedsforanstaltning for anvendelse af 2A-peptidet. For at anvende 2A-peptidteknologien til generering af bicistronisk eller multikistronisk ekspression bør vektordesignet nøje overvejes med hensyn til transgenpositionen, signalsekvenser og posttranslationelle modifikationer af hvert enkelt protein.