Alai

Fremstilling af temperaturområdet

De almindeligt anvendte laboratoriebetingelser for Macrostomum lignano kulturer er følgende: temperatur 20 °C, luftfugtighed 60 % og lys/mørkecyklus 14 timer/10 timer. Disse betingelser blev primært valgt, fordi de er optimale for væksten af diatomeen Nitzschia curvilineata, som er den vigtigste fødekilde for ormene . For at vurdere de temperaturforhold, der kan anvendes i forsøget, fastlagde vi først det temperaturområde, hvor ormene kan overleve. Frysning af ormene viste sig at være dødbringende, men de kunne overleve, når de blev opbevaret ved 4 °C i mindst to uger. Da diatomeen imidlertid ikke vokser under disse forhold, besluttede vi at udelukke 4 °C fra yderligere eksperimenter. Andre temperaturer under 20 °C blev også udelukket fra forsøget, da det primære formål med undersøgelsen var at finde betingelser, der fremskynder vækst og udvikling. På den anden side af temperaturspektret opløses ormene, når de opbevares ved 42 °C i to timer, og de døde efter en uges dyrkning ved 37 °C. Derfor har vi besluttet at bruge 20 °C, 25 °C, 30 °C og 35 °C som vores forsøgsbetingelser til at studere langtidstemperaturvirkningerne på M. lignano (fig. 1).

Hedechokrespons

For at undersøge, hvilke temperaturer der inducerer stressrespons hos ormene, overvågede vi aktiviteten af varmechok 20-promotoren (Mlig-hsp20). Først udførte vi en kvantitativ RT-PCR for at måle ekspressionsniveauet af Mlig-hsp20 ved 20 °C, 25 °C, 30 °C, 33 °C, 34 °C og 35 °C. Der var ingen signifikant forskel i ekspressionsniveauet af Hsp20 mellem 20 °C og 25 °C (fig. 2a). Der blev dog observeret en lille (2 gange), men signifikant (P = 0,027, t-test), stigning i ekspressionen ved 30 °C sammenlignet med 20 °C (Fig. 2a). Der blev observeret en mere end ti-dobbelt stigning i ekspressionsniveauet ved 33 °C, som steg til mere end 100 gange ved den højest testede temperatur på 35 °C (fig. 2a). I den anden test skabte vi en transgene linje, der udtrykker mScarlet-I-protein under kontrol af Mlig-hsp20-promotoren (Fig. 2b) og målte fluorescensniveauet 24 timer efter en 2 timers inkubation ved forskellige temperaturer fra 20 °C til 37 °C (Fig. 2c, d). Der blev observeret en mere end to- og ti-dobbelt stigning i fluorescensen ved henholdsvis 34 °C og 37 °C (Fig. 2c).

Speed of embryonic development

Ifølge Morris et al. tager det ca. 120 timer (fem dage) for Macrostomum-æg at udvikle sig fuldt ud, når æggene opbevares ved 20 °C. For at undersøge, hvordan temperaturen påvirker hastigheden af den embryonale udvikling og klækning, plukkede vi frisklagte embryoner og fulgte deres udvikling indtil klækning ved forskellige temperaturer. For at undersøge potentielle forskelle på grund af genetisk baggrund anvendte vi to M. lignano linjer, som i øjeblikket anvendes i de fleste undersøgelser af M. lignano, nemlig DV1 og NL10 linjerne. Disse linjer er uafhængigt af hinanden afledt af vildtypepopulationer fra samme geografiske sted og adskiller sig fra hinanden ved en hel kromosomduplikation, men opfører sig ellers meget ens under laboratorieforhold . Vi undersøgte først virkningen af lav temperatur. Ved 4 °C standses æggenes udvikling, og de kan opbevares i mindst en måned, hvorefter de genoptager deres udvikling, når de kommer tilbage til højere temperaturer. Dernæst undersøgte vi, hvor hurtigt æggene udvikler sig ved temperaturer mellem 20 °C og 35 °C. Som det fremgår af fig. 3, begyndte æggene at klække efter seks dage, når de blev opbevaret under standardbetingelser (20 °C). En forøgelse af temperaturen resulterede i en forholdsmæssigt hurtigere embryonal udvikling og tidligere klækning, som var to gange hurtigere ved 35 °C sammenlignet med 20 °C og kun tog tre dage. Det skal bemærkes, at ca. 10 % af æggene ikke er udklækket efter otte dages inkubation ved 20 °C sammenlignet med mindre end 5 % ved højere temperaturer, hvilket tyder på, at selv den højeste testede temperatur på 35 °C ikke har skadelige virkninger på embryonernes overlevelse.

Reproduktion

Reproduktionshastigheden er en meget vigtig faktor for en modelorganisme, da dyr med kortere generationstid muliggør en hurtigere generering af data i genetiske eksperimenter. Hvis dyrene producerer et stort antal afkom, vil de genererede data desuden i de fleste tilfælde have en højere statistisk styrke.

For at vurdere temperaturens indvirkning på M. lignanos reproduktionshastighed har vi sammenlignet antallet af afkom, der genereres i løbet af fem uger af orme, der holdes under forskellige temperaturforhold. Forsøget blev startet med udklækninger for at inddrage den postembryonale udvikling i undersøgelsen, og der blev anvendt både DV1- og NL10-linjen. Det tog klækkerne fra begge linjer tre uger at vokse og producere det første afkom ved 20 °C, mens der ved 25 °C blev observeret klækninger efter to uger for NL10-linjen, men ikke for DV1. Ved 30 °C og 35 °C producerede begge linjer afkom allerede efter to uger (fig. 4). Fra tre uger og fremefter steg antallet af klækkede unger pr. uge fra under 200 ved 20 °C til mere end 300 ved temperaturer over 20 °C; antallet af klækkede unger var størst for orme, der blev holdt ved 30 °C. Dette gjaldt for begge genetiske baggrunde, og vi observerede ikke signifikante forskelle mellem DV1- og NL10-linjerne (Fig. 4).

Og selv om temperaturer på 30 °C og højere resulterede i flere udklækninger, aktiverer det også et hedeshockrespons (fig. 2). For at undersøge den langsigtede effekt af den forhøjede temperatur og potentielle stress, som den kan have på ormene, holdt vi ormene ved de valgte temperaturer og overvågede for morfologiske aberrationer efter tre og seks måneders dyrkning. Orme, der blev holdt ved 25 °C, viste ingen morfologiske ændringer på begge kontrolpunkter sammenlignet med orme, der blev holdt ved 20 °C (fig. 5). Men både ved 30 °C og 35 °C blev der observeret forskellige afvigelser i den generelle morfologi. Efter tre måneder var et øget antal cyster, beskadiget væv og forstørrede testikler almindeligt forekommende i både DV1- og NL10-linjerne (Fig. 5). Ingen af de orme, der blev opbevaret ved 35 °C, overlevede indtil kontrolpunktet efter seks måneder, og alle de orme, der overlevede ved 30 °C, viste morfologiske aberrationer (Fig. 5). Derfor er langvarig udsættelse for temperaturer over 30 °C skadelig for M. lignano.

Regenerationstid

Da den største tiltrækning af M. lignano som modelorganisme er dens regenerative evne, undersøgte vi dernæst, hvordan temperaturen påvirker regenerationen. Det er almindeligt accepteret, at højere temperatur fører til stigninger i den samlede metaboliske aktivitet . For at evaluere temperaturens indflydelse på den tid, det tager for en orm at regenerere sin krop fuldt ud efter amputation over testikelregionen, fulgte vi regenerationen af testikler og fremkomsten af sædceller i vesicular seminalis ved hjælp af en tidligere etableret transgene linje NL22, som udtrykker GFP under kontrol af den testikel- og sædceller-specifikke ELAV-promotor . Anvendelse af en sådan transgen markør giver bedre præcision, konsistens og effektivitet ved bestemmelse af regenereringens omfang. Faktisk observerede vi ingen signifikant variation ved vurdering af tidspunktet for fremkomsten af GFP-signalet efter amputation ved alle testede temperaturer (tabel 1).

Som forventet steg regenereringshastigheden med temperaturen (tabel 1). Hvis vi tager regenerationstiden ved 20 °C som standardhastighed, er de beregnede temperaturkoefficienter for regeneration af testikler Q10 = 4 ved 25 °C og Q10 = 3 for 30 °C og 35 °C. Dette viser, at den største effekt opnås ved at øge temperaturen til 25 °C, og at den hurtigste regenerering finder sted ved 30 °C, uden at den øgede temperatur har yderligere fordele for regenereringstiden. Derfor bør temperaturer på 25 °C og 30 °C overvejes i regenerationsforsøg på M. lignano, da det forkorter forsøgets varighed med to til tre gange (tabel 1).

RNA-interferens

Knockdown af genekspression ved hjælp af RNA-interferens (RNAi) er i øjeblikket den primære tilgang til tab-af-funktion-undersøgelser i M. lignano . I denne fremgangsmåde gennemvædes dyrene med dobbeltstrenget RNA mod målgenet, og ofte kræves der langvarige behandlinger i flere uger for at observere en fænotype . Vi har testet, hvordan temperaturen påvirker hastigheden af fænotypeudviklingen ved RNAi-behandling. For at gøre dette slog vi ned på Mlig-ddx39, et gen kendt for sin funktion i celleproliferation i M. lignano og en robust letal knockdown-fænotype . I lighed med reproduktionstesten anvendte vi DV1- og NL10-linjerne til dette forsøg (tabel 2). Ved 20 °C tog det omkring 20 dage for alle dyr at dø efter Mlig-ddx39 knockdown. Når ormene blev holdt ved højere temperaturer, indtraf døden hurtigere: på 11 og 8 dage for orme, der blev holdt ved henholdsvis 25 °C og 30 °C. Der var ingen synlig forskel mellem de to stammer, der blev anvendt til forsøget (tabel 2). Dernæst undersøgte vi, om den observerede stigning i hastigheden af manifestationen af ddx39 RNAi-fenotypen ved højere temperaturer kan tilskrives en højere effektivitet af gen-nedbrydning ved RNAi eller andre faktorer. Med henblik herpå målte vi ved hjælp af qRT-PCR hyppigheden af Mlig-ddx39-transskriptioner på forskellige tidspunkter efter starten af RNAi-forsøget ved forskellige temperaturer (fig. 6). Dyr, der blev behandlet med dsRNA mod gfp, blev anvendt som referencekontrol. Ved alle testede temperaturer blev der ikke observeret nogen signifikante variationer i ekspressionsniveauet af Mlig-dddx39 mellem kontrolprøverne i løbet af eksperimentet (Fig. 6). Samtidig blev der for de Mlig-dddx39 dsRNA-behandlede dyr observeret et fald på ~ 80 % i niveauet af ddx39-transkriptet allerede efter et døgns behandling ved 20 °C eller 25 °C, og et endnu større fald på ~ 90 % ved 30 °C. I de efterfølgende dage stabiliserede knockdown-niveauerne sig imidlertid på omkring 95 % ved alle temperaturer. Vi konkluderer således, at kinetikken af RNAi i sig selv ikke påvirkes væsentligt af temperaturen. I stedet kan den observerede afkortning af tiden for manifestationen af Mlig-ddx39 RNAi-fenotypen ved højere temperaturer forklares ved den øgede celleomsætningshastighed.

For at teste, om accelerationen af udviklingen af RNAi-fenotyper ved forhøjede temperaturer kan generaliseres til andre gener, undersøgte vi Mlig-sperm1-genet, knockdown af hvilket fører til unormal sædmorfologi og forstørrede testikler . Dette er en langsom RNAi-fenotype, som det tager 2-3 uger at udvikle sig ved 20 °C . For at kvantificere fænotypens omfang ved forskellige temperaturer talte vi på dag 4 efter RNAi-behandlingen den andel af dyrene, hvis testikler var så forstørrede, at de rørte hinanden. (Fig. 7). I lighed med resultaterne med Mlig-ddx39 RNAi resulterede højere temperaturer i en hurtigere udvikling af fænotypen, og mens der ikke blev observeret tilstrækkeligt forstørrede testikler efter fire dages dsRNA-behandling ved 20 °C, havde 25 og 85 % af dyrene udviklet forstørrede testikler ved henholdsvis 25 °C og 30 °C (tabel 2). I lighed med regenerering kan RNAi-fenotyper derfor fremskyndes med temperaturen i M. lignano, og højere temperaturer kan bruges til at forkorte forsøgsvarigheden.