Laboratoriemedicin har gjort betydelige fremskridt i løbet af de sidste to årtier. Virusbelastningsanalyser har udviklet sig fra nested PCR-analyser til transkriptionsmedieret amplifikation til realtids-PCR og fortsætter med at udvikle sig med metoder som digital PCR. Disse fremskridt har resulteret i mere følsomme virusbelastningsanalyser med et bredere dynamisk område, hvilket giver lægerne en bedre forståelse af patientens respons på behandling og sygdomsudvikling.
Et eksempel på forbedret patientbehandling med fremskridt inden for molekylær diagnostik har været behandlingen af HIV-1-patienter. Ifølge de nuværende behandlingsretningslinjer defineres behandlingssucces som HIV-1 RNA-koncentration under 75 kopier/mL.1 Definitionen af behandlingssvigt varierer alt efter globale, nationale og landespecifikke retningslinjer, men defineres normalt som HIV-1 RNA-koncentration mellem 50-1000 kopier/mL.1-3
Disse behandlingsgrænseværdier ligger i den lave ende af det dynamiske område for realtids-PCR-assays, hvor præcision og reproducerbarhed kan være udfordret. Faktorer, der kan påvirke viralbelastningsassayets ydeevne, er den automatiserede platform, kemi til ekstraktion af nukleinsyre, valg og udformning af PCR-primere/sonder, PCR-amplifikationsbetingelser og assaykalibreringsstrategi. Her vil vi gennemgå forskellige designtilgange og deres potentielle indvirkning på analysens ydeevne og det kliniske resultat. (Figur 1)
Ekstraktionsproces
Man bør nøje overveje prøvetype og analysand, når man vælger ekstraktionskemi. For eksempel anbefaler Department of Health and Human Services (DHHS) i tilfælde af HIV-1, at HIV-1 RNA bør anvendes som en markør for HIV-1 viremi.1
Denne forskel mellem HIV-1 RNA og proviral DNA er vigtig, da sidstnævnte ikke er en markør for aktiv viral replikation, men snarere for latent reservoir frigivelse fra virussen, som allerede er blevet integreret i cellerne. En ekstraktionskemi, der renser både HIV-1 RNA og proviralt DNA, ville ikke give lægen en nøjagtig repræsentation af den sande virale replikation; derfor bør der i forbindelse med denne virus kun anvendes ekstraktionskemi, der specifikt renser HIV-1 RNA, for at udelukke proviralt DNA fra nedstrøms kvantificering.
Alternativt kan brugen af total nukleinsyreekstraktionskemi (TNA) til kvantificering af HIV-1 potentielt føre til falsk-positive resultater eller unøjagtig kvantificering, hvilket vil have negative virkninger på patientbehandlingen. TNA-ekstraktionskemi kan anvendes til vanskeligere prøvetyper som f.eks. urin eller afføring eller til analyser, der skal påvise både RNA/DNA-mål.
Målvalg
Den ekstreme virale diversitet, der findes blandt HIV-, HBV- og HCV-stammer, er af største betydning for at sikre, at molekylærdiagnostiske (MDx) test giver det korrekte resultat, uanset hvilken(n) stamme(r) der er til stede i en prøve.
For at imødegå denne bekymring bør det optimale assaydesign starte med valg af primer/sondermål i et genetisk konservativt område, hvor den virale diversitet vil have den mindste potentielle indvirkning. De genetisk konservative regioner kan kun bestemmes ved at sammenligne sekvenser fra forskellige virusstammer.
For at opfylde dette behov er et globalt overvågningsprogram afgørende for en omfattende vurdering af den eksisterende virale diversitet i cirkulation for hiv-, HBV- og HCV-stammer.4 I et overvågningsprogram anvendes sekvenser genereret fra stammer indsamlet i geografisk forskellige regioner til at bestemme, hvilke regioner af et viralt genom der er mest velbevarede og egnede til påvisning med en molekylær diagnostisk test. Ved at anvende cirkulerende virale sekvenser som grundlag for udformningen af assays reduceres risikoen for, at stammer overses af en test, betydeligt.
Sondeudformning og PCR-cyklusbetingelser
Ud over udvælgelsen af målregionen er sondeudformning og PCR-cyklusbetingelser afgørende for at sikre en nøjagtig kvantificering af viral belastning. Sondesign skal være tolerant over for naturligt forekommende polymorfismer og dermed potentielle mismatches, der kan forekomme inden for den givne målregion. Med tiden har sonde-teknologien udviklet sig, og det samme gælder PCR-metodologien. Den bredere vifte af MDx-applikationer baseret på PCR-teknologi ud over viral kvantificering kræver anvendelse af forskellige probe-designs. Minor groove-bindingssonder anvendes typisk til genotypebestemmelse og påvisning af enkeltnukleotidpolymorphisme.
TaqMan-sonder anvendes ofte i assays, hvor målområderne har en høj grad af bevarelse. Delvis dobbeltstrengede sonder, som er bedre til at tolerere høje niveauer af genetisk heterogenitet, hovedsagelig på grund af sondens længde og bindingsbetingelser, anvendes på områder, hvor der er en høj grad af heterogenitet5 .
Ud over sondedesignet er cyklingsbetingelserne ofte genstand for designoptimering for at opnå præstationskravet (f.eks. tolerance over for potentielle mismatches.) Fasetilpasset cykling er en metode, der inkorporerer cyklusser ved en lavere temperatur for at reducere den indledende stringens, som efterfølges af cyklusser ved høje temperaturer for at bevare specificiteten. Denne fremgangsmåde mindsker den negative virkning på prøvekvantiteringen af potentielle primermismatches. I tilfælde, hvor det er vanskeligt at undgå den betydelige virkning af sjældne polymorfismer, kan detektion af et andet mål indarbejdes i assaydesignet. Når sekvensdiversitet påvirker påvisningen af en region af det virale genom, sikrer påvisning af en anden region, at der opnås et nøjagtigt resultat. I betragtning af de molekylære assays’ kompleksitet og den store virale diversitet bør der ved udformningen af molekylære assays overvejes en omfattende tilgang, hvor der anvendes global overvågning og målspecifik sondeudformning. Hvis man blot tilpasser en strategi som f.eks. dual-target-strategi, kan det give en falsk følelse af sikkerhed.
Kalibreringsstrategi
Kalibreringsstrategien er en integreret del af udformningen af molekylære assays og er afgørende for at sikre reproducerbarhed over et bredt dynamisk område. De fleste kvantitative metoder til terapistyring anvender i øjeblikket en ekstern kalibreringskurve til at bestemme koncentrationen af en analysand.
I disse assays sammenlignes analyt-signalet i en patientprøve med et sæt prøver med en kendt koncentration, og der anvendes en simpel lineær regression (y=mx+b) til at beregne virusbelastningen. Denne fremgangsmåde anvender typisk kalibratorer, der behandles som patientprøver gennem hele processen, hvilket giver mulighed for kalibrering af både ekstraktions- og amplifikationsreagenser og instrumenter.
Alternativt kunne der anvendes kalibratorer, der ikke behandles gennem ekstraktionen, men denne fremgangsmåde indebærer en risiko for, at der ikke tages højde for forskelle i genvinding eller en ændring i reagenssammensætningen, hvilket potentielt kan føre til forskelle i kvantificeringen.
En anden mindre hyppigt anvendt strategi er en intern kvantitativ standard. Ved denne anvendelse anvendes en polynomiel regressionslinje af 3. orden (y = ax3 + bx2 + cx + d) over det lineære område med en tilladt maksimal forskel fra lineariteten. Tidligere undersøgelser har antydet, at den acceptable tilladte forskel fra linearitet for nogle af analyserne var ± 0,2 Log10.6 Denne tilladte forskel fra linearitet og kalibreringstilgangen forklarer også den bias, der ofte observeres mellem metoderne, samt større upræcision i den lave ende af det dynamiske område, hvor der ofte træffes kliniske beslutninger.
Slutning
En nøjagtig og præcis molekylær analysepræstation er afgørende for en hensigtsmæssig terapistyring. Upræcise virusbelastningsresultater kan føre til uhensigtsmæssig behandling, og patienten kan blive efterladt i en fejlslagen behandling. Denne fejldiagnose har langt større konsekvenser end behandlingen af en enkelt patient, da den også kan føre til en øget overførsel af den resistente virusstamme. Ud fra et terapiforvaltningsperspektiv er en virus med mutationer, der er forbundet med resistens, mere udfordrende at behandle med snævrere behandlingsmuligheder. Desuden kan falsk-positive tal medføre unødvendige omkostninger til gentagne test eller dyrere resistensundersøgelser samt angst for patienten og lægen.
- Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Adults and Adolescents with HIV udarbejdet af Department of Health and Human Services. https://aidsinfo.nih.gov/guidelines). Tilgået september 2019.
- European AIDS Clinical Society (EACS). EACS Guidelines Version 9.1 oktober 2018.
- National Department of Health, South Africa, april 2015, tilgået 2. august 2017: https://aidsfree.usaid.gov/sites/default/files/tx_south-africa_pmtct_2015.pdf.
- Brennan CA, Bodelle P, Coffey R, et al. HIV global surveillance: fundament for retroviral discovery and assay development. Journal of medical virology. 2006;78 Suppl 1:S24-29.
- Luk KC, Devare SG, Hackett JR, Jr. Delvis dobbeltstrengede lineære DNA-sonder: nyt design til følsom påvisning af genetisk polymorfe mål. Journal of Virological Methods. 2007;144(1-2):1-11.
- Vermehren J, Colucci G, Gohl P, et al. Udvikling af en anden version af den kvantitative Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan test for hepatitis C-virus med forbedret genotypeinklusivitet. Journal of Clinical Microbiology. 2011;49(9):3309-3315.
Anerkendelse: Forfatteren vil gerne anerkende og takke Mary Rodgers og Shihai Huang for deres gennemgang af denne artikel.