Alai

RTT fibroblaster viser en defekt autofagiaktivering under sultbetingelser

For at verificere hypotesen om en defekt autofagi hos RTT-patienter, analyserede vi autofagi-aktivering under sultforhold i primære hudfibroblaster isoleret fra RTT-patienter (n = 4) og raske personer (n = 4)17,19.

Vi definerede først levedygtigheden over tid af raske og RTT-fibroblaster dyrket i sultemedium ved hjælp af både MTT- og Trypanblå-eksklusionstest. Med hensyn til levedygtigheden af RTT-fibroblaster dyrket i standardmedium faldt RTT-fibroblasternes levedygtighed efter 4 timers sult (20 ± 3,3 % af døende celler, p < 0,05); denne procentdel steg betydeligt efter 6-8 timers sult (60 ± 5,1 % af døende celler, p < 0,05) (Fig. 1a). Omvendt var sunde fibroblaster stadig fuldt levedygtige efter 4 timers sult med kun en meget lav reduktion i levedygtighed efter 6-8 timer (10 ± 1,2 % af døende celler, p < 0,01) med hensyn til levedygtigheden af fibroblaster dyrket i standardmedium (Fig. 1a). Således fremgik det af en direkte sammenligning af de to cellelinjers levedygtighed på hvert tidspunkt, at levedygtigheden af RTT-fibroblaster var alvorligt kompromitteret fra tidspunktet 4 h (se detaljer i figurens legender, p < 0,05). Desuden fremhævede en Western Blotting (WB)-analyse, at i RTT-fibroblaster, der var blevet udsultet i 4 h, var et bånd svarende til p25-fragmentet af poly (ADP-ribose)polymerase-1 (PARP) stærkt forøget (96 ± 4 %, p < 0,001) i forhold til den svage påvisning på tidspunkt 0. Dette fragment frigives ved den caspaseafhængige nedbrydning af proteinet i den tidlige fase af apoptoseinduktion (fig. 1b)35. P25-fragmentet var næsten ikke påviseligt i de raske fibroblaster under de samme forsøgsbetingelser.

Disse data bekræftede, at RTT-fibroblaster ikke tolererede vækst i et sultende medium og hurtigt gennemgik apoptose. Derfor undersøgte vi yderligere den autofagiske flux ved at overvåge LC3B-II-markørens clearance i tilstedeværelse og i fravær af en lysosomhæmmer, såsom chloroquin (CQ)24,25,26,27,27,28,29,30.

Efter at have udelukket en CQ-relateret cytotoksisk virkning (Supplerende fig. S1) blev raske og RTT-fibroblaster dyrket enten i hvilemedier eller i sultemedier i 2 timer i tilstedeværelse eller fravær af 20 µM CQ for at kvantificere LC3B-II/GAPDH-forholdet ved WB (fig. 2a). Mønstret for LC3B-II/GAPDH-forholdet (eller enhver anden intern kontrol, som ikke moduleres af autofagi) under betingelser for autofagi-aktivering og i tilstedeværelse og fravær af CQ (eller enhver anden lysosomal inhibitor) betragtes som en gyldig strategi til overvågning af autofagiflowet.

I sunde fibroblaster, dyrket i standardmedium, blev LC3B-I klart immuno-detekteret, mens LC3B-II var svagt. LC3BII/GAPDH-forholdet i sunde fibroblaster dyrket i standardmedium i fravær og i tilstedeværelse af CQ var sammenlignelige (fig. 2a, venstre panel). Denne observation tyder på, at den basale autofagi var næsten ikke påviselig i de raske fibroblaster (Fig. 2a, venstre panel).

Når disse celler blev dyrket i sultemedium og i fravær af CQ i 2 timer, steg LC3B-II/GAPDH-forholdet (60 ± 4.8 %, p < 0,05) sammenlignet med det for sunde fibroblaster dyrket i standardmedium enten i fravær eller tilstedeværelse af CQ (som som tidligere nævnt var identisk) (Fig. 2a, venstre og højre panel). Denne adfærd indikerer faktisk, at LC3-I faktisk undergik lipidering for at danne LC3B-II, som er en tidlig markør for autofagieaktivering24,25,26,27,27,28,29,30. For at teste tilstedeværelsen af denne autofagi-aktivering dyrkede vi celler i et sultemedium i tilstedeværelse af CQ i 2 timer, og de viste en yderligere stigning i LC3B-II/GAPDH-forholdet (94 ± 5,5 %, p < 0,001) i forhold til sunde fibroblaster dyrket i standardmedium (fig. 2a, venstre og højre panel).

Dertil kommer, at forskellen mellem LC3B-II/GAPDH-forholdet i sunde fibroblaster dyrket i sultemedium i fravær og i tilstedeværelse af CQ var statistisk signifikant (p < 0,05, Fig. 2a, venstre panel)

Så ifølge standardfortolkningen af LC3B-II-mønstret ved WB-analyse tyder det samlede resultat på, at sunde fibroblaster i fravær af næringsstoffer stimulerer dannelsen af autofagosomer, som undergår akkumulering i nærvær af CQ. Denne adfærd er forenelig med en normal autofagisk flux24,25,26,26,27,28,29,30. Det er interessant, at i tilfælde af RTT-fibroblaster dyrket i standardmedium var LC3B-I klart immundetekteret, mens LC3B-II var meget svagt i cellerne både i fravær og i tilstedeværelse af CQ (fig. 2a, venstre panel). Under sultbetingelser og i fravær af CQ viste et svagt bånd svarende til LC3B-II i RTT-fibroblaster først efter lang tids eksponering af filteret, at der i det mindste fandt en minimal lipidering af LC3B-I sted (fig. 2a, venstre panel). Derfor var LC3B-II/GAPDH-forholdet mellem RTT-fibroblaster dyrket i sultemedium i fravær af CQ forøget (93 ± 5,5 %, p < 0,001) i forhold til forholdet mellem RTT-fibroblaster dyrket i standardmedium i fravær af CQ (Fig. 2a, højre panel).

Derimod øgede administration af CQ til RTT-fibroblaster dyrket i sultemedium ikke yderligere LC3B-II/GAPDH-forholdet, som blev øget (95 ± 3,5 %, p < 0,001) sammenlignet med celler dyrket i standardmedium i fravær af CQ, men var ikke signifikant øget i forhold til LC3B-II/GAPDH-forholdet hos RTT-fibroblaster dyrket i sultemedium i fravær af CQ (fig. 2a, venstre panel). Dette resultat tyder på, at der ikke sker nogen ophobning af autofagosomer i RTT-celler, og WB-analysen understøttede en blokering på et vist niveau i autofagiflowet24,25,26,27,28,29,30,31.

For yderligere at styrke vores hypotese om et muligt defekt autofagiflow, verificerede vi nedbrydningen af to anerkendte autofagireporter-substrater i raske og RTT-fibroblaster, der sultede i 2 og 4 timer i fravær af CQ, nemlig: (i) p62/SQSMT1-proteinet, som hjælper med at fjerne polyubiquitinerede proteinaggregater og selv nedbrydes af de lysosomale hydrolaser36; (ii) 20 S-proteasomet, som hurtigt nedbrydes under sultforhold37,38. Med hensyn til basalniveauet af de to proteiner (dvs. tidspunkt 0) blev der observeret et fald over tid af forholdet p62/tubulin (44 ± 10 % efter 4 timer, p < 0,001) og af forholdet PSMA-3/GAPDH (dvs. α7-underenheden af 20 S-proteasomet) (45 ± 3,1 % efter 2 timer, 11 ± 5,2 % efter 4 timer, i begge tilfælde p < 0,001) i sunde fibroblaster (fig. 2b, øverste panel).

For RTT-fibroblaster var faldet i p62/tubulin-forholdet over tid ikke statistisk signifikant, selv efter 4 h (89 ± 9 %), mens faldet i PSMA3/GAPDH-forholdet efter 2 h (81 ± 4,4 %, p < 0,05) og 4 h (78 ± 5,1 %, p < 0,05) var signifikant forskelligt, hvis det blev sammenlignet med proteinets basalniveau (dvs. tidspunkt 0) (Fig. 2b, nederste panel). Forskellene mellem de raske og RTT-grupperne var imidlertid kun statistisk signifikante for p62/tubulin-forholdet ved 4 h (p < 0,05), hvorimod PSMA3/GAPDH-forholdet var signifikant forskelligt mellem forsøgsgrupperne både ved 2 h (p < 0.05) og 4 h (p < 0,001) (Fig. 2b, nederste panel).

Interessant nok var β-tubulin- og GAPDH-mønstrene, der blev anvendt som interne kontroller for henholdsvis p62-farvning og PSMA3-farvning, uændrede i løbet af 4 h sult i sunde fibroblaster. Intensiteten af β-tubulinbåndet samt GAPDH-båndet faldt imidlertid betydeligt i RTT-fibroblaster, der var udsultet i 4 timer, sammenlignet med det, der blev observeret på tidspunkt 0 eller tidspunkt 2 timer for disse celler (Fig. 2b, øverste panel). Denne reduktion skyldtes sandsynligvis det lavere antal levende RTT-fibroblaster, der blev høstet på dette tidspunkt (i overensstemmelse med den ringe levedygtighed af RTT-fibroblaster ved 4 h sultning, der er rapporteret i Fig. 1a), og ikke på grund af en nedregulering af β-tubulin over tid. Som helhed blev det konstateret, at RTT-fibroblaster ikke effektivt nedbrød disse autofagireporter-substrater, hvilket understøtter hypotesen om en defekt autofagi.

For at kaste yderligere lys over kendetegnene ved denne blokering udførte vi en immunofluorescensanalyse ved hjælp af LC3B-antistoffet. Vi analyserede raske og RTT-fibroblaster, der var dyrket i standardmedium i fravær af CQ (hviletilstand) og i sultmedium i 2 timer i tilstedeværelse eller fravær af 20 µM CQ (Fig. 2c). I overensstemmelse med de primære cellers langsomme metaboliske hastighed fandt vi, at raske og RTT-fibroblaster i hvile udviste en svag og diffus LC3B+ farvning med en lav procentdel af cellerne med mere end 10 prikker (dvs. autofagosomer) (henholdsvis 8 ± 5 % og 1 ± 0,5 %), hvilket indikerer, at basal autofagi ved immunfluorescens kun i ringe grad kunne påvises i overensstemmelse med de data, der er rapporteret i Fig. 2a.

Med hensyn til celler dyrket i standardmedium var procentdelen af sunde fibroblaster dyrket i sultemedium (i fravær af CQ), der viste mindst 10 LC3B+ autofagosomer, markant forøget (82 ± 10 %, p < 0,005), mens RTT-fibroblaster dyrket i sultemedium viste en svag stigning (17 ± 8 %, p < 0,001). Faktisk var procentdelen af sunde fibroblaster dyrket i sultemedium, der viste mindst 10 autofagosomer, betydeligt højere end procentdelen af RTT-fibroblaster dyrket under samme forsøgsbetingelse (p < 0,005). Autofagosomerne var hovedsageligt lokaliseret til den perinukleære region. I tilstedeværelse af CQ blev der endvidere observeret en forventet diffus og intens LC3B+ farvning, selv om den diffuse farvning i dette tilfælde ikke gjorde det muligt præcist at kvantificere antallet af prikker.

Givelse af CQ var ineffektiv i RTT-fibroblaster, hvilket klart indikerer en alvorligt forringet autofagosombiogenese (Fig. 2c).

Givet relevansen af den formodede forringelse af autofagosombiogenese blev der valgt en yderligere fremgangsmåde for at bekræfte denne observation. Både raske og RTT-fibroblaster, sultet i 2 timer i fravær af CQ, blev farvet med et specifikt farvestof (Cyto-ID) for autofagosomale membraner og analyseret ved immunofluorescens. Selv i dette tilfælde, hvor der i sunde fibroblaster faktisk blev påvist adskillige autofagosomer, blev der i RTT-fibroblaster kun observeret et begrænset antal små og isolerede vesikler (Supplerende fig. S2). Forskellen i procentdelen af celler, der viste mindst 5 Cyto-ID-positive prikker mellem raske og RTT-fibroblaster, var markant signifikant (henholdsvis 80 ± 4% vs. 8 ± 6%, p < 0,001). Den samlede analyse gav derfor bevis for, at der forekommer en defekt autofagosombiogenese i RTT-primære fibroblaster.

Mature RBC’er fra RTT-patienter, der bærer R255X MeCP2-mutationen, bevarer mitokondrier

Vi forsøgte derefter at afgøre, om der kunne observeres yderligere tegn på defekt autofagi ex vivo hos RTT-patienter. På grund af det faktum, at mitokondrierydning er en klassisk autofagibaseret mekanisme, der forekommer i cirkulerende reticulocytter i den sidste fase af modningen til RBC’er32,33,34 , udvidede vi vores undersøgelse også til ex vivo humane RBC’er for at verificere, om mitokondrier bibeholdes i disse celler.

Dermed blev RBC’er fra RTT-patienter (n = 15) og fra raske donorer (n = 11) analyseret ved transmissionselektronmikroskopi (TEM). TEM-undersøgelsen fremhævede tilstedeværelsen af strukturer, der ligner mitokondrier (SRM) i bikonkave formede RBC’er, der var isoleret fra størstedelen af RTT-patienterne (11 ud af 15). Blandt disse 11 RTT-patienter udviste tre af dem den alvorligste kohorte af symptomer og også en høj frekvens af RBC’er (20 ± 4 %) (fig. 3a-h) (fig. 3a-h). Som forventet var SRM ikke påviselige i raske RBC’er (fig. 3I). Forskellene mellem raske og RTT-personerne var statistisk signifikante (p < 0,0004; Fig. 3, nederste panel).

Symptomernes sværhedsgrad var dog baseret på den kliniske vurdering, og de tre patienter med de mest alvorlige symptomer bar alle R255X-mutationen i MeCP2-genet, som er forbundet med en alvorlig prognose39.

Som en konsekvens heraf og i betragtning af, at vi ikke havde mulighed for at indskrive et større antal forsøgspersoner med andre mutationer, der har en lav eller nul frekvens af mitokondrieholdige RBC’er, fokuserede vi vores opmærksomhed på analysen af disse tre patienter. TEM-analysen dokumenterede i de tre ovennævnte tilfælde tilstedeværelsen af strukturer, der lignede intakte eller delvist fordøjede mitokondrier (enten elektrontætte eller gennemsigtige), som var normalt eller dumbbell (aflange) formede og generelt små med svage cristae (fig. 3a-h). Faktisk viste størrelsen og den overordnede form af disse strukturer sig at være i overensstemmelse med dem af mitokondrier, der blev tilbageholdt i modne RBC’er i ikke-RTT murinmodeller af defekt makroautofagi (dvs. Ulk1-/-mus) eller mitofagi (dvs. Nix-/-mus), der er rapporteret af andre forfattere32,33. Interessant nok er de morfologiske ændringer af mitokondrier, som vi observerede, såsom den reducerede dimension, den langstrakte (dvs. dumbbell-formede) struktur og især tilstedeværelsen af svage cristae, allerede blevet beskrevet i musklerne og i lillehjernen hos RTT-patienter20,21. For at bekræfte SRM’s mitokondrielle identitet farvede vi RBC’er fra raske donorer og disse RTT-patienter med alvorlige symptomer med et anti-COX-IV (cytokrom c oxidase)-antistof. Et statistisk signifikant antal RBC’er fra de tre RTT-patienter i sammenligning med RBC’er fra raske forsøgspersoner(henholdsvis 35 ± 5 % vs. 0,2 ± 0,01 %, p < 0,005) viste et COX-IV+ prikket mønster, hvilket tydede på mitokondrieretention (Fig. 4). Det gennemsnitlige indhold af mitokondrier pr. celle blev beregnet til at være 1,2 ± 0,2 organeller pr. RBC hos RTT-patienter og 0,002 ± 0,0002 hos raske personer (p < 0,005) (Fig. 4). Forskelle i procentdelen af RBC’er med mitokondrier mellem TEM- og IF-undersøgelserne kan skyldes, at muligheden for at påvise organellerne ved TEM er strengt afhængig af tyndt snit af cellen, hvilket kan hindre deres tilstedeværelse, hvorimod IF-tilgangen ikke er begrænset på denne måde.

For yderligere at bekræfte disse resultater udførte vi en cytofluorimetrisk analyse af RBC’erne fra både raske personer og de tre RTT-patienter ved hjælp af et anti-CD71 (transferrinreceptor) og anti-COX-IV antistoffer. Hyppigheden af CD71-positivitet, en markør for umodne RBC’er, var ikke signifikant forskellig hos raske og RTT-patienter (1,34 ± 0,13 % vs. 1,03 ± 0,3 %; Supplerende fig. S3). Det skal understreges, at de RTT-patienter, der indgik i undersøgelsen, udviste normale hæmatologiske parametre, og selv om reticulocytindekset i det mindste hos et par personer var lavere end hos raske personer, var de samlede forskelle mellem de to patientgrupper ikke statistisk signifikante (Tabel 1). Omvendt blev der observeret en meget svag COX-IV+ population i raske RBC’er, mens der blev påvist en højere frekvens af COX-IV+ celler i RTT RBC’er (henholdsvis 0,056 ± 0,004 % vs. 1,15 ± 0,19 %, p < 0,01). Disse resultater blev yderligere bekræftet ved brug af Mitotracker Green (MT) farvning (Supplerende Fig. S3), der dokumenterede en stigning af MT+ RBC’er i en RTT-patient (med R255X MeCP2-mutationen) vs. en rask patient (0.37% vs. 0.16%), svarende til det observerede med det tidligere beskrevne COX-IV-antistof.

For yderligere at validere SRM’s identitet blev et lige stort antal RBC’er lyseret og analyseret ved WB under denaturerende og reducerende betingelser. Filtrene blev farvet med antistoffer mod sirtuin-3, en de-acetylase, der specifikt udtrykkes i mitokondriematrixen40. Sirtuin3 blev valgt som en mitokondriel markør i denne metode, fordi dens molekylvægt i modsætning til COX-IV og andre mitokondrielle markører ikke overlapper med hæmoglobinkædernes eller hæmoglobinoligomerernes molekylvægt i det elektroforetiske mønster. Hos de tre undersøgte RTT-patienter blev der observeret en statistisk signifikant stigning i sirtuin-3/GAPDH-forholdet for hver patient i forhold til det samme forhold i lysater fra raske RBC’er (p < 0. 001) (Supplerende fig. S4).

Disse tre patienter, der alle var bærere af MeCP2-mutationen (dvs. R255X), udviste den værste fænotype med en meget høj procentdel af RBC’erne, der viste mindst 1 mitokondri. Det meget begrænsede antal patienter, som vi havde til rådighed, gjorde det imidlertid vanskeligt at drage nogen statistisk signifikant konklusion med hensyn til muligheden af en sammenhæng mellem sygdommens sværhedsgrad og omfanget af mitokondriel tilbageholdelse i modne RBC’er. Et andet punkt, som synes at være værd at nævne, er, at retention af mitokondrier inde i modne RBC’er i de tidligere citerede Ulk1-/- og Nix-/- murinmodeller førte til anæmi eller andre blodpatologier, der sandsynligvis er bestemt af den øgede clearance af disse unormale erytrocytter af miltmakrofager32,33. Hos de RTT-patienter, der indgik i denne undersøgelse, blev der kun registreret et meget begrænset og ikke statistisk signifikant fald i de hæmatologiske værdier, og de syntes ikke at være anæmiske eller at lide af andre blodpatologier. Diskrepansen mellem vores resultater og resultaterne fra murinmodellerne kan skyldes, at knock-down af makroautofagi- eller mitofagi-gener (dvs. henholdsvis Ulk1-/- og Nix-/- mus) inducerer en meget høj procentdel af mitokondrieretenderende RBC’er og tilbageholdelse af flere organeller i RBC’er, hvilket er en betydeligt mere alvorlig defekt sammenlignet med den, der er dokumenteret hos RTT-patienter32,33. Selv om vi observerede et betydeligt højt antal mitokondrieretenderende RBC’er hos patienter, der bærer R255X-mutationen (Fig. 4), var antallet af organeller i hver celle meget lavt i RTT-RBC’er (Fig. 4). Dette er muligvis ikke nok til at fremkalde større morfologiske og funktionelle ændringer i RBC’er. Det er værd at nævne, at selv om mitokondriernes tilbageholdelse i RBC’er kunne være mindst én faktor, der er bestemmende for den alvorlige redoxubalance, der er observeret i RTT RBC’er i forbindelse med en betydelig ændring af energitilstand og metabolisme (dvs, ATP/ADP og NADH/NAD-forholdet), rapporterede nyere undersøgelser, at kinetikken for iltbindinger til hæmoglobin og iltdiffusion næsten overlapper kinetikken hos raske patienter16,17,23,41.

Den tilsyneladende uoverensstemmelse mellem vores resultater og dem, der stammer fra murinmodeller, kan også finde en forklaring i det forhold, at RTT-syndromet er en X-bundet lidelse, der næsten udelukkende rammer det kvindelige køn, og at inaktivering af en af de to kopier af X-kromosomet (XCI) er et tilfældigt fænomen, der forekommer under embryogenesen, hvilket er veldokumenteret42,43. I tilfælde af RTT-syndromet forventes det således, at den tilfældige XCI i somatiske celler vil medføre en mosaikisme, hvor halvdelen af cellerne udtrykker wild-type-allelen, mens den resterende halvdel udtrykker den muterede allel af MeCP2-genet. Interessant nok er muligheden for, at i det mindste nogle MeCP2-mutationer kan være forbundet med en ikke-tilfældig XCI i neuronalt væv, i overensstemmelse med den fænotypiske variabilitet hos RTT-patienter (og også for de velkendte tilfælde af RTT), en egenskab, som er blevet udførligt dokumenteret42,43. Teoretisk set, hvis halvdelen af de hæmatologiske progenitorer i knoglemarven beholder X-kromosomet med MeCP2-mutationen, vil kun halvdelen af de cirkulerende modne RBC’er bære den patologiske allel, hvilket begrænser antallet af cirkulerende RBC’er med mitokondrier, der beholder mitokondrier. Ikke desto mindre er der i cirkulerende leukocytter hos sporadiske RTT-patienter42,43 blevet observeret en øget prævalens af ikke-tilfældig XCI til fordel for wild-type-allelen. Med hensyn til dette punkt ville det være meget udfordrende at tage stilling til, om de patienter, der viser eller ikke viser et lavt antal mitokondrieretenderende RBC’er, også viser en mindre betydelig forringelse af mitofagi eller den ikke-vilkårlige XCI, hvilket ville føre til en positiv udvælgelse af hæmatologiske progenitorer, der bærer wild-type MeCP2-allelen.

I betragtning af kompleksiteten af RTT-patologien foretrækker vi derfor at hævde, at RTT-patienterne sammen med de patienter, der er ramt af Pearson-syndromet, kunne repræsentere de første tilfælde af mitokondrieretention i menneskelige modne RBC’er44.

Evidens for defekt autofagi i lillehjernen hos Mecp2-null-mus

I betragtning af at RTT er en neuroudviklingsforstyrrelse, udførte vi for yderligere at understøtte vores resultater, der peger i retning af en systemisk defekt autofagi, immunohistokemiske analyser for p62 og ubiquitin i lillehjernen (i.dvs. et organ, hvor der er blevet observeret mitokondrieforandringer og andre større histologiske abnormiteter)21,45 af 9 uger gamle vildtype mus og 5 uger gamle (asymptomatiske) og 9 uger gamle (symptomatiske) Mecp2 -/y mus. For hver forsøgsbetingelse blev organet isoleret fra tre dyr analyseret. Sammenlignet med wt viste RTT-cerebellum en stigning i intensiteten af p62- (Fig. 5a) og Ub- (Fig. 5b) farvning i alle lag (dvs. granula, Purkinje- og kortikale lag), som var lineær med dyrenes alder. Desuden lignede de hyperfarvede strukturer intracellulære aggregater. I henhold til den semikvantitative evaluering af intensiteten af farvningen af enten p62/SQSTM1 og Ub var forskellene mellem cerebellum hos 5-ugers dyr vs. raske dyr og hos 9-ugers dyr vs. 5-ugers dyr statistisk signifikante (p < 0.05).

Den histologiske forskel mellem asymptomatiske og symptomatiske dyr tyder på, at autofagiforandringen kunne være fraværende eller svag ved fødslen, mens den gradvist øges i løbet af de første leveuger (og muligvis når MeCP2-aktiviteten når et højdepunkt), hvilket giver anledning til symptomerne.