Tässä blogikirjoituksessa (lisää on tulossa erityyppisistä fiksatiiveista…) keskitymme pääasiassa paraformaldehydin/formaldehydin, yleisesti PFA:ksi kutsutun paraformaldehydin/formaldehydin, käyttöön, joka on yleisimmin käytetty fiksatiivi virtaussytometriassa. PFA viittaa nimenomaan formaldehydin kiinteään, polymeeriseen muotoon (ja liukenee monomeeriseksi formaldehydiksi vesiliuoksessa), joten se, mitä yleensä kutsutaan kanonisesti ”PFA-fiksaatioksi”, tarkoittaa itse asiassa monomeerisen formaldehydiliuoksen käyttöä. Tässä tapauksessa PFA ja formaldehydi ovat synonyymejä ja vaihdettavissa keskenään.
Virtaussytometriassa käytettävien näytteiden fiksaukseen käytetään yleensä 1-4-prosenttista PFA-liuosta. Tarttuvien näytteiden desinfioinnissa jopa 0,37-prosenttiset pitoisuudet voivat tehokkaasti desinfioida HIV-tartunnan saaneiden potilaiden näytteet1. Inkubaatio enintään 45-60 minuuttia 1 %:n PFA:ssa ja 15-20 minuuttia 4 %:n PFA:ssa (esim. BioLegendin puskurissa) riittää solujen täydelliseen fiksaatioon, ja solut voidaan joko käyttää jatkokäsittelyyn (solunsisäisten kohteiden permeabilointi) tai varastoida myöhempää analysointia varten tässä vaiheessa.
Rutiininomaisen virtaussytometriavärjäyksen aikana, johon sisältyy pintamarkkerivärjäys, on useita vaiheita, joissa voit päättää näytteiden kiinnittämisestä – kiinnitä pintamarkkerivärjäyksen jälkeen tai kiinnitä ennen.
Jossain tapauksissa päätös kiinnittämisen ajankohdasta on… kiinnitetty. Jos esimerkiksi analysoit fosfokohteita, vasta-aineiden sitoutuminen tiettyihin pinta-antigeeneihin voi muuttaa solunsisäisiä signaalireittejä pian kontaktin jälkeen, mikä johtaa artefaktiin fosforylaatiotuloksissa. Tällöin solut on kiinnitettävä ennen pintavasta-aineiden lisäämistä (minkä vuoksi True-Phos™ Perm -puskurimme suositeltu protokolla solunsisäisten fosforylaatiokohteiden analysoimiseksi on suunniteltu siten, että kiinnitysvaihe edeltää muita toimenpiteitä). Kummallakin on omat hyötynsä ja haittansa, mutta tässä on pari asiaa, joita kannattaa varoa kummassakin tapauksessa.