Diskussion
Ein wichtiger Parameter bei HELM ist der Winkel α des Strahls zur optischen Achse, der die Raumfrequenz der Anregung u bestimmt.
Der gewählte Wert (55°) ist ein guter Kompromiss und ermöglicht zudem die direkte Beobachtung des Interferenzmusters mit Immersionsobjektiven.
Aufgrund des nicht-isotropen Durchlassbereichs zeigen die Bilder der Perlen eine gewisse Anisotropie und ein Überschießen in der Nähe der Kanten der Perlen; am auffälligsten sind die dunklen Zonen in den diagonalen Richtungen in Abb. 2A. Dieser Effekt könnte durch die Verwendung von sechs oder acht Laserstrahlen, die in Vielfachen von 60° bzw. 45° ausgerichtet sind, weitgehend vermieden werden.‡
Im Vergleich zu CFM ist das Signal-Rausch-Verhältnis des HELM-Bildes besser, obwohl die zeitintegrierte Laserleistung für das CFM-Bild in Abb. 2C mehr als 100 Mal höher war. Ein wesentlicher Grund für diese Verbesserung liegt in der Tatsache, dass die Auflösungsverbesserung der CFM im Vergleich zur Standard-Fluoreszenzmikroskopie nur durch die Verwendung einer kleinen Lochblende im Emissionslichtweg erreicht werden kann (5, 13, 14). Diese Anordnung erfordert einen Kompromiss zwischen Rauschpegel und Auflösung. Im Gegensatz dazu können bei HELM alle Photonen, die in die Linsen eintreten, von der Kamera erfasst werden.
Für Studien an dynamischen Objekten ist die Abbildungsgeschwindigkeit von großer Bedeutung. Die grundlegende Begrenzung der Abbildungsgeschwindigkeit in der Fluoreszenzmikroskopie ist durch die maximale Emissionsrate der Fluorophore gegeben, die durch die endliche Lebensdauer des angeregten Zustands verursacht wird („Farbstoffsättigung“; Ref. 15). Bei HELM wird etwa die Hälfte der Fluorophore gleichzeitig durch das Interferenzmuster beleuchtet, während bei der üblichen Einzelpunkt-CFM nur ein winziger Bruchteil der Fluorophore gleichzeitig beleuchtet wird (≈1 pro Million für ein 1.024 × 1.024-Pixel-Bild). Infolgedessen ist der gesamte Photonenfluss von der Probe auf Werte begrenzt, die beim sequentiellen Betrieb von CFM um mehrere Größenordnungen geringer sind als beim parallelen Betrieb von HELM. Da für ein bestimmtes Signal-Rausch-Verhältnis eine Mindestanzahl von Photonen pro Bild erforderlich ist, hat HELM das Potenzial, Bilddaten viel schneller zu erfassen als CFM. Zusätzlich zu dieser grundlegenden Überlegung reduziert HELM die Geschwindigkeitsprobleme, die mit mechanischen Abtastmechanismen verbunden sind, da nur fünf Abtastungen pro Bild durchgeführt werden, im Gegensatz zu CFM, wo eine Abtastung pro Zeile erforderlich ist. Sowohl das Problem der Farbstoffsättigung als auch die Schwierigkeiten der mechanischen Abtastung bei CFM können jedoch durch die neueren Mehrpunkt-Scanner verringert werden.
Die Vorteile im Bereich der Abbildungsgeschwindigkeit lassen sich auch an unseren experimentellen Daten ablesen. Die Gesamtaufnahmezeit für die fünf für HELM benötigten Bilder (Abb. 2A) betrug 1,6 s im Vergleich zu 6,5 s für das konfokale Bild (Abb. 2C). Berücksichtigt man das höhere Signal-Rausch-Verhältnis des HELM-Bildes, das mit einer ungekühlten Industrie-CCD-Kamera erreicht wird, ist der Unterschied deutlich.
Ein Punkt von praktischem Interesse ist die erforderliche Stabilität des Interferenzmusters während der Messung. Wir haben festgestellt, dass Phasenverschiebungsfehler von 1/10 des Knotenabstands (20 nm) gerade noch tolerierbar sind, aber größere Fehler führen zu erheblichen Bildverschlechterungen. Die thermische Drift unseres Aufbaus (typischerweise 20 nm/min in einem nicht temperaturkontrollierten Raum) begrenzt die Aufnahmezeit auf einige zehn Sekunden. Diese Einschränkung könnte jedoch leicht durch eine Neukalibrierung der Phasenverschiebungen während einer Langzeitmessung überwunden werden. Die Heterogenität des Brechungsindex der Probe führt ebenfalls zu unerwünschten Phasenfehlern des Interferenzmusters, die in diesem Fall raumabhängig sind. Um diese Fehler auf tolerierbare Werte zu begrenzen, sollten die durch die Brechungsindexheterogenität verursachten Wellenfrontverzerrungen einige zehn Nanometer nicht überschreiten. Wir gehen davon aus, dass sich die Anforderungen an HELM nicht wesentlich von denen unterscheiden, die eine hochauflösende Abbildung mit gut korrigierten Objektiven mit hohem NA in der Standardmikroskopie gewährleisten. Weitere experimentelle Daten werden erforderlich sein, um die Empfindlichkeit von HELM gegenüber Brechungsindex-Heterogenität in der Praxis zu untersuchen.
Für viele Anwendungen ist die Untersuchung der dreidimensionalen Struktur der Probe von großem Interesse. Dreidimensionale Bilddaten können durch schrittweises Bewegen des Fokus durch die markierte (16) oder unmarkierte Probe (17, 18) gewonnen werden. Leider ist die axiale Auflösung der Standard-Fluoreszenzmikroskopie bei punktförmigen Objekten stark auf etwa 0,9 μm begrenzt und kann bei willkürlichen Objekten sogar ganz zusammenbrechen (19). Dieses Problem ist darauf zurückzuführen, dass die dreidimensionale OTF einen fehlenden Kegel um die kz-Achse im Ursprung aufweist, so dass das resultierende dreidimensionale Bild potenzielle Artefakte aufweist. Die CFM hingegen hat keinen fehlenden Kegel und ermöglicht die Aufnahme dreidimensionaler Bilder mit einer axialen Auflösung von etwa 0,8 μm (20), die jedoch immer noch schlechter ist als die laterale Auflösung.
Es wurden verschiedene Methoden beschrieben, um die axiale Auflösung weiter zu verbessern. Das sogenannte 4π-Mikroskop (21) ist eine Abwandlung des CFM mit einem zweiten Objektiv, das auch die Photonen auffängt, die sich in Richtung der Rückseite der Probenkammer ausbreiten. Die axiale Auflösung kann theoretisch bis zu 100 nm betragen, während das laterale Auflösungsvermögen dem des CFM entspricht. Das 4π-Mikroskop ist ebenfalls ein Scanning-Mikroskop.
Ein Non-Scanning-Verfahren wird in Ref. 22 und 23 beschrieben. Ein stark erhöhtes axiales Trennvermögen wird durch ein Interferenzfeld erreicht, dessen Knoten- und Antinodenebenen parallel zur Bildebene liegen. Diese Methode eignet sich gut für Objekte, die dünner als eine Periode des Anregungsmusters sind. Die Abbildung dickerer Proben kann zu Artefakten führen, da das resultierende Durchlassband immer noch einen fehlenden Kegel am Ursprung aufweist (9).
Eine weitere Entwicklung, die Aspekte der letztgenannten Methode und der 4π-Mikroskopie gemeinsam hat, wurde kürzlich demonstriert (I5M-Mikroskopie; Ref. 24). Die I5M-Mikroskopie verwendet ein komplizierteres Interferenzfeld, das von einer nichtkohärenten Lichtquelle erzeugt wird, um die Objektebene selektiv zu beleuchten, und ist ein Non-Scanning-Verfahren. Die axiale Auflösung entspricht der der 4π-Mikroskopie (100 nm), die laterale Auflösung wird jedoch nicht erhöht.
Eine verbesserte axiale Auflösung kann auch erreicht werden, indem die Probe mit einem Streifenmuster beleuchtet wird, das z. B. durch Abbildung eines Gitters auf das Objekt (25) oder durch Interferenz zweier Laserstrahlen (26) erzeugt wird. Bei diesen Methoden unterscheidet sich der angewandte Rekonstruktionsalgorithmus deutlich von unserem, da der zentrale Transmissionskreis in Abb. 4 wegfällt und die Objektinformation nur in zwei Seitenbändern übertragen wird (27). Es kann gezeigt werden, dass in diesem Fall die Unschärfe reduziert wird.
Wünschenswert ist ein Mikroskop mit einer gleichmäßig hohen Auflösung von 100 nm in allen Raumrichtungen, ohne dass ein Scanning-Verfahren erforderlich ist. HELM, wie in unserem aktuellen Aufbau etabliert, erhöht die axiale Auflösung im Vergleich zur Standard-Fluoreszenzmikroskopie nicht. Die Schlüsselidee ist jedoch, dass die harmonische Anregung zusammen mit einem Rekonstruktionsalgorithmus, der dem hier beschriebenen ähnelt, auch in Raumrichtungen funktioniert, die nicht parallel zur Objektebene verlaufen. Durch die Verwendung von harmonischen Intensitätsmustern, deren Knoten- und Antinodenebenen in geeigneten Raumrichtungen liegen, erhält man zusätzliche Kopien der dreidimensionalen OTF in jeder gewünschten Richtung. Solche zusätzlichen Durchlassbereiche könnten zu einem erweiterten Durchlassbereich mit einer hohen Grenzfrequenz im gesamten reziproken Raum überlagert werden.
Unsere Idee für einen zukünftigen Aufbau ist die Verwendung kontinuierlicher Strahlablenkungseinheiten (wie Galvanometer oder akusto-optische Geräte), um Interferenzmuster in ausgewählten Orientierungen im Raum und mit verschiedenen Knotenabständen leicht zu erzeugen. Eine solche Konfiguration würde eine dreidimensionale Abbildung ermöglichen und gleichzeitig die Anisotropieprobleme lösen, die durch die kleeblattförmige zweidimensionale OTF verursacht werden.