Spectroscopic Methods
Absorbance Spectroscopy. Joissakin entsyymimäärityksissä on mahdollista mitata reaktantti tai tuote suoraan sen absorbanssiominaisuuksien perusteella Fersht (1999). Glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasin (EC 1.1.1.1.49) katalysoimassa reaktiossa yksi tuote (NADH) absorboi valoa 340 nm:ssä, jolloin reaktiota on mahdollista seurata seuraamalla absorbanssin kasvua tällä aallonpituudella.
Glukoosi-6-fosfaatti + NAD+ → 6-fosfosfoglukonaatti + NADH + H+
Toisissa tapauksissa reaktiotekijä tai tuote mitataan epäsuorasti. Esimerkiksi asetyylikoliiniesteraasissa (EC 3.1.1.7) käytetään substraattina asetyylitio-koliinia, joka vapauttaa entsyymille altistuessaan tio-koliinia. Tiokoliini reagoi Ellmanin reagenssin kanssa tuottaen värillisen tuotteen, jolloin reaktiota voidaan seurata seuraamalla absorbanssin kasvua.
Asetyylitio-koliini + H2O → asetaatti + H+ + tiokoliini
tiokoliini + Ellmanin reagenssi → värillinen johdannainen
Kytkettyjä testejä käytetään toisinaan entsyymin aktiivisuuden seuraamiseen. Tällöin kiinnostava entsyymireaktio yhdistetään toiseen reaktioon, joka on kytketty kätevää mittausta varten. Esimerkki tästä on heksokinaasin (EC 2.7.1.1) määritys. Tällöin määritysseokseen lisätään ylimäärä glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasia ja NAD+:ta ja seurataan absorbanssia 340 nm:ssä.
Reaktio I: Glukoosi + ATP → glukoosi-6-fosfaatti + ADP
Reaktio II: Glukoosi-6-fosfaatti + NAD+ → 6-fosfoglukonaatti + NADH + H+
Tässä esimerkissä reaktion I pitäisi olla nopeusrajoittava ja glukoosi-6-fosfaatin konsentraation pitäisi saavuttaa tasainen tila viiveajan jälkeen. Cleland Cleland (1979) muotoili menettelyn sen varmistamiseksi, että kytketty määritys antaa tarkan mittauksen entsyymin reaktionopeudesta. Jos mahdollista, on suositeltavaa seurata reaktiota jatkuvasti. Edellä kuvatuissa määrityksissä spektrofotometri voidaan ohjelmoida antamaan jatkuva lukema ajan funktiona. Erotustekniikoissa, joihin voi kuulua radioaktiivisuuden, elektroforeesin tai kromatografian käyttö, käytetään epäjatkuvia tai loppupistemäärityksiä. Kun määritykselle on määritetty lineaarinen aikajakso, parametri mitataan lineaarisen aikajakson yksittäisenä ajankohtana (mieluiten ajankohtana, joka on lähellä lineaarisen vaiheen puoliväliä). Nopeus määritetään sen jälkeen signaalin erotuksesta kyseisellä ajanhetkellä ja reaktion alkamishetkellä. Loppupistemäärityksissä on noudatettava varovaisuutta, ja aikajaksot on tarkistettava lineaarisuuden varmistamiseksi. Muutokset inkubaatio-olosuhteissa, kuten lämpötilassa, pH:ssa tai substraattikonsentraatiossa, voivat muuttaa määrityksen lineaarisuutta. Rutiininomaisissa entsyymimäärityksissä reaktioastia sisältää kaikki komponentit yhtä lukuun ottamatta, ja reaktio käynnistetään lisäämällä puuttuva komponentti (entsyymi tai jokin substraatti). Muut komponentit on tasapainotettava pH:n, lämpötilan ja ionivahvuuden suhteen. Reaktio aloitetaan yleensä lisäämällä pieni määrä puuttuvan komponentin väkevää kantaliuosta. Pienellä tilavuudella varmistetaan, että lisäys ei häiritse jo vallitsevia tasapaino-olosuhteita. Jos pienen komponentin lisääminen ei ole mahdollista, erotettujen komponenttien on oltava samassa lämpötilassa, ionivahvuudessa ja p H:ssa. Vaikka kahden komponentin on sekoituttava täydellisesti, voimakasta ravistelua on vältettävä, koska se voi denaturoida entsyymiproteiinia. Sekoittaminen voidaan suorittaa kääntämällä putki, jossa on kiinnitetty tulppa, tai kyvetti, jossa on Parafilm-tiiviste. Laimeat proteiinit ovat usein vähemmän stabiileja kuin väkevämmät proteiinit, ja määritykset tehdään usein inertin proteiinin, kuten naudan seerumin albumiinin (0,25 mg/ml), läsnä ollessa puhdistetun entsyymin stabiloimiseksi. Kokeilla on varmistettava, että proteiini on inertti. Koska esimerkiksi albumiini voi sitoutua hydrofobisiin substraatteihin, se ei aina sovellu tähän tarkoitukseen. Epäjatkuvia määrityksiä varten ajastin voidaan asettaa ja näytteet imetään tietyin aikavälein sekoittamisen jälkeen. Useimmissa spektrofotometreissä havaitseminen aloitetaan manuaalisesti laitteen paneelin tai tietokoneen näppäimistön avulla. Komponentin lisääminen kyvettiin vaatii noin 20 sekuntia, kun kyvetti asetetaan spektrofotometriin ja havaitseminen aloitetaan tietokoneen näppäintä painamalla. Tällä ajalla ei yleensä ole suurta merkitystä, koska useimmissa reaktioissa määritys kestää 10-30 minuuttia. Valvontamittauksiin sisältyy nolla-anturi, joka ei sisällä entsyymiä, ja nolla-anturi, joka ei sisällä substraattia. Tällaisilla kontrolleilla varmistetaan, että satunnaisia reaktioita ei tapahdu. Kontrollinopeus (ei-entsyymi-nollamittaus) vähennetään kokeellisesta päivämäärästä, jotta saadaan entsymaattisen reaktion todellinen nopeus. Monissa määrityksissä on tarpeen sammuttaa tai pysäyttää reaktio tiettynä ajankohtana, jotta estetään tuotteen lisätuotanto. Näytteitä voidaan esimerkiksi ottaa 5 minuutin välein ennalta määrätyn ajanjakson ajan ja mitata tuote HPLC:llä.
Kunkin kromatografisen analyysin suorittaminen voi kestää 30 minuuttia. Reaktion lopetusmenetelmiin kuuluu yleensä entsyymin denaturointi happoa lisäämällä tai upottamalla se kiehuvaan vesihauteeseen. Joidenkin metallientsyymien aktiivisuus voidaan sammuttaa EDTA:lla tai muulla metalli-ionikelaattorilla. Useimmat entsyymimääritykset perustuvat spektroskooppisiin tekniikoihin, joista kaksi yleisimmin käytettyä ovat absorptio ja fluoresenssi Fersht (1999). Reaktionopeuden seuraamiseen käytettävän aallonpituuden tulisi olla sellainen, joka tuottaa suurimman absorptioeron substraatin ja tuotteen välillä. Absorptiomittaukset tehdään tavallisella spektrofotometrillä, jossa näytteet ovat erikoistuneissa kyveteissä tai kyveteissä. Kertakäyttöisiä muovikyvettejä, joihin mahtuu 1 tai 3 ml näytteitä, on kaupallisesti saatavilla. Niiden käyttö rajoittuu näkyvälle aallonpituusalueelle (350-800 nm). Alle 350 nm:n aallonpituuksilla tehtäviin mittauksiin on käytettävä kvartsikyvettejä (lasi ja muovi absorboivat valoa UV-alueella). Valmistaja ilmoittaa kyvettien kulkureitit. Suositeltavat reitin pituudet ovat 1,00 cm, 0,40 cm ja 0,20 cm. Yhä useammat määritykset tehdään 96-kuoppaisilla mikrotiterilevyillä, joissa on muovi- tai kvartsipohja. Valoa tietyillä aallonpituuksilla absorboivan aineen konsentraatio voidaan määrittää Beerin lain avulla:
A = εcl,
jossa A on näytteen absorbanssi tietyllä aallonpituudella, c on näytteen konsentraatio, l on kulkureitin pituus ja ε on ekstinktiokerroin eli molaarinen absorptiokyky. ε:n yksiköt ovat M-1 cm-1 tai mM-1 cm-1. Jos ε:n arvo tunnetaan tietylle aineelle, voidaan laskea kyseisen aineen pitoisuus liuoksessa mittaamalla sen absorptio liuoksessa. Beerin lain avulla voidaan laskea konsentraation muutosnopeus reaktion aikana. Mahdollinen virhe absorptiomittauksia käytettäessä johtuu poikkeamisesta Beerin laista, koska se pätee vain rajallisella absorptio-arvojen alueella. Koska sitä ei ehkä voida soveltaa absorptiokertoimiin, jotka ovat suurempia kuin 1, määritykset olisi suunniteltava siten, että kokeelliset arvot jäävät tätä pienemmiksi. Joitakin näistä ongelmista voi olla mahdollista kiertää käyttämällä kyvettejä, joissa on lyhyemmät reittipituudet. Näytteen, jonka absorbanssi on 1,00 1,00 cm:n kulkureitin pituisessa kennossa, absorbanssi on 0,20 0,20 cm:n kulkureitin pituisessa kennossa. Yleisesti ottaen noin 0,5:n absorbanssin käyttäminen on kompromissi spektrofotometrille ominaisen optisen kohinan minimoimisen ja kohtuullisen mitattavan signaalin saamisen välillä. Liuoksen sameus voi sirottaa valoa ja tuottaa näennäisen absorbanssin. Näiden hiukkasten poistamiseksi voidaan käyttää suodatusta tai sentrifugointia. Vaikka polun pituuden muutoksilla voidaan välttää joitakin poikkeamia lineaarisuudesta (eli kun absorbanssi on niin suuri, että spektrofotometri ei pysty tekemään tarkkaa mittausta), poikkeamat johtuvat usein absorboivien lajien välisistä molekyylien välisistä vuorovaikutuksista. Dimeroitumista (tai korkeamman asteen eksimeerien muodostumista) tapahtuu absorboivien lajien suuremmissa pitoisuuksissa. Näissä tapauksissa Beerin lakia noudatetaan, jos tuotteen konsentraatiota pienennetään. Tämä voidaan saavuttaa joko hidastamalla reaktiota (pienentämällä entsyymin konsentraatiota) tai tekemällä mittauksia lyhyemmän ajanjakson aikana (ennen kuin havaitaan poikkeamia Beerin laista).