8.3 Kemialliset testit
PHG-komponenttien visualisointi TLC-levyillä on mahdollista käyttämällä yleisiä reagensseja fenoleille; rautakloridia, vanilliinia ja suolahappoa (antavat valikoiman vaaleanpunaisia värejä resorsinoli- tai floroglukinolijohdannaisilla) tai käyttämällä spesifisempiä testejä, joissa käytetään 2,4-dinitrofenyylifenyylihydratsiinia (havaitsee aldehydejä). Folin-Ciocalteun reagenssi on hyödyllinen myös sellaisten fenolien havaitsemiseksi, joilla on katekoli- tai hyrokinoniytimiä (siniset täplät näkyvät välittömästi TLC-levyn ruiskuttamisen jälkeen), tai muiden fenolien havaitsemiseksi, jotka näyttävät sinisistä harmaisiin vaihtelevia täpliä, kun levyä höyrystetään ammoniakkihöyryllä. Gibbs-reagenssi (2 % 2,6-dikloorikinonikloroimidi kloroformissa), jonka jälkeen levy höyrystetään 2M NH4OH:lla, antaa erilaisia värejä (esim. sillä voidaan erottaa vanilliinihappo – vaaleanpunainen väri – ja isovanilliinihappo – sininen). Kanelihappojohdannaiset antavat tyypillisen vaaleansinisen fluoresenssin, kun niitä tutkitaan UV-valossa (366 nm). Kanelihappojen cis- ja trans-isomeerit näkyvät TLC-levyillä, kun uutetta kromatografoidaan vesiliuottimissa kahteen suuntaan (2D-TLC). Fenolipitoisuuden arviointiin käytetään usein spektrofotometrisiä menetelmiä, esim. Arnowin reagenssia tai aiemmin mainittua Folin-Ciocalteun reagenssia.
Jotkut kvalitatiiviset testit osoittavat kasviuutteissa olevia kumariineja, esim, Laktonirengastesti (laimealla emäksellä hydrolysoidut kumariinit muodostavat keltaisen liuoksen O-kumariinihapposuoloja, jotka voidaan kumota happamoitumisen tai hiilidioksidikyllästyksen jälkeen); tai atsokytkentätesti (punainen väri kehittyy reaktion seurauksena diatsotisaation sulfaniilihapon kanssa emäksisessä liuoksessa). Kumariineja on helppo havaita UV-valossa (365 nm), koska ne tuottavat ominaista värifluoresenssia (lukuun ottamatta yksinkertaista substituoimatonta kumariinia, jolla ei ole fluoresenssia). Ne havaitaan sinisen, violetin, ruskean, vihreän tai keltaisen värin perusteella. 10-prosenttinen KOH-liuos metanoliin tai 20-prosenttinen antimonikloridin liuos kloroformiin voi voimistaa väriä. Hydroksikumariineilla ei ole batokromaattisia spektrisiirtymiä emäksisessä liuoksessa. HPLC-analyysissä, jossa on diodisarjatunnistus, erilaiset kumariinien UV-spektrit mahdollistavat yhdisteiden nopean tunnistamisen .
Kromonit reagoivat emäksisissä liuoksissa antaen O-hydroksi-β-diketoneja ilman γ-pyronirenkaan regeneroitumista ja myös värjäytyviä yhdisteitä väkevällä hapolla ja väkevällä emäksellä . Kromonit näkyvät myös UV-valossa (sininen, keltainen, vihertävän keltainen, ruskea fluoresenssi 365 nm:ssä).
Aktiivisen fenyylirenkaan (kromoforin) läsnäolo flavonoideissa tekee niistä helposti havaittavia UV-valossa. Niiden UV-spektrit ovat erityisen informatiivisia, sillä ne antavat rakenteellista tietoa, jonka avulla voidaan erottaa fenolityyppi ja hapettumistapa. Erilaiset kemialliset reaktiot TLC-kromatogrammeja ruiskuttamalla ovat mahdollisia; esim. visualisointi ammoniakkihöyryn läsnäollessa (kalkonit muuttuvat oranssiksi ja auronit punaisiksi) tai ruiskuttaminen Naturstoff Reagenz A:lla (1-prosenttinen 2-aminoetanolin ja difenyyliboorihapon esterin liuos) ja ylisuihkuttaminen 5-prosenttisella metanoliliuoksella polyetyleeniglykoli 4000:ta (PEG 4000:ta), mikä lisää tämän reaktion herkkyyttä. Derivoimisen jälkeen yhdisteet voitiin havaita UV-valossa (fluoresenssi vaaleankeltaisesta vihreään). Muita testejä ovat ruiskuttaminen ferrikloridilla, diatsotoidulla sulfaniilihapolla (molemmat ovat fenolien reaktioita) ja spesifinen reaktio; syanidiini magnesiumjauheen kanssa suolahapon läsnä ollessa (osoittaa flavanonien ja dihydroflavanolien läsnäolon) . Flavonoidien kvantitatiiviseen kolorimetriseen arviointiin käytetään reaktiota alumiinikloridin (AlCl3) kanssa (absorbanssi mitataan 425 nm:ssä). Alkaliliuoksiin liuotetut flavonoidit antavat voimakkaan keltaisen värin, joka vähenee hapon lisäämisen jälkeen. Flavonoidiyhdisteiden UV-spektreissä näkyy kaksi pääkaistaa (absorbanssimaksimia): kaista I korkeammalla aallonpituudella (johtuu flavonoidirakenteen cinnamoyyliosasta) ja kaista II matalammalla aallonpituudella (johtuu bentsoyyliosasta). Kaista I on tavallisesti flavoneilla 304-350 nm:ssä (H C-3:ssa C-renkaassa), flavonoleilla 352-385 nm:ssä (OH-ryhmä C-3:ssa) ja 3-substituoiduilla flavonoleilla 328-357 nm:ssä (O-substituutio C-3:ssa). Useimpien rakenteiden kaista II on noin 250-280 nm:ssä. Rengas A:ssa oleva ylimääräinen fenoliryhmä (-OH) aiheuttaa batokromaattisen siirtymän (siirtymä pidemmille aallonpituuksille) kaistassa II, ja ylimääräinen -OH-ryhmä rengas B:ssä aiheuttaa samanlaisen vaikutuksen kaistassa I .
Useimmat antrakinonit tai niiden glykosidit muodostavat keltaisia tai oranssinpunaisia kiteitä, ja niissä voi esiintyä pH:sta riippuvaista fluoresenssia . Tärkein värireaktio on Bornträgerin testi, joka saadaan aikaan liuottamalla kinoni emäksiseen vesiliuokseen. Värireaktio vaihtelee oranssinpunaisesta purppuranviolettiin (kinonin rakenteesta ja substituenteista riippuen). Antrakinonit antavat tässä reaktiossa punaisen värin. 1,8-dihydrokinonien osalta käytetään myös reaktiota magnesiumasetaatin kanssa. Antrakinonit voidaan havaita TLC-levyillä sen jälkeen, kun ne on ruiskutettu 10-prosenttisella metanolisella KOH-liuoksella. Alkuperäiset keltaiset tai kellanruskeat värit muuttuvat punaisiksi, violeteiksi, vihreiksi tai violeteiksi . Jauhettua raparperia voidaan tutkia UV-valossa raponthisiinin (stilbenoidiglykosidi, joka on myrkyllinen) havaitsemiseksi. Alkuperäisessä raparperissa (Rheum palmatum) esiintyy punaruskeaa fluoresenssia, mutta siinä ei näy hohtavia sinertävän violetteja täpliä (kuten raponttisen raparperin (Rheum rhaponticum) syynä).
Kuten aiemmin mainittiin, saponiineilla on pinta-aktiivisia yhdisteitä (pintajännitystä muokkaavia), ja niillä on emulgoivia ominaisuuksia. Nopea kvalitatiivinen tarkistus siitä, onko kasvissa SPG-yhdisteitä, tehdään yleensä vaahtoamistestillä, jossa kasvimateriaalia ravistetaan vedellä. Saponiineilla on kalvoja läpäiseviä ominaisuuksia. Pienet saponiinipitoisuudet kykenevät tuhoamaan erytrosyyttikalvoja (jotka voivat saostaa punasolujen kalvoissa olevan kolesterolin), mikä aiheuttaa veren hemolyysiä in vitro. Tämä kyky on johtanut hemolyysin (hemolyyttinen indeksi-IH) laajaan käyttöön biologisen aktiivisuuden määritysmenetelmänä. IH määritellään 2-prosenttisen isotonisen naudanverisuspension määränä (millilitroina), joka kokee hemolyysin, kun sitä käsitellään 1 grammalla testattua kasvimateriaalia (tai testattua uutetta). Vertailukohtana käytettiin Gypsophila paniculata saponiiniseosta (IH=30 000) tai Saponin Album (Merck) (IH=15 000). Kuten Hostettmann ja Marston kuvaavat, saponosidien hemolyyttinen aktiivisuus vaihtelee huomattavasti glykosidiosan rakenteen mukaan. Monodesmosidiset saponiinit (lukuun ottamatta asyyliglykosideja ja glysyrritsiiniä) ovat voimakkaasti hemolyyttisiä. Mikään värireaktio ei ole erityisen spesifinen SPG:ille. Käytettävissä on kuitenkin Liebermanin reaktio (etikkahappoanhydridin kanssa rikkihapon läsnä ollessa), jossa värit vaihtelevat aglykonin tyypin mukaan (triterpeeni-vaaleanpunaisesta punaiseen -tai steroidi-sinivihreä) .
Kemialliset reaktiot, joilla tunnistetaan CRG:t kasvimateriaalissa, voivat johtua aglykoneista tai sokereista. Liebermannin ja Salkoviskin testi osoittaa steroidiosan, joten se ei ole spesifinen CRG:lle. Keller Kilianin testi ja ksantidroli-testi osoittavat molemmat deoksisokereita (digitoksoosi tai symaroosi). Kedde- tai Baljet-reaktio on spesifisempi, koska se liittyy α,β-tyydyttymättömän laktonirenkaan esiintymiseen. CRG:iden fluoresoiva reaktio on myös mahdollinen, esim. digoksiinin hydroksyyliryhmä C-14:ssä ja C-16:ssa eliminoi vettä H2SO4:n avulla kahden ylimääräisen kaksoissidoksen muodostuessa. Tuloksena on konjugoitu järjestelmä (jossa laktonirenkaassa on kaksoissidos), joka tekee digoksiinista UV-valossa fluoresoivan. Jensenin reaktiota (sen jälkeen, kun se on ruiskutettu trikloorietikkahapolla etanoliin) käytetään CRG:iden visualisoimiseksi TLC-kromatogrammeissa .
HCN:n kokonaismäärän suora mittaaminen elintarvikkeissa esiintyvien syanogeenisten glykosidien happohydrolyysillä sekä välituotteena syntyvien syanohydriinien hajoamisella HCN:ksi on eduksi siinä, että se on sovellettavissa kaikentyyppisiin näytteisiin, vaikkakaan kaikkia syanogeenisten glykosidien potentiaalisia HCN:iä ei olekaan luultavasti saatavissa in vivo. Näiden yhdisteiden esiintyminen kasveissa on mahdollista visualisoida reagensseilla, kuten pikriinihappo/natriumkarbonaatti tai bentsidiini/kupariasetaatti, kyllästetyllä suodatinpaperilla. Nämä reagenssit pystyvät antamaan värireaktioita murskatusta kasvikudoksesta vapautuvan HCN:n kanssa. Kyllästetty paperi asetetaan putkeen murskatun kasvimateriaalin päälle ja annetaan inkuboitua 40 °C:ssa 2 tuntia. Värin muuttuminen keltaisesta punaruskeaksi osoittaa HCN:n vapautumista entsymaattisesti. Pikraattipaperi ei ole täysin spesifinen syanogeenille (myös Brassica-lajien haihtuvat isotiosyanaatit reagoivat tähän reaktioon). Sen vuoksi käytetään myös toista testiä, jossa käytetään seosta (1:1), joka koostuu 1 %:n 4,4-tetrametyylidiamiinidifenyyliamiinin 1 %:n kloroformiliuoksesta (w/v) ja 1 %:n kuparietyyliasetoasetaatin 1 %:n kloroformiliuoksesta (w/v). Värireaktio muuttuu heikosta sinivihreästä kirkkaan vihreäksi. Toinen mahdollinen menetelmä edellyttää kasvikudoksen tislaamista happamassa vedessä ja vapautuneen HCN:n titraamista hopeanitraatilla. Kromatografiset menetelmät, kuten trimetyylisilyylijohdannaisten HPLC/MS tai GC/MS, ovat tehokkaita yksittäisten syanogeenisten glykosidien tai syanohydriinien analysoinnissa, ja ne mahdollistavat yhdisteiden kemiallisen karakterisoinnin sekä kvantifioinnin.
Kasveissa glukosinolaateista muodostuvien tuotteiden moninaisuuden vuoksi (riippuen sen aglykonirakenteesta) isotiosyanaattien arviointi spektrofotometrisellä menetelmällä (jossa värituotteet 1,3-bentsoditiol-2-tionit muodostuvat isotiosyanaattien kondensoituessa 1,2-bentseeniditiolin kanssa) voi olla riittämätöntä kasvien glukosinolaattipitoisuuden määrittämiseksi .
.