Von Willebrandin tekijä, ADAMTS13 ja tromboottinen trombosytopeeninen purppura
VWF syntetisoituu kromosomissa 12p13.31 sijaitsevasta suuresta geenistä, joka ulottuu 178 kb:n alueelle ja sisältää 52 eksonia.49 Tämän geenin tuottama sanansaattaja-RNA (mRNA) spesifioi 2813 aminohapon polypeptidin, joka sisältää 22 aminohappoa sisältävän signaalipeptidin, 742 aminohappoa sisältävän propeptidin ja 2050 aminohappoa sisältävän sekvenssin, joka muodostaa plasmasta löytyvän VWF:n monomeerisen rakennusosan. Kun signaalipeptidi on pilkkoutunut endoplasmisessa retikulumissa, propeptidiä sisältävät monomeerit ovat disulfidisidoksissa dimeereiksi ketjujen välisten disulfidisidosten avulla, joihin liittyy Cys-jäännöksiä lähellä molekyylin C-terminaalia. Nämä dimeerit kulkeutuvat sitten Golgi-laitteistoon, jossa propeptidi katalysoi dimeerien välisiä disulfidisidoksia D3-domeenin jäännösten välillä, jolloin syntyy pitkiä multimeerejä, jotka koostuvat päittäin toisiinsa linkittyneistä dimeereistä, joiden molemmissa päissä on N-päätteitä. Tämän jälkeen furiinin kaltainen entsyymi pilkkoo propeptidin, ja suurin osa syntyvästä ULVWF:stä pakataan varastorakeisiin myöhempää säänneltyä eritystä varten.
Vain kahden solutyypin tiedetään syntetisoivan VWF:ää: endoteelisolujen ja megakaryosyyttien. Endoteelisoluissa VWF varastoituu Weibel-Palade-elimiksi kutsuttuihin granuloihin; verihiutaleissa se varastoituu α-granuloihin. Suurin osa veressä olevasta VWF:stä on endoteeliperäistä. Monet ärsykkeet voivat saada aikaan endoteelin VWF:n vapautumisen, kuten adrenaliini, desamino-vasopressiini (DDAVP), histamiini, trombiini, Shiga-toksiinit ja proinflammatoriset sytokiinit, kuten tuumorinekroositekijä (TNF)-α, interleukiini (IL)-8 ja IL-6 (kompleksissa IL-6-reseptorin kanssa).50 Myös muut aineet voivat saada aikaan VWF:n vapautumisen endoteelistä, mikä antaa vihjeitä joistakin TTP:n aiheuttajista. Näihin tekijöihin kuuluvat virukset, kuten adenovirus51 , ja hapettimet, kuten superoksidi.52 Hapettimilla ei ole ainoastaan kykyä indusoida ULVWF:n eritystä, vaan ne voivat myös hapettaa VWF:n niin, että ADAMTS1353 ei voi pilkkoa sitä ja että se muuttuu adheesiokykyisemmäksi.54 Lisäksi hapettimet, erityisesti ne, joita neutrofiilit ja monosyytit tuottavat tulehduksen aikana, voivat hapettaa ratkaisevan tärkeän metioniinijäännöksen katalyyttisessä domeenissa ADAMTS13:n katalyyttisessä domeenissa ja inaktivoida entsyymin.55
Sekä endoteelisolut että verihiutaleet vapauttavat VWF-multimeerejä, jotka ovat suurempia kuin normaalissa plasmassa olevat multimeerit.56 Nämä ULVWF-multimeerit eivät ole ainoastaan paljon suurempia kuin plasmassa normaalisti esiintyvät multimeerit, vaan ne ovat myös paljon adheesiokykyisempiä ja kykenevät sitoutumaan verihiutaleiden VWF-reseptorin glykoproteiini Ib:hen (GPIbα; GPIb-IX-V-kompleksin suurin polypeptidi) spontaanisti ja suuremmalla sidoslujuudella kuin mitä saavutetaan plasman VWF:n sitoutuessa GPIbα:han modulaattoreiden ristosetiinin tai botrotetiinin läsnä ollessa.57 In vivo tämä tarkoittaa sitä, että ULVWF pystyy sitomaan verihiutaleita ilman leikkausjännitystä tai pienellä leikkausjännityksellä, kun taas prosessoitu plasman VWF vaatii suuren leikkausjännityksen aiheuttamaa taittumista sitoutuakseen verihiutaleisiin.58
Osa vastikään vapautuneesta ULVWF:stä pääsee suoraan kiertävään vereen, kun taas toinen osa jää kiinnittymään endoteeliin, jossa ULVWF:n multimeerit voivat itse assosioitua muodostaen useista sadoista mikrometreistä useisiin millimetreihin pitkiä säikeitä, jotka pysyvät ankkuroituneina endoteelin pintaan.59 Pinnalle kiinnittyneet ULVWF-jäykät säikeet ovat hyperadheesiivisia, ja ne sitovat verihiutaleita itsestään muodostaen verihiutaleiden kanssa koristeltuja säikeitä, joilla on endoteelialueen pinnalle muodostettu ”helmiä säikeitä”. Fysiologisessa leikkausrasituksessa ADAMTS13 pilkkoo verihiutaleilla koristellut ULVWF-nauhat ja poistaa ne endoteelin pinnalta. Jatkokäsittely, jota ei ole vielä täysin tunnettu, tekee VWF:stä kyvyttömän sitoutumaan spontaanisti verihiutaleisiin. Verihiutaleilla koristeltujen ULVWF-juosteiden kerääntyminen endoteelin pinnalle verenkierrossa olevan ADAMTS13:n pienentyneen määrän tai sen puuttumisen seurauksena käynnistää mikrovaskulaarisen tromboosin, joka johtaa verihiutaleilla rikastuneiden hyaliinisten trombien muodostumiseen ja laskeutumiseen mikrovaskulaatioon – tämä on TTP:n tunnusomainen piirre.
ULVWF-juosteet koostuvat VWF-multimereiden nipuista, ja kukin juoste on kiinnittynyt useista ankkurikohdista endoteelin pintaan. Ca2+:n ja Mg2+:n puuttuessa (tai pieninä pitoisuuksina) ULVWF-juosteet kiinnittyvät endoteelin pintaan sitoutumalla P-selektiiniin.60. 60 Fysiologisten kahdenarvoisten kationien pitoisuuksien läsnä ollessa ULVWF-juosteet ankkuroituvat endoteelin pintaan vuorovaikutuksen kautta integriini αvβ3:n kanssa.61 Muut molekyylit osallistuvat epäilemättä tähän VWF-juosteiden ankkurointiin, mutta toistaiseksi niitä ei ole tunnistettu.
VWF:n tai ULVWF:n multimereiden kyvystä assosioitua itseään paksummiksi kuiduiksi ja kaapeleiksi tulee tärkeä mekanismi, jolla VWF:n adheesio-ominaisuutta voidaan säädellä. Savage et al. osoittivat, että leikkausrasituksessa ja verihiutaleiden läsnä ollessa VWF-multimeerit nestefaasissa assosioituvat homotyyppisesti ja palautuvasti kollageenipinnalle immobilisoitujen VWF-multimeerien kanssa; itseassosioituneet VWF-multimeerit tukevat verihiutaleiden adheesiota leikkausrasituksessa.62 Nestefaasissa olevat VWF-multimeerit voivat assosioitua myös endoteelin pintaan kiinnittyneisiin ULVWF-juosteisiin63 , ja itseassosioitumista helpottaa VWF-molekyylien osittainen avautuminen leikkausstressin aiheuttaman leikkausstressin64,65 tai ristosetiinin sitoutumisen seurauksena66 . Itseassosioituneet VWF-multimeerit muodostavat ristisilloittuneiden kuitujen verkoston kollageenipinnoilla64 tai liuoksessa.66 Nestefaasissa olevat VWF-multimeerit voivat leikkausstressin vaikutuksesta assosioitua myös verihiutaleisiin sitoutuneiden VWF-multimeerien kanssa vuorovaikutuksessa verihiutaleiden pinnoilla olevan GPIbα:n kanssa.67 VWF:n itseassosiaatio verihiutaleiden pinnoilla voi laukaista verihiutaleiden aktivaation, edistää verihiutaleiden aggregaatiota ja tehostaa trombin kasvua.
VWF:n kyky itseassosioitua mahdollistaa sen, että se voi tuottaa säikeitä, jotka kilpailevat fibriinipolymerisaatiossa syntyvien säikeiden pituuden ja paksuuden kanssa tai ylittävät ne. Synteettisissä mikroverisuonissa, jotka on saatu erittämään VWF:ää agonistisella stimulaatiolla, verisuonen seinämästä erittyvä VWF voi yhdistyä säikeiksi, jotka kykenevät ulottumaan verisuonen luumenin yli, erityisesti haarautumiskohdissa ja kaarteissa. 68 . VWF:n kyky muodostaa näin valtavan kokoisia säikeitä ja kaapeleita ja nauhoittaa nämä kaapelit virtausreitin poikki ei ainoastaan lisää mahdollisuutta, että säikeet vangitsevat verihiutaleita, vaan myös parantaa niiden kykyä pilkkoa erytrosyyttejä skistosyyteiksi.
VWF:n itseassosioitumista säätelevät leikkausjännityksen lisäksi myös plasmatekijät, jotka todennäköisesti voivat muuttaa TTP-episodien kulkua ja vakavuutta. VWF:n itseassosiaatio heikentyy korkean tiheyden lipoproteiinin (HDL) ja HDL:n tärkeimmän proteiinikomponentin, apoliproteiini (Apo) A-I:n, vaikutuksesta. Molemmat vähentävät merkittävästi endoteelin pinnalle immobilisoituneiden VWF-kuitujen pituutta ja paksuutta. Verihiutaleiden adheesio näihin hyperadheesiorakenteisiin vähenee samassa suhteessa kuin itseesiintyneen VWF:n määrä vähenee. TMA:n mallissa ADAMTS13:n tyrmäävillä hiirillä HDL vaimensi merkittävästi myös trombosytopeniaa, jonka aiheutti suurten annosten ihmisen VWF:n infuusio.69 ApoA-I:n kyky moduloida VWF:n itseassosioitumista osoittaa, että sen pitoisuus plasmassa korreloi käänteisesti hyperadheesiivisen VWF:n määrän kanssa potilailla, jotka sairastavat TTP:tä ja sepsistä. Nämä havainnot viittaavat siihen, että VWF:n itseassosiaatioon puuttuminen voisi olla uusi lähestymistapa hyperadhesiiviseen VWF:ään liittyvien tromboottisten häiriöiden, kuten TTP:n, hoitoon.
VWF:ää pilkkova metalloproteaasi on 13. jäsen tähän mennessä tunnistettujen 18 erilaisen ADAMTS-tyyppisen entsyymin perheessä, joilla on rakenteellisia yhtäläisyyksiä.16,17 ADAMTS13 koostuu N-terminaalisesta reprolysiinityyppisestä metalloproteaasin domeenista (M), jota seuraa disintegriinidomeeni (D), trombospondiini-1:n kaltainen domeeni (T), kysteiinirikas domeeni (C), joka sisältää arginiini-glysiini-aspartaattisekvenssin, spacer-domeeni (S), seitsemän muuta trombospondiini-1:n kaltaista domeenia (T2-8) ja kaksi ei-identtistä CUB-tyyppistä domeenia (CUB1-2) molekyylin C-terminaalipäässä (Kuva. 24.2). CUB-domeenit sisältävät peptidisekvenssejä, jotka ovat samankaltaisia kuin komplementin alakomponentit C1r/C1s, alkion merisiiliproteiini egf ja luun morfogeeninen proteiini-1.70 ADAMTS13 on Zn2+:a ja Ca2+:aa vaativa 190 000 daltonin glykoproteiini, jonka geeni sijaitsee kromosomissa 9q34 ja jota tuotetaan pääasiassa maksan tähtihormonisoluissa71,72. EDTA estää ADAMTS13:n toimintaa, joten entsyymin funktionaaliset määritykset on parasta tehdä sitratoidusta plasmasta.12,14-17,73-77 Hepariinilla, kloorimetyyliketoneilla (esim. fenyylialaniini-proliiniaspartaatti-kloorimetyyliketoni ), hirudiinilla ja muilla suorilla trombiinin estäjillä (DTI:t) antikoaguloitua plasmaa voidaan myös käyttää testaukseen tyydyttävästi. Seerumi, joka on asianmukaisesti käsitelty proteaasi-inhibiittoreilla, soveltuu myös testaukseen.78
VWF:n pilkkominen ADAMTS13:n toimesta riippuu VWF:n konformaatiomuutoksista, jotka saa aikaan leikkausjännitys, voima, joka muuttaa VWF:n multimeerien konformaation globulaarisesta avoimeksi.79 Tätä konformaatiomuutosta seuraa yhden tai useamman A2-domeenin avautuminen VWF-multimeerin sisällä, jolloin Tyr1605-Met1606-peptidisidos altistuu ADAMTS1379:n pilkkomiselle tai Met1606:n hapettumiselle hypokloriitilla.54. Leikkausvoiman lisäksi siirtymistä saavutettavissa olevaan konformaatioon helpottavat myös hiilihydraattikiinnittymisen aiheuttamat muutokset A2-domeenin rakenteessa,80 aminohappojen substituutiot tyypin 2A VWD:ssä, jotka epävakauttavat A2-domeenin taittumista,81 sekä mutaatiot tyypin 2B VWD:ssä82 ja ristosetiinin sitoutuminen,83 jotka molemmat paljastavat samanaikaisesti A1-domeenin verihiutaleiden sitoutumiselle ja ADAMTS13:n pilkkomiskohdan.
WWVF:n tunnistamista ja pilkkomista ADAMTS13:n toimesta oli tutkittu laajasti. Viimeaikaiset todisteet osoittavat, että natiivissa ADAMTS13-molekyylissä C-terminaaliset T8-CUB-domeenit ovat kosketuksissa N-terminaalisten MDTCS-domeenien kanssa, mikä on molekyylinsisäinen vuorovaikutus, joka osittain estää MDTCS-domeenien kykyä sitoa ja pilkkoa VWF-78-peptidisubstraattia. Tässä natiivissa konformaatiossa ADAMTS13 on osittain autoinhiboitunut.84,85 ADAMTS13:n kykyä taittua tähän konformaatioon helpottaa ilmeisesti joustavuus, jonka antavat neljä oletettua linkkerisekvenssiä, jotka sijaitsevat T1- ja T2-, T2- ja T3-, T4- ja T4- ja T5- sekä T8- ja CUB1-domeenien välillä.86 Autoinhibitio lievittyy, kun C-terminaaliset domeenit joko typistetään tai sidotaan vasta-aineilla tai multimeerisellä VWF:llä, jolloin MDTCS-domeenit voivat sitoutua substraattiin.
Mutaatioanalyysien, sitoutumistutkimusten, kineettisten analyysien ja synteettisten peptidisubstraattien käytön perusteella on tunnistettu useita vuorovaikutuskohteita konformaatioltaan aktiivisen ADAMTS13:n ja VWF:n A2-domeenin välille, ja ne on tiivistetty molekulaariseksi vetoketjumalliksi,87 joka on kuvattu kaavamaisesti kuvassa 24.3. Kun multimeerinen VWF altistetaan kriittiselle leikkausjännitystasolle, A2-domeenin eksosiitti paljastuu ensin. Tämä eksosiitti käsittää Glu1660-Arg1668-kierteisen alueen, joka on 65 aminohappoa C-terminaalisesti pilkkoutumiskohdasta, ja se sitoutuu ADAMTS13:n spacer-domeeniin suurella affiniteetilla (KD ~ 10 nM).88-90 Leikkausjännitys paljastaa myös toisen, matala-affiniteettisen eksosiitin A2-domeenissa Asp1614:n kohdalla tai sen läheisyydessä (P9′-kohta), joka on vuorovaikutuksessa ADAMTS13:n disintegriinidomeeniin kuuluvan Arg349:n kanssa.91 Näiden kahden eksosiitin vuorovaikutus ADAMTS13:n komplementaaristen alueiden kanssa sijoittaa VWF:n Tyr1605-Met1606-halkaisukohdan ADAMTS13:n metalloproteaasidomeenin aktiivisen keskuksen kanssa. Tähän liittyy VWF:n Leu1603:n (P3-kohta) vuorovaikutus ADAMTS13:n komplementaaristen Leu198:n, Leu232:n ja L272:n (S3-kohta) kanssa, VWF:n Tyr1605:n (P1-kohta) vuorovaikutus ADAMTS13:n Leu151:n ja Val195:n (S1-kohta) kanssa ja VWF:n Met1606:n (P1′-kohta) vuorovaikutus ADAMTS13:ssa olevan Asp252-Pro256:n (S1′-kohta) kanssa.92 Fage display ja satunnainen mutaatioanalyysi vahvistavat ja osoittavat, että myös P3-P2′ ja P11′ (Ile1616) alueen aminohapot ovat tärkeitä pilkkoutumisen kannalta.93 Näin ollen näiden komplementaaristen alueiden peräkkäinen vuorovaikutus kahdessa multidomeeniproteiinissa helpottaa spesifistä scissile-sidoksen pilkkomista.
ULVWF-multimereiden hajoamisen epäonnistumisen on jo pitkään epäilty aiheuttavan perinnöllisen ja hankitun idiopaattisen TTP:n tyyppejä tai altistavan yksilön näille sairauksille (kuva 24.4).11,94 Kriittiset kokeet, jotka suoritettiin tämän käsityksen todentamiseksi, raportoitiin vuosina 1997 ja 1998. Neljällä kroonista uusiutuvaa TTP:tä sairastavalla potilaalla osoitettiin olevan puutos plasman ADAMTS13-aktiivisuudessa.12 Koska entsyymin inhibiittoria ei havaittu, puutoksen katsottiin johtuvan proteaasin tuotannon, selviytymisen tai toiminnan poikkeavuudesta. Seuraavan vuoden aikana selvitettiin yleisemmän hankitun idiopaattisen TTP:n patogeneesi.13-15 Hankittua idiopaattista TTP:tä sairastavilla potilailla plasman ADAMTS13-aktiivisuus oli akuuttien jaksojen aikana vähäistä tai olematonta, mutta aktiivisuus lisääntyi kohti normaalia toipuessaan. Vaikka näissä tutkimuksissa käytetyt plasmanäytteet eivät olleet fysiologisia, ne olivat kuitenkin innovatiivisia ja informatiivisia. Immunoglobuliini (Ig) G -autovasta-aineet entsyymiä vastaan selittivät luultavasti proteaasiaktiivisuuden puuttumisen useimmilla hankittua idiopaattista TTP:tä sairastavilla potilailla.13-15 Syitä tähän ohimenevään immuunijärjestelmän säätelyhäiriöön sekä VWF:ää pilkkovan proteaasin valikoivaan antigeenikohdistukseen ei vielä tiedetä.
Potilailla, joilla on familiaalinen krooninen relapsoiva TTP:tä sairastava TTP:tä sairastava perhepotilas sairastaa, on plasmassaan usein ULVVWF:n multimerejä.11,94 ULVWF-multimeerit havaitaan herkällä agaroosigeelielektroforeesimenetelmällä joistakin potilaiden plasmanäytteistä hankitun idiopaattisen TTP:n akuuttien jaksojen aikana, mutta ei toipumisen jälkeen.94 Nämä havainnot selittivät tutkijat, jotka havaitsivat ADAMTS13:n kroonisen puuttumisen plasmasta familiaalisessa kroonisesti relapsoivassa TTP:ssä sekä entsyymin ohimenevän estymisen hankitun idiopaattisen TTP:n akuuttien episodien aikana.12-15
Vähemmistöllä familiaalista TTP:tä sairastavista potilaista ADAMTS13:n aktiivisuus plasmassa on alle 5 %:lla tavanomaisesta plasman aktiivisuudesta riippumatta siitä, onko plasmasta saatu plasmanäytteitä akuuttien episodien aikana vai niiden jälkeen (edellyttäen, etteivät potilaat ole hiljattain saaneet plasman infuusionesteitä). Useimmilla hankittua idiopaattista TTP:tä sairastavilla potilailla ADAMTS13:n aktiivisuus plasmassa on alle 5 % normaalista vain akuuttien TTP-episodien aikana12 .-15,24,95 ADAMTS13-aktiivisuuden vakava puute TTP-potilaiden plasmassa korreloi siihen, ettei ULVWF-multimeerejä pystytä pilkkomaan, kun ne irtoavat endoteelisolujen pinnoilta (ks. kuva 24.4).59 Tämän seurauksena endoteelisolujen erittämät ULVWF-multimeerit pysyvät ankkuroituneina kyseisiin soluihin ja assosioituvat itsestään pitkiksi jänteiksi,59 ja ne pystyvät vangitsemaan ohi kulkevia verihiutaleita sitomalla verihiutaleiden GPIbα:ta (kuva 24.4). (Verihiutaleet eivät spontaanisti sitoudu pienempiin VWF-muotoihin, jotka kiertävät ULVWF-multimereiden pilkkomisen jälkeen.)56 Lisää verihiutaleita liittyy myöhemmin kasvavaan verihiutaleaggregaattiin (jotka rekrytoituvat aggregaattiin aktivoituneen αIIbβ3:n kautta), joka voi kasvaa niin suureksi, että se voi tukkia verisuonen (ks. kuva 24.4).59,96 Vaikka useimmissa idiopaattisen TTP:n tapauksissa esiintyy vakavaa ADAMTS13:n puutosta, osajoukolla ei ole vakavaa puutosta entsyymiaktiivisuudessa nykyisin saatavilla olevilla määrityksillä mitattuna.97 Vielä ei ole selvää, johtuuko tämä siitä, että saatavilla olevilla määrityksillä ei havaita vasta-aineiden aiheuttamaa häiriötä entsyymiaktiivisuudelle, VWF:n resistenssistä pilkkoutumiselle (esimerkiksi oksidatiivisen modifikaation vuoksi),53 vai muista syistä. On kuitenkin todennäköistä, että monet tähän ryhmään kuuluvat potilaat hyötyvät edelleen plasmanvaihtohoidosta.98 On myös korostettava, että ADAMTS13:n puutos ei ole herkkä eikä spesifinen (ADAMTS13:n aktiivisuus on vähentynyt monissa muissa häiriöissä)99 hankitun TTP:n diagnoosin tekemisessä.
ULVWF-nauhat kykenevät ADAMTS13:n aktiivisuuden puuttuessakin irrottautumaan sisäsoluista, sillä ne katkeavat mekaanisesti nesteen leikkausjännityksen synnyttämän jännityksen kasvaessa, kun verihiutaleet kiinnittyvät toisiinsa kiinni ja aggregaatoituvat.59 Irronneet ULVWF-trombosyyttijuosteet voivat tukkia alempana sijaitsevia mikroverisuonia, mikä edistää elinten iskemiaa.
Plasman ADAMTS13-aktiivisuus puuttuu lähes aina tai se on vakavasti alentunut potilailla, joilla on familiaalinen TTP,12,100,101 ADAMTS13-geenin homotsygoottisten tai yhdistelmäheterotsygoottisten mutaatioiden seurauksena.18,24,95,102,103 Familiaalisessa TTP:ssä mutaatioita on havaittu koko geenissä eri alueita koodaavilla alueilla (ks. kuva 24.2). Kun ADAMTS13:n aktiivisuuden vaikea synnynnäinen puutos on vakava, TTP-episodit alkavat yleensä imeväis- tai lapsuusiässä. Joillakin potilailla avoimet TTP-episodit kehittyvät kuitenkin vasta vuosien kuluttua (esim. ensimmäisen raskauden aikana),102 jos koskaan. Jälkimmäinen havainto viittaa siihen, että joillakin potilailla ADAMTS13:n jäännösaktiivisuus säilyy, ja akuutit TTP-episodit käynnistyvät, kun ULVWF:n vapautuminen endoteelisoluista ylittää niiden ADAMTS13:n rajallisen kyvyn käsitellä niitä. Yksi tapaus, jossa tämä saattaa tapahtua säännöllisesti, on raskauden aikana: VWF-tasojen tiedetään nousevan raskauden aikana.104-106 Tämän käsityksen mukaisesti synnynnäistä TTP:tä sairastavat naiset diagnosoidaan usein ensimmäisen raskauden aikana.29 Imeväisillä, joilla synnynnäinen TTP puhkeaa vastasyntyneenä ja joiden ADAMTS13-aktiivisuus on alle 5 %, ohimenevä tai etenevä munuaisten vajaatoiminta on usein merkittävä osa sairautta.107 Nämä potilaat muistuttavat kliinisesti kahta Schulmanin ja kollegoiden108 vuonna 1960 ja Upshawin109 vuonna 1978 kuvaamaa potilasta; tämän vuoksi tästä pediatrisesta alaryhmästä käytetään joskus nimitystä ”Upshaw-Schulmanin oireyhtymä”.
Monilla hankittua TTP:tä sairastavilla potilailla ADAMTS13-aktiivisuus plasmassa joko puuttuu tai se on voimakkaasti alentunut akuuttien episodien aikana ja lisääntyy toipumisen edetessä, riippumatta siitä, onko kyseessä yksittäinen vai toistuva episodi.13-15 IgG-autovasta-aineita, jotka estävät plasman ADAMTS13-aktiivisuutta, voidaan havaita 44-94 %:lla näistä potilaista.13-15,102,110,111 Nämä tulokset viittaavat siihen, että monilla potilailla, joilla on hankittu idiopaattinen TTP, johon liittyy ADAMTS13:n puutos, esiintyy ohimenevää tai ajoittain toistuvaa immuunisäätelyn häiriötä. Plasman ADAMTS13:aa estäviä vasta-aineita on havaittu myös muutamilla potilailla, joilla on tiklopidiiniin tai klopidogreeliin liittyvä TTP.34,112 Vielä ei tiedetä, esiintyykö ohimenevää vakavaa vikaa ADAMTS13:n tuotannossa tai selviytymisessä potilailla, joilla on hankittu TTP ja joilla ei ole havaittavia autovasta-aineita entsyymiä vastaan. Vaihtoehtoisesti se, että inhiboivia autovasta-aineita ei havaita joillakin potilailla, saattaa heijastaa nykyisin käytössä olevien testijärjestelmien rajallista herkkyyttä. Nykyiset testijärjestelmät eivät havaitse muita kuin inhiboivia autovasta-aineita, jotka voisivat sitoutua ja mahdollisesti välittää ADAMTS13:n immuunipuhdistumista.
Eräässä tutkimuksessa arvioitiin ADAMTS13:n epitooppeja, jotka polyklonaaliset autovasta-aineet tunnistivat 25:llä hankittua TTP:tä sairastavalla potilaalla,113 ja havaittiin, että vasta-aineiden kohteisiin kuului aina kysteiinirikkaan/välirakentavan domeenialueen sekvenssi (CS-sekvenssi, CS-sekvenssi), ja kolmella potilaalla vasta-aineet kohdistuivat ainoastaan tähän kohtaan. Muut 22 autovasta-ainetta reagoivat CS-domeenisekvenssin ja CUB-domeenien kanssa (64 %), metalloproteaasin/disintegriinin kaltaisen/ensimmäisen trombospondiini-1:n kaltaisen domeenin (MDT) sekvenssin kanssa (56 %) tai alueen kanssa, joka sisältää toisesta kahdeksaan trombospondiini-1:n kaltaista toistoa (T2-8, 28 %) (ks. kuva 24.2). Myös 20 % autovasta-aineista tunnisti propeptidialueen,113 mikä viittaa siihen, että propeptidin poistaminen ei ole välttämätöntä aktiivisen entsyymin erittymiselle.114 Autovasta-aineet estävät ADAMTS13:n aktiivisuutta tai vähentävät sen selviytymistä. Toisessa seitsemää potilasta koskevassa tutkimuksessa Luken ym.115 tunnistivat ADAMTS13-autovasta-aineita kuudella potilaalla, jotka sitoutuivat yksinomaan spacer-domeeniin (S); seitsemännellä potilaalla vasta-aineet sitoutuivat sekä S-domeeniin että T2-8-toistoihin. Mutageneesin avulla nämä tutkijat totesivat, että ADAMTS13:n spacer-domeenin Thr572-Asn579- ja Val657-Gly666-alueet olivat yhteisiä epitooppeja, joihin autovasta-aineet sitoutuvat116. Kun Arg660, Tyr661 tai Tyr665 korvattiin alaniinilla, kuuden TTP-potilaan autovasta-aineiden sitoutuminen eliminoitui.117
Autovasta-aineet ADAMTS13:lle hankittua TTP:tä sairastavilla potilailla kuuluvat pääasiassa IgG-luokkaan,118 vaikka myös IgM- ja IgA-luokan vasta-aineita on havaittu.119 Hankittua TTP:tä sairastavilta potilailta saatujen monoklonaalisten vasta-aineiden kloonaus ja sekvensointi osoittavat, että raskaan ketjun geenin segmentti VH1-69 sisältyy ensisijaisesti immunoglobuliinien muuttuvaan alueeseen.120,121,121 Tämä preferenssi viittaa siihen, että VH1-69:n CDR2- tai CDR3-alue voi osaltaan vaikuttaa spesifisyyteen eräälle epitoopille ADAMTS13:n spacer-domeenissa. Analyysissä, jossa tarkasteltiin vasta-aineiden alatyyppien jakautumista 58:lla akuuttia hankittua TTP:tä sairastavalla potilaalla, havaittiin kaikkiin IgG-alatyyppeihin kuuluvia vasta-aineita.118 IgG4 oli yleisin alatyyppi, ja sitä esiintyi 90 %:lla potilaista joko yksinään tai yhdistettynä muihin IgG-alatyyppeihin.
Adamts13-autovasta-aineiden tuotanto on lähes varmasti geneettisesti sidoksissa. Tätä seikkaa korostaa se, että kaksoissisaruksilla löydettiin ADAMTS13-autovasta-aineiden aiheuttama hankittu TTP.122 Relapseja esiintyy 23-44 %:lla hankittua TTP:tä sairastavista potilaista,102,110,123,124 usein ensimmäisen vuoden aikana ensimmäisen episodin jälkeen.102 Relapsit ovat yleisimpiä potilailla, joilla ADAMTS13:n aktiivisuus on alhaisin (<10 %).
Raskausaika ja synnytyksenjälkeinen ajanjakso ovat TTP:tä ajatellen erityinen haaste. Ensinnäkin preeklampsialla ja HELLP-oireyhtymällä (hemolyysi, kohonneet maksaentsyymit, matalat verihiutaleet) on monia kliinisiä piirteitä, jotka ovat päällekkäisiä TTP:n kanssa, ja niillä voi olla yhteisiä tiettyjä patofysiologisia piirteitä, kuten systeeminen endoteelin toimintahäiriö ja proteinuria (ks. luku 32).125 HELLP-oireyhtymää voi olla erityisen vaikea erottaa TTP:stä, koska siinä ilmenee myös mikroangiopaattista hemolyyttistä anemiaa, kohonneita LDH-pitoisuuksia ja trombosytopeniaa (vaikkakaan ei yleensä yhtä vakavaa kuin TTP:ssä).126 Raskaudenaikaiseen TTP:hen voi liittyä ADAMTS13:aa vastaan muodostuneita autovasta-aineita, ja tauti ilmenee tavallisesti synnytyksen läheisyydessä tai synnytyksen jälkeen.127 Arviot uusiutumisriskistä myöhemmissä raskauksissa vaihtelevat suuresti ja vaihtelevat 26 prosentista 73 prosenttiin raskautta kohden.102
Plasman ADAMTS13-aktiivisuus terveillä aikuisilla vaihtelee noin 50 prosentista 178 prosenttiin normaalista yhdistetystä plasmasta nykyisin saatavilla olevilla staattisilla määrityksillä. Alentunutta ADAMTS13-aktiivisuutta on havaittu myös maksasairauksissa, levinneissä pahanlaatuisissa kasvaimissa,128 systeemisissä tulehdusoireyhtymissä, kuten endotoksiinin aiheuttamissa oireyhtymissä,129 akuutissa haimatulehduksessa,130 vaikeassa sepsiksessä ja septisessä shokissa,131 sepsiksen aiheuttamassa DIC:ssä,132 ja sepsiksen aiheuttamissa elimellisissä toimintahäiriöissä.133-135 Lisäksi alhaisia ADAMTS13-pitoisuuksia voidaan havaita raskausaikana ja vastasyntyneillä.136 Lukuun ottamatta niitä peripartumalapsia, joille kehittyy avoin TTP,102,110 ADAMTS13-aktiivisuus, jota havaitaan näitä tiloja sairastavilla potilailla, ei ole alentunut äärimmäisen alhaisiin arvoihin (<5 % normaalista), joita havaitaan useimmilla potilailla, joilla on familiaalinen tai hankittu TTP.
ADAMTS13-määritykset
ADAMTS13-määrityksillä määritetään proteolyyttinen aktiivisuus, antigeenitaso ja anti-ADAMTS13-autovasta-aineiden taso. Varhaiset ADAMTS13-aktiivisuusmääritykset perustuivat puhdistettujen VWF-multimeerien hajoamiseen denaturoivien aineiden läsnäollessa ja pilkkoutumistuotteiden kvantifiointiin immunoblottaamalla,74,75 jäännöskollageenin sitoutumiseen137 tai vähentyneeseen ristosetiinin aiheuttamaan verihiutaleaggregaatioon.138 Vaikka nämä määritykset ovat herkkiä, niiden suorittaminen on hankalaa ja aikaa vievää, ja niiden suorittamiseen liittyy denaturoivien aineiden käyttö. Nämä määritykset korvattiin sen jälkeen, kun rekombinanttisten VWF-fragmenttien tutkimukset paljastivat aktiivisuusmittauksissa tarvittavat minimaaliset sekvenssit. Kokame ja työtoverit tekivät osittaisia deletointeja VWF:n A2-domeenista ja tunnistivat 73 aminohapon minimipeptidin (VWF73, Asp1596-Arg1668), jonka ADAMTS13 pilkkoi tehokkaasti ilman denaturointiaineita staattisissa olosuhteissa88. Myöhemmin on kehitetty useita VWF73:n sisältävien peptidien pilkkomiseen perustuvia määrityksiä, kuten fluoresenssiresonanssienergian siirto (FRET),97 HRP:hen sidottu VWF78,139 ELISA,140 immunoblottaus,141 ja massaspektrometria142.
Vuonna 2008 toteutettiin toinen kansainvälinen yhteistyötutkimus, jossa vertailtiin kahdeksan funktionaalisen ja kolmen antigeenimäärityksen suorituskykyä ADAMTS13:n osalta.143 Näiden menetelmien vertailu osoitti, että modifioituihin VWF-peptideihin substraatteina perustuvat pilkkomääritykset tarjosivat korkean tarkkuuden ja toistettavuuden sekä alhaisen varianssin ja menetelmien välisen vaihtelun. FRET-VWF73-määritystä on sittemmin käytetty laajalti ADAMTS13-aktiivisuuden kvantifiointiin potilasnäytteistä. Vaikka FRET-pohjainen määritys on helppo suorittaa, sillä on useita rajoituksia. Ensinnäkin FRET-VWF73-hajautus, jossa ADAMTS13:n lähteenä käytetään sitratoitua plasmaa, olisi tehtävä alle 33 °C:n lämpötilassa, koska ADAMTS13:n merkittävä irreversiibeli inaktivaatio tapahtuu 37 °C:n lämpötilassa sitraattivälitteisen kalsiumkelaation vuoksi. Toiseksi optimaalinen fluoresenssisignaalin havaitseminen edellyttää FRET-VWF73-substraatin pilkkomista pH 6,1:ssä, mikä vähentää pilkkoutumisnopeutta. Kolmanneksi, tässä suboptimaalisessa pH:ssa jotkin inhiboivista autovasta-aineista eivät muodosta vakaita komplekseja ADAMTS13:n kanssa, ja nämä vasta-aineet jäävät havaitsematta inhibitiotutkimuksissa. Neljänneksi hemoglobiini ja bilirubiini häiritsevät fluoresenssisignaalia merkittävästi spektrin päällekkäisyyden vuoksi. On kehitetty parannettu FRET-pohjainen peptidisubstraatti, FRETS-rVWF71. ADAMTS13:n aktiivisuus seerumissa ja sitratoidussa tai heparinisoidussa plasmassa voidaan mitata tällä parannetulla substraatilla fysiologisessa pH:ssa, ionivoimakkuudessa ja kalsiumkonsentraatiossa ilman, että endogeeniset VWF-multimeerit, bilirubiini tai hemoglobiini häiritsevät plasman toimintaa.78 Näiden peptidipohjaisten aktiivisuusmääritysten toisena rajoituksena on se, että ADAMTS13:n kykyä pilkkoa multimeeristä VWF:ää leikkausjännityksen alaisena ei arvioida. Vaikka jatkuvan vorteksoinnin aiheuttaman leikkausjännityksen on osoitettu edistävän VWF:n multimeerien pilkkoutumista,144 pilkkoutumistuotteiden kvantifiointi immunoblottaamalla on edelleen aikaa vievää. ADAMTS13-aktiivisuuden mittaamiseen on saatavilla ainakin neljä kaupallista sarjaa, jotka perustuvat raportoituihin menetelmiin. Näitä sarjoja ei kuitenkaan ole arvioitu suorissa vertailu- ja standardointitutkimuksissa.
ADAMTS13-antigeenitasoja on kvantifioitu monoklonaalisilla ja polyklonaalisilla vasta-aineilla.145,146 Trunkkaation, mutaatioiden ja autovasta-aineiden vaikutus näiden testien tarkkuuteen ja herkkyyteen ei ole selvä. ADAMTS13-antigeenitasojen mittaamiseen on saatavilla viisi kaupallista testisarjaa, mutta validointia ja vertailua muihin määrityksiin ei ole suoritettu.
Vuonna 2015 laadittiin ensimmäinen kansainvälinen standardi ADAMTS13:lle, ja sitä testattiin 32 laboratoriossa 14 maasta ADAMTS13-aktiivisuuden ja antigeenitasojen osalta paikallisiin standardeihin nähden.147 Tämä plasmastandardi, joka on nimetty nimellä WHO:n IS-standardi (12/252), saatiin 38:lta normaalilta terveeltä luovuttajalta peräisin olevasta yhdistetystä plasmasta. Tässä tutkimuksessa ADAMTS13-aktiivisuuden yksimielinen keskiarvo oli 0,91 yksikköä/ml, kun laboratorioiden välinen vaihtelu oli 12,4 %, ja ADAMTS13-antigeenin 0,92 yksikköä/ml, kun laboratorioiden välinen vaihtelu oli 16,3 %. Suuri laboratorioiden välinen vaihtelu ei johtunut ensisijaisesti erilaisten paikallisten standardien käytöstä vaan laboratorioiden välisistä metodologisista eroista.
A ADAMTS13-autovasta-aineiden määritykset tehdään tyypillisesti sekoittamalla lämpöinaktivoitua potilasveriplasmaa tunnettuun määrään koottua normaalia veriplasmaa ja mittaamalla ADAMTS13:n jäännösaktiivisuus. Ei-neutraloivat vasta-aineet havaitaan immunoblottaamalla.148
Vaikka toistaiseksi ei ole tunnistettu yhtään ADAMTS13-spesifistä ei-vasta-aineita sisältävää inhibiittoria, useat proteiinit ja peptidit voivat estää VWF:n ADAMTS13:n pilkkomista erityisolosuhteissa. Näitä ovat hemoglobiini, IL-6, trombospondiini-1 ja neutrofiilien α-defensiinit. Kaikissa tapauksissa inhiboivat aineet ilmeisesti sitovat substraattia, VWF:ää, ja estävät ADAMTS13:n pilkkomasta VWF:ää. Hemoglobiinin osoitettiin toimivan tällä tavoin sitomalla VWF-juosteita endoteelin pinnalla virtauksen alaisena ja estämällä kilpailevasti ADAMTS13:n suorittaman pilkkomisen.149 Tämä mekanismi voi osaltaan aiheuttaa vaso-okklusiivisia komplikaatioita sirppisolusairauspotilailla, joilla on merkittävä hemolyysi, ja se voi entisestään komplisoida TTP:tä, kun hemolyyttiset luvut ovat suuria. Suuret IL-6-pitoisuudet (50 ja 100 ng/ml) estävät myös endoteelin ULVWF-juosteiden ADAMTS13-välitteistä pilkkoutumista virtauksen alaisena in vitro50 , mikä viittaa siihen, että tämä mekanismi voi osaltaan vaikuttaa tromboosiin sytokiinimyrskyn150 tai sytokiinien vapautumisoireyhtymän aikana151 . Trombospondiini-1, joka on verihiutaleiden α-granulaatioissa runsaasti esiintyvä proteiini, joka vapautuu verenkiertoon verihiutaleiden aktivoituessa, sitoo VWF:n A2-A3-alueita, mikä estää kilpailukykyisesti ADAMTS13:n suorittaman pilkkomisen in vitro ja estää sitä.152 Tämä trombospondiini-1:n protromboottinen ominaisuus on yhdenmukainen trombospondiini-1:n knockout-hiirillä havaitun verihiutaleiden puutteellisen rekrytoitumisen aktivoituneeseen tai vahingoittuneeseen endoteeliin ja verihiutaleiden trombosyyttien trombosyyttien lisääntyneen embolisaation kanssa153. Aktivoituneista neutrofiileistä vapautuvat ihmisen neutrofiilipeptidit, niin sanotut α-defensiinit, voivat sitoa VWF:n A2-domeenia ja estää kilpailevasti ADAMTS13-välitteisen pilkkoutumisen.154 α-defensiinien pitoisuudet nousevat jopa seitsenkertaisiksi hankittua TTP:tä sairastavien potilaiden plasmassa.