Alai

Abstract

Rheumatoid arthritis (RA) er en autoimmun sygdom. Vaskegift (WV), der betragtes som en traditionel folkemedicin i Jingpo-nationaliteten i Yunnan, Kina, lindrer reumatoid arthritis. Den aktuelle undersøgelse havde til formål at undersøge effekten af hvepsegift, der forbedrer symptomerne på reumatoid arthritis hos forsøgsrotter. Vi etablerede en model af type II kollagen- (CII-) induceret arthritis (CIA) i SD rotter og undersøgte inhiberingen af inflammation og autoimmun respons. De antiarthritiske virkninger af WV blev evalueret gennem potehævelse, og histopatologisk score og histopatologiske ændringer af den berørte pote blev vurderet. De antiinflammatoriske virkninger blev vurderet ved hjælp af niveauet af IL-6, TNF-α, IL-1β og antallet af inflammatoriske celler i perifert blod. Ændringen af T-celleundergruppeforholdet i milten hos rotterne blev påvist ved flowcytometri, og samtidig blev viscera-indekset og immunserumglobulinniveauerne evalueret. Resultaterne tydede på, at forskellige doser WV (0,125, 0,25 og 0,5 mg/kg) signifikant lindrede potehævelse og gigtscore hos CIA-rotter i forhold til den ubehandlede kontrol (). WV (0,25 og 0,5 mg/kg) lindrede synovialvævslæsioner i ankelleddene og histopatologiske scorer for synoviocythyperplasi og inflammatorisk celleinfiltration i forhold til køretøjsgruppen (). Med hensyn til immunologisk regulering sænkede 0,5 mg/kg WV immunserumglobulinniveauerne (), og vi fandt endvidere, at WV (0,5 mg/kg) undertrykte Th-cellernes immunrespons, mens det forbedrede funktionerne af Tc-celler og Treg-celler i miltceller markant (). Den viste immunosuppressive virkning af WV var analog med dens hæmmende virkning på IL-1β-, TNF-α-, IL-8-, IL-6-, COX-2 og PGE2-niveauerne i rotteserum. Sammenfattende viste disse resultater, at WV udviste antiartritisk aktivitet, som kan være forbundet med deres hæmmende virkninger på immunoregulering og antiinflammatorisk virkning.

1. Introduktion

Rheumatoid arthritis (RA) er en kronisk autoimmun sygdom, der kan udvikle sig til systemiske komplikationer, fysiske handicaps og endda tidlig død . Hyperplasi af synovialcellerne, kronisk inflammation i synovien og ødelæggelse af brusk og knogle er de vigtigste kendetegn ved RA. Desuden spiller de synergistiske virkninger af T-celler, B-celler og proinflammatoriske cytokiner også en central rolle i den patofysiologiske proces . Når CD4+ T-celler aktiveres, producerer de proinflammatoriske cytokiner, der forstærker immunresponset ved at stimulere andre mononukleære celler, synoviale fibroblaster, chondrocytter og osteoklaster. Frigivelsen af disse proinflammatoriske cytokiner, især TNF-α, IL-6 og IL-1β, kan bidrage til synovitis .

I øjeblikket fokuserer de kliniske behandlingsmidler, der anvendes til behandling af RA, primært på at reducere inflammatoriske mediatorer, såsom ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler (NSAID’er), sygdomsmodificerende antirheumatiske lægemidler (DMARD’er) og biologiske midler. F.eks. blev folatanalogen methotrexat (MTX), som er et NSAID, godkendt af FDA til behandling af RA i 1988 . Desuden er det blevet det mest udbredte middel til behandling af RA på grund af dets immunosuppressive aktivitet, antiinflammatoriske virkning og lave pris . MTX er imidlertid ikke et ideelt terapeutisk middel på grund af dets uønskede bivirkninger på det neuronale, gastrointestinale og immunsystem, og det samme gælder andre lægemidler . Derfor søger et stigende antal mennesker efter nye alternativer for at afhjælpe disse lægemidlers ineffektivitet og sikkerhed. I traditionel kinesisk medicin (TCM) teori anses RA for at være et af arthralgisyndromet (“Bi Zheng” i TCM), muligvis forårsaget af eksogene vind, fugt og varme- eller kuldepatogener . Anvendelsen af TCM til forebyggelse og behandling af sygdomme har en historie på flere århundreder, stigende betydning i RA-behandling tilskrives dens bemærkelsesværdige effektivitet, men færre bivirkninger og omkostninger .

Venomterapi, som en komplementær og alternativ medicin tilgang, er blevet brugt i flere århundreder til behandling af smerte, inflammation og gigt i folkemedicin . Så tidligt som i Warring States-perioden er der i den Gule Kejserens indre kanon (“Huangdi Neijing” på kinesisk) en optegnelse om, at “bistik er terapeutisk på trods af den giftige risiko, der er pådraget”. Ifølge moderne medicinsk forskning har bi-gift (BV) antiartritiske, antiinflammatoriske og smertestillende virkninger, der kan tilskrives aktivering af det centrale hæmmende system og modulering af immunsystemet gennem flere mekanismer . Flere kliniske forsøg har også vist, at BV kunne forbedre gigtrelaterede symptomer .

Bivegift indeholder en række biologisk aktive bestanddele, herunder biogene aminer, stoffer med højmolekylær masse (såsom enzymer, allergener og bioaktive peptider) og polyamintoksiner. Vaskegift udviste forskellige farmakologiske virkninger i behandlingen af smerte, inflammatoriske sygdomme og neurodegenerative sygdomme . Vespa magnifica (Smith) er en slags social hveps, der findes i Yunnan, Kina . I de seneste år er mange forbindelser med antikoagulerende, trombocythæmmende, antiinflammatoriske og immunosupprimerende aktiviteter blevet udskilt fra deres gift . Baseret på dens bemærkelsesværdige virkning på reumatoid arthritis er det blevet en vane at blive bredt anvendt i Jingpo, et kinesisk nationalt mindretal . Ikke desto mindre har der, så vidt vi ved, kun været få rapporter om antirheumatiske virkninger af hvepsegift.

I det nuværende arbejde blev den kollageninducerede arthritis (CIA) model vedtaget for nøje at replikere patogenesen af RA. Ændringer i potevolumen er klassisk blevet brugt til at evaluere antiinflammatoriske virkninger på RA som sædvanlig . Desuden vurderede vi virkningen af WV (hvepsegift af Vespa magnifica) i den samme model. Endelig blev WV’s effektivitet på antiinflammatorisk og immunmodulation observeret ved H&E farvning af ledvæv, flowcytometri af T-celleundergrupper i milten samt ELISA af serum IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-8, COX-2, PGE2 og reumatoide faktorer (IgG, IgA og IgM).

2. Materialer og metoder

2.1. Forsøgsdyr

Hanlige SD-rotter (60 rotter, 180-220 g) blev anskaffet fra Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co., Ltd. Dyrene blev opstaldet i standardiserede polypropylenbure foret med råhusk (fornyet efter 48 timer). Dyrehuset blev holdt ved en 12 timers lys/mørkecyklus ved ca. 22 ± 2 °C og en relativ luftfugtighed på 60-70 %, og dyrene havde fri adgang til vand og standardfoder. Rotterne blev tilfældigt fordelt på 8 kontroller og 52 modeller, og der blev givet mindst 7 dage til at vænne sig til hvert forsøg. Alle forsøgsprocedurer blev udført i overensstemmelse med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Institutes of Health) og godkendt af den etiske komité ved Dali University.

2.2. Dyremodel for CIA og behandlingsprotokol

Rotter blev desinficeret med alkohol og subkutant injiceret på højre vola pedis, ryg og hale med 1 mg/ml CCII (kylling type II kollagen) emulgator til den første immunisering, som består af CCII (C9301, Sigma) emulgeret 1 : 1 med ufuldstændig Freund’s adjuvans (F5506, Sigma). Induktionsdagen blev fastsat som dag 0. Booster-dosis blev injiceret igen på maven, ryggen og halen sammen med 1 ml CCII-emulgator på dag 8. Den injicerede fod blev defineret som den inflammatoriske fod, mens den anden fod uden injektion blev noteret som den sekundære fod. Derefter blev de kollageninducerede arthritis (CIA)-rotter behandlet på dag 14 og afsluttet på dag 28. Efter indtræden af CIA blev modelrotterne tilfældigt inddelt i fem grupper i henhold til de kliniske scorer. Gruppe I: modelgruppe, som fik en hypodermisk injektion (1 ml/kg) af normal saltvand som vehikel. Gruppe II-IV: CIA-rotter fik en hypodermisk injektion af henholdsvis 0,125, 0,25 og 0,5 mg/kg WV (hvepsegift fra Vespa magnifica (Smith) i Yunnan, Kina, frysetørret pulver fremstillet af eksudat fra hvepsehalekirtler, fortyndet med normal saltvand) som behandlingsgrupper. Gruppe V: positiv kontrolgruppe fik TwHF (Tripterygium wilfordii Hook F, nr. 20181001, Huangshi Feiyun Pharmaceutical Co., Ltd.) på 9 mg/kg på samme måde. Samtidig blev den samme mængde normal saltvand alene givet til de normale rotter i kontrolgruppen. De ovennævnte rotter fik alle en daglig indgift i 14 dage.

2.3. Grundlæggende evaluering af eksperimentel arthritis

Sværhedsgraden af CIA blev periodisk evalueret på grundlag af potehævelse og arthritis-scores. Rotter blev vejet på dag 0-28 i undersøgelsen, og tykkelsen og omkredsen af anklerne i den inflammatoriske fod (højre fod) og den sekundære fod (venstre fod) blev målt separat ved hjælp af en måler og et målebånd på dag 0, 14 og 28. Gigtscoren blev vurderet på grundlag af uafhængige observationer af tre forskere. Hver pote blev scoret på en skala fra 0-4, hvilket betyder, at den maksimale samlede score for begge bagpoterled var 8. Vurderingskriterierne var som følger: 0 = intet ødem eller nogen visuelle ændringer; 1 = let ødem og begrænset erytem; 2 = let ødem og erytem; 3 = tydeligt ødem og betydelig erytem; og 4 = alvorligt ødem og omfattende erytem . På dag 28 blev dyrene aflivet, og derefter blev serum og de sekundære ankelleddene indsamlet og behandlet med henblik på yderligere analyse.

2.4. Histopatologi af ankelleddet

De venstre baglår uden udtagning af nabovæv blev straks vasket med PBS 2-3 gange, fikseret med 10 % formalin i 48 timer og afkalket med 5 % salpetersyre i 24 timer, indtil knoglekortexen let blev kørt igennem med en nålespids. Prøverne blev indlejret i paraffinsnit og skåret i skiver (5 μm) til rutinemæssig hæmatoxylin-eosin (H&E)-farvning. Patologiske ændringer i leddene blev påvist med et lysmikroskop (Olympus, Japan) og fotograferet. Billederne blev taget ved en forstørrelse på 200x. Der blev også påvist ændringer i synoviocythyperplasi og inflammatorisk celleinfiltration. Histopatologiske ændringer blev scoret efter henholdsvis følgende kriterier 0 = ingen påviselige ændringer; 1 = lette; 2 = moderate; 3 = alvorlige .

2,5. Analyse af Viscera Index

Råtter blev ofret, og komplet lever, milt og thymus blev reseceret med omgivende fedtvæv og fascie omhyggeligt adskilt. Den våde masse af lever, milt og thymus blev målt ved hjælp af en elektronisk vægt, og viscera-indekset (herunder leverindeks, miltindeks og thymusindeks) blev beregnet i henhold til følgende formel. Viskeraindeks = organmasse (mg)/kropsmasse (g) × 100 %.

2,6. ELISA’er af serumbiokemiske indekser

Serummet fra forsøgsrotter blev indsamlet, og koncentrationerne af TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, COX-2 og PGE2 blev påvist ved hjælp af enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits (Nanjing JianCheng, Kina) i henhold til producentens anvisninger. ELISA-kits til påvisning af ekspressionsniveauet for IgA (ERC015), IgG (ERC016) og IgM (ERC017) blev købt fra NeoBioscience Co., Ltd., Shenzhen, Kina.

2.7. Flowcytometri af milten med gigt

Antal af T-celleundergrupper blev påvist ved hjælp af flowcytometri. Lymfocytter blev høstet fra rottemiltenceller, som blev homogeniseret ved at passere gennem en 200 mesh nylonsiver. Cellerne blev filtreret i PBS-buffer indeholdende 10 % føtal bovin serum. Cellekoncentrationen blev justeret til ca. 2 × 106/ml, og der blev tilsat 3 ml lysisbuffer til røde blodlegemer (Solarbio, Kina) for at opløse røde blodlegemer i mindre end 5 minutter. Derefter blev cellerne centrifugeret ved 1200 rpm i 5 min, vasket to gange med FBS-PBS-buffer, som indeholder 10 % føtal bovin serum, og derefter centrifugeret ved 1200 rpm i 5 min. Hver 100 μL cellesuspension blev anbragt i centrifugerør. Lymfocytterne blev fulgt ved farvning med anti-CD3-FITC (nr. 557354; BD, USA), anti-CD4-APC (nr. 565432; BD, USA), anti-CD8-PerCP (nr. 558824; BD, USA) og anti-CD25-PE (nr. 554866; BD, USA). De monoklonale antistoffer blev tilsat til hvert rør, blandet igen og ladt stå på is i 30 minutter. FBS-PBS-buffer (1 ml) blev tilsat til hvert prøverør og centrifugeret ved 1200 rpm i 5 minutter, hvorefter supernatanten blev opgivet. Det foregående trin blev gentaget to gange, således at cellerne uden binding til monoklonale antistoffer blev elueret helt ud. Forsøgscellerne blev blandet med 500 μL FBS-PBS-buffer. Forholdet mellem CD25+/CD4+ og CD4+/CD8+ T-celler blev bestemt ved hjælp af et FACS Canto Flow-cytometer (BD, USA) .

2,8. Statistiske analyser

Data blev statistisk analyseret ved hjælp af SPSS10.0. Dataene blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse af middelværdien (S.D.M.). Betydningen af forskellene mellem de enkelte grupper blev analyseret ved envejs ANOVA efterfulgt af en Tukey-test. Især blev arthritis-scoren og den histopatologiske score analyseret ved hjælp af Wilcoxon-ranksummetest. Værdier på blev betragtet som statistisk signifikante.

3. Resultater

3.1. WV lindrede symptomerne på arthritis hos CIA-rotter

De arthritiske symptomer blev med succes induceret hos rotter ved at injicere type II kollagen som instrueret, hvilket legemliggjorde betydelige makroskopiske tegn på alvorlig rødme og hævelse i den sekundære pote og ankelleddet hos CIA-rotter i figur1(a), hvis de sammenlignes med den sunde kontrolgruppe. Ankelledets tykkelse og omkreds var tilsyneladende øget i køretøjer på dag 14 (figur 1(b)) sammenlignet med kontrolgrupperne; de var imidlertid markant nedsat efter TwHF og alle WV-behandlede grupper på dag 28 sammenlignet med dem i modelgruppen (alle ) (figur 1(b)). Da vi målte tykkelsen og omkredsen af ankelleddene i både den inflammatoriske fod og den sekundære fod, blev den tydelige hævelsessænkning vist på baggrund af dataene (Figur 1(b)). Resultaterne af hævelsesgraden viste, at WV kunne kontrollere poteødem og lindre den sekundære betændelse på pote og ankelled svarende til TwHF-effekten.

(a)

(b)
(b)
(b)

(c)

(a)(b)
(b)
(c)

Figur 1

Effekt af WV på gigtsymptomer i hver gruppe. (a) Hævelsesgrad af poterne i alle grupper. (b) Tykkelsen og omkredsen af ankelleddene både i den inflammatoriske fod og den sekundære fod blandt alle grupper. (c) Sammenligning af gigtscore blandt alle grupper.

Dertil kommer, at gigtscoren blev reduceret med varierende grad gennem behandlingen med WV afhængigt af dosismængden, som vist i figur 1(c). Gigtscoren i vehicle-gruppen var 6,5 ± 1,0 på dag 14 (vs. dag 0, ). Indekset var signifikant nedsat i gruppen, der blev behandlet med TwHF på dag 28, med 2,8 ± 0,8 (i forhold til dag 14, ). Tilsvarende var faldet i indekser ved WV signifikant og dosisafhængigt (3,2 ± 0,6 ved 0,5 mg/kg, 4,3 ± 0,7 ved 0,25 mg/kg og 5,6 ± 0,7 ved 0,125 mg/kg) (severt vs. 14 dage, ). Dette indikerede, at virkningen af WV ved 0,5 mg/kg svarede til virkningen af den gruppe, der blev behandlet med TwHF.

3,2. WV afhjælper de patologiske ændringer af leddene hos CIA-rotter

H&E farvning (Figur 2(a)) viste, at synovialmembranen i ankelleddene fra kontrolrotterne havde et regelmæssigt cellulært arrangement, uden synoviocythyperplasi, inflammatorisk celleinfiltration og en glat bruskoverflade. Til sammenligning var den histologiske arkitektur af leddene hos rotterne fra køretøjsgruppen markant unormal med infiltration af immunceller, synoviocythyperplasi, øget antal kar og erosion af brusk og knogle. Leddene i TwHF- og WV-grupperne var signifikant svækkede i forhold til leddene i køretøjsgruppen og bevægede sig i retning af leddene i kontrolgruppen. Histopatologiske scorer (figur 2(b)) indikerede (køretøjsgruppen) den unormale synovialforingscelle og infiltration af inflammatoriske celler i arthritiske led; TwHF- og WV-behandlinger sænkede signifikant den gennemsnitlige histopatologiske score og genoprettede brusk i forhold til køretøjsgruppen ().

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 2

Effekter af WV på arthritis-progression og ledhistologi hos CIA-rotter. (a) Histopatologi af ledvævsafsnit af CIA-rotter behandlet med forskellige doser af WV og TwHF og normale rotter ved H&E farvning. Original forstørrelse ×200. a, knogledestruktion; b, infiltration af immunceller; c, hypertrofisk synovium. (b) Histopatologiske scorer for synoviocythyperplasi og inflammatorisk celleinfiltration i alle grupper. , når sammenlignet med kontrolgruppen; , når sammenlignet med vehicle-gruppen.

3.3. Virkninger af WV på Viscera-indeks og immunserumglobulinniveauer hos CIA-rotter

Sammenlignet med kontrolgruppen faldt leverindekset i køretøjsgruppen signifikant (), og WV (0,25 og 0,5 mg/kg) steg markant (). Sammenlignet med kontrolgruppen steg miltindekset og thymusindekset i vehicle-gruppen markant (); TwHF og WV spillede en hæmmende effekt på dem, der især afspejledes i effekten af 0,5 mg/kg dosis WV på thymusindekset (figur 3(a)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 3

Effekter af WV på visceralindekset og immunserumglobulinniveauet hos CIA-rotter. (a) Ændringer i milt-, thymus- og leverindeks i alle grupper. (b) Udtrykket IgG-, IgA- og IgM-niveauer i serum i alle grupper. , sammenlignet med kontrolgruppen; , sammenlignet med køretøjsgruppen.

Ekspressionen af IgG-, IgA- og IgM-niveauerne blev forbedret dramatisk hos CIA-rotter () sammenlignet med kontrol, mens de blev lavere efter TwHF-behandling (). Og niveauerne af serum-IgG blev nedsat i WV-gruppen (0,5 mg/kg) sammenlignet med vehicle-gruppen (). Denne hæmning blev også anvendt på IgA og IgM i WV-grupperne (0,25 og 0,5 mg/kg) (figur 3(b)).

3.4. Virkninger af WV på T-celle-subsæt i milten hos CIA-rotter

Tallet af CD4+ T-celler steg signifikant i vehikelgrupperne sammenlignet med kontrolgruppen (), mens antallet i TwHF- og WV-grupperne (0,5 mg/kg) var signifikant lavere end i vehikelgruppen (Figur 4(a)). Sammenlignet med kontrolgruppen blev antallet af CD4+CD25+ T-celler i køretøjsgruppen signifikant nedsat (), mens de var signifikant forøget i TwHF- og WV (0,5 mg/kg)-grupperne (), men ikke indlysende i de andre grupper (figur 4(a)). Sammenlignet med kontrolgruppen var reduktionen i køretøjsgruppen af antallet af CD8+ T-celler bemærkelsesværdig, men kun WV (0,125 og 0,25 mg/kg) fik antallet til at stige (, ) i figur 4(b).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 4

Antal af T-celleundergrupper i miltceller ved flowcytometri. (a) Resultaterne af FCM vedrørende antallet af Th-celler og Tc-celler (venstre); resultaterne af FCM vedrørende antallet af Treg-celler (højre). (b) Søjlediagrammet viste den negative virkning af WV og TwHF på Th-celler og den positive virkning på Tc-celler og Treg-celler. , sammenlignet med kontrolgruppen; , sammenlignet med køretøjsgruppen.

3,5. WV regulerede serumcytokiner og mediatorer i CIA-rotter

ELISA-sæt (figur 5) viste, at sammenlignet med kontrolgruppen var serumniveauerne af IL-1β, TNF-α, IL-6, PGE2, COX-2 og IL-8 signifikant forhøjet i køretøjsgruppen og blev markant genoprettet af TwHF (9 mg/kg) og WV (0,5 mg/kg) (). I mellemtiden blev udtrykkene af IL-6 og PGE2 undertrykt af 0,125 og 0,25 mg/kg dosering af WV (). WV (0,125 og 0,25 mg/kg) reducerede på samme måde ekspressionen af COX-2 og IL-8 sammenlignet med vehikel (, ). Dette indikerede, at CCII-induceret inflammation sandsynligvis medierede de patologiske ændringer, der blev set hos de gigtramte rotter, og WV kunne afhjælpe det inflammatoriske respons.

Figur 5

Effekter af WV på IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, PGE2 og COX-2 niveauer i CIA rotteserum. , sammenlignet med kontrolgruppen; , sammenlignet med køretøjsgruppen.

4. Diskussion

Ra er en kronisk autoimmun sygdom karakteriseret ved smerter, hævelse og gradvis ødelæggelse af leddene, hvilket resulterer i tab af funktion . cSelv om methotrexat (MTX) tabletter er offen betragtes som en behandlingsmedicin til reumatoid arthritis , er de normalt forbundet med bivirkninger (ADR) . Derfor søgte vi at evaluere, om hvepsegift (WV) kunne repræsentere et potentielt alternativt lægemiddel til RA.

Den nuværende undersøgelse var den første, så vidt vi ved, til at undersøge den terapeutiske rolle af WV (fra Vespa magnifica) i kollageninduceret arthritis (CIA) induceret i SD rotter og sammenlignet med den klinisk dokumenterede effekt af TwHF. Tripterygium wilfordii Hook F (TwHF), også kendt som Lei Gong Teng i TCM, er blevet brugt til behandling af RA i mange år i Kina, og ekstrakterne af TwHF har vist antiinflammatoriske og immunosuppressive aktiviteter både in vivo og in vitro-undersøgelser . Vi etablerede modellen af CIA-rotter i 14 dage og fjernede 12 tilsyneladende inkompetence, der muligvis skyldtes injektionsfejl, fra 52 rotter, dvs. CIA-rotterne havde en 77 % gigtprocent. Kontrolgruppen viste ikke tegn på hverken ødem eller inflammation (figur 1 og 5), og vores resultater er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser af RA og CIA, som rapporterede, at CCII-emulgator inducerede sværhedsgraden af ødem og inflammatorisk skade i leddene . Derefter lignede de forbedrede symptomer i WV-gruppen (0,5 mg/kg) dem af det positive lægemiddel TwHF, som er blevet rapporteret til at hæmme det inflammatoriske respons af RA , men effekten af lav dosis var ikke signifikant på hævelse reduktion og hæmning af IL-1β og TNF-α (figur 1 og 5). Desuden bemærkede vi, at rotterne i køretøjsgruppen havde grovere pels og dårligere mental tilstand end rotterne i kontrolgruppen; disse forhold var blevet så meget desto bedre i behandlingsgruppen.

For yderligere at evaluere den terapeutiske virkning af WV blev H&E farvning udført i vævsprøver af venstre bagreste ankelled for at analysere den patologiske funktion, og vi fandt, at synoviale celler forårsager inflammation, proliferation og invasion af lokaliseret brusk og knogle i køretøjsgruppen (Figur 2), og disse makroskopiske ændringer er i overensstemmelse med tidligere rapporter . Desuden reducerede TwHF og WV-behandling i 14 dage signifikant synovialcellehyperplasi og inflammatorisk celleinfiltration sammenlignet med ubehandlet (Figur 2). Kronisk synovitis er det patologiske grundlag for RA . Den synoviale inflammation drives af et komplekst samspil mellem synoviocytter og infiltrerende celler fra det medfødte og adaptive immunsystem . Derfor blev det viscerale indeks for immunorganer såsom milt og thymus beregnet i dette forsøg. Det er værd at nævne, at vi ikke fandt den signifikante forskel i vægt mellem vehikel- og behandlingsgruppen; derfor brugte vi det repræsentative viscera-indeks til at afspejle rotternes generelle helbred. Vi fandt, at TwHF og WV kunne mindske stigningen i visceralindekset for milt og thymus hos CIA-rotter (figur 3(a)); dette kan afspejle deres rolle i at lindre den immunforstærkning forårsaget af RA. Vi bemærkede også ændringen i leverindekset under denne proces; vores resultater viste, at TwHF ikke genoplivede leverindekset, selv om dets behandling var effektiv, hvilket mindede os om dets toksicitet for leveren i tidligere rapport . Heldigvis blev dette ikke fundet i WV-gruppen (figur 3(a)). Med undtagelse af nedsat leverindeks i vehicle- og TwHF-gruppen blev der ikke observeret nogen bivirkninger hos disse rotter, hvilket kan skyldes den lave dosis, vi anvendte. Derudover påviste vi også reumatoide faktorer (RF), som en diagnostisk markør for RA, hovedsagelig inklusive IgG-, IgA- og IgM-isotyper; det har en høj påvisningsrate hos patienter med RA . Denne undersøgelse viste, at ubehandlede CIA-rotter havde signifikant højere niveauer af IgG-, IgA- og IgM-antistoffer i serum end dem i TwHF- og WV-grupperne (Figur 3(b)); disse resultater stemte godt overens med de kliniske data som rapporteret. Det kunne således ses, at TwHF og WV (0,5 mg/kg) kunne nedregulere det overdrevne autoimmune respons hos CIA-rotter til et niveau tæt på det normale. I modsætning hertil var effekten af WV (0,125 og 0,25 mg/kg) ikke indlysende, mens det endnu ikke er klart, om en højere dosis vil forbedre effekten snarere end at virke som en gift, så vi fokuserede stadig på disse tre doser for at undersøge effekten af WV på RA i dette eksperiment.

Tidligere forskning har vist, at synovial inflammation rekrutterer og aktiverer immunceller ved at producere mediatorer, og T-celler spiller afgørende roller i reguleringen af RA . Med hensyn til de proinflammatoriske cytokiners roller i autoimmunitet er det vigtigt at overveje balancen mellem forskellige T-celleundergrupper, der hovedsagelig er opdelt i to hypotyper i henhold til deres funktion og fænotyper: CD4+ hjælpe-T-celler (Th-celler) og CD8+ cytotoksiske T-celler (Tc-celler). Th-celler og Tc-celler, der er kendetegnet ved produktion af forskellige specifikke cytokiner, letter det adaptive immunrespons . Derimod har CD4+CD25+ T-celler (Treg-celler) en central funktion i opretholdelsen af immuntolerance ved at kontrollere inflammatoriske reaktioner og undertrykke aktiviteten af de ovennævnte immunceller . I denne undersøgelse fandt vi en stor koncentration af Th- og Tc-celler i miltcellerne og bemærkede også nedsat funktion af Treg-celler i CIA-rotter. Heldigvis blev balancen mellem T-celleundergrupperne beskyttet med TwHF- og WV-behandling (figur 4). Det er værd at bemærke, at ophobning af immunceller fremmer lokal ledbetændelse, og de aktiverede immunceller frigiver en stor mængde proinflammatoriske cytokiner, som derefter inducerer aktivering og proliferation af synovialceller og yderligere forværrer progressionen af ledbetændelse . Tidligere undersøgelser har vist, at IL-6 er det mest dominerende cytokin i patogenesen af RA , og der er fundet overdrevne mængder af IL-1β samt TNF-α og IL-8 i synovialvæsken hos RA-patienter . Produktionen af COX-2 og PGE2 efter stimulering med IL-1β er også steget, og blokering af dem lindrede symptomerne på RA betydeligt . Lignende resultater blev observeret i vores eksperimentelle resultater, og vi bekræftede, at TwHF og WV (0,5 mg/kg) effektivt kunne reducere niveauerne af IL-6, IL-8, PGE2 og COX-2; også de øgede koncentrationer af IL-1β og TNF-α induceret af RA blev undertrykt, undtagen for WV (0,125 og 0.25 mg/kg) grupper (Figur 5).

Disse resultater tyder på, at WV har funktionerne til at lindre ledsvulst, hæmme synovial inflammation, undertrykke overdreven immunrespons og beskytte immunhomeostase, hvilket kan forbedre symptomerne og blive effektive midler mod RA. Det er blevet rapporteret, at hvepsegift indeholder en række bioaktive molekyler, herunder aminer, små peptider og endda enzymer, allergener og toksiner af høj molekylær masse . Det, der adskiller WV fra BV, er, at BV hovedsagelig har antiinflammatoriske, antioxidative og smertestillende virkninger på RA, og det indeholder en række forskellige peptider, herunder melittin, phospholipase A2, apamin osv. Mekanismerne til behandling af RA med disse to giftstoffer kan være forskellige og er værd at undersøge yderligere. Selv om der ikke blev observeret nogen bivirkninger i intervallet 0,125 til 0,5 mg/kg WV, var det nødvendigt med en yderligere evaluering af de aktive ingredienser og sikkerheden ved WV-ekstrakt.

5. Konklusioner

Wasp gift lindrede synovial hyperplasi og bruskdestruktion forårsaget af CIA, muligvis på grund af reduktionen af den proinflammatoriske faktor og immunoregulerende effekt. Denne undersøgelse viste, at hvepsegift kunne have været et potentielt terapeutisk alternativ til RA. Ud over at være en folkeopskrift i mange år fortjener WV yderligere undersøgelse for at blive opdaget, udforsket og anerkendt.

Datatilgængelighed

De data, der er anvendt til at understøtte resultaterne af denne undersøgelse, er inkluderet i artiklen og kan gøres frit tilgængelige.

Etisk godkendelse

Undersøgelsen blev godkendt af den institutionelle komité for pleje og brug af dyr (IACUC) ved Dali University.

Interessekonflikter

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter i forbindelse med offentliggørelsen af denne artikel.

Autors bidrag

YG skrev manuskriptet og bistod i konstruktionen og grupperingen af dyremodeller. WXY og HL udførte H&E-farvning og flowcytometri. XMD og LLN var ansvarlige for ELISA-kits. ZBY, HRZ og HX bidrog i høj grad til at skrive manuskriptet. ZBY og CGZ administrerede og overvågede projektet. Alle forfattere læste og godkendte det endelige manuskript.

Anerkendelser

En del af dette arbejde blev støttet af Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics. Den foreliggende undersøgelse blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (tilskud nr. 81360679 og 81703742), Yunnan Applied Basic Research for Young Scholars (tilskud nr. 2016FD074), Natural Science Foundation of Yunnan Province (tilskud nr. 2017FA050), og Dali University Innovation Team of Advanced Pharmaceutics of Entomological Bio-Pharmacy R&D (tilskud nr. ZKLX2019101).