Genomin organisointi ja ilmentyminen
Luteovirusten genominen RNA sisältää viidestä seitsemään konservoitunutta ORF:ää (kuva 3). ORF:t 1, 2, 3 ja 5 ovat yhteisiä kaikille Luteoviridae-heimon jäsenille. Luteoviruksista puuttuu ORF0. Enamoviruksista puuttuu ORF4. Luteo- ja polerovirusten genomit sisältävät pienen ORF:n (ORF3a) ORF3:n yläpuolella. Luteovirusten genomissa on pieni ORF (ORF6) ORF5:n alapuolella. PLRV-genomi sisältää ORF:t 6 ja 7 ORF5:n sisällä ja ORF8 ORF1:n sisällä. Emaali- ja poleroviruksissa ORF0 on yli 600 nt päällekkäinen ORF1:n kanssa, joka on myös yli 600 nt päällekkäinen ORF2:n kanssa. Luteoviruksissa ORF1 peittää ORF2:n alle 50 nt:llä. Useimmissa luteo- ja polerovirusten genomisekvensseissä ORF4 on kokonaan ORF3:n sisällä. ORF5:n ja ORF3:n erottaa yksittäinen, kehyksen sisäinen meripihkainen (UAG) terminaatiokodoni.
Kuvio 3. ORF5:n ja ORF3:n välillä. Luteoviridae-suvun sukujen virusgenomien kartat. Yksittäiset ORF:t on esitetty avoimilla laatikoilla. ORF:t on porrastettu pystysuoraan, jotta kunkin ORF:n miehittämät eri lukukehykset näkyisivät. Keltaiset laatikot osoittavat proteiinituotteita, joiden ennustetut koot on lueteltu kunkin laatikon oikealla puolella. Emalo- ja polerovirusten ORF1:n koodaamat polyproteiinit sisältävät proteaasin ja genomiin sidotun proteiinin (VPg). ORF2:n koodaamien proteiinien ennustetut aminohapposekvenssit muistuttavat RNA-riippuvaisia RNA-polymeraaseja. ORF3, joka koodaa tärkeintä päällysproteiinia, on erotettu ORF5:stä meripihkanvärisellä terminointikodonilla. ORF4 on useimmiten ORF3:n sisällä, ja se koodaa proteiinia, jota tarvitaan viruksen liikkumiseen solusta soluun. Luteo- ja polerovirukset sisältävät ORF3a:n, jonka translaatio käynnistyy muulla kuin AUG-kodonilla. Luteovirusten 3′ ei-koodaavat alueet sisältävät translaation tehostuselementtejä (BTE). PLRV:ssä ORF7 on samassa kehyksessä ORF5:n C-terminaalin kanssa, ja ORF8:n translaatiota välittää sisäinen initiaatioribosomin sisäänmenokohta (IRES). Luteo- ja polerovirukset tuottavat kolme subgenomista RNA:ta (sgRNA), mutta enamovirukset tuottavat yhden sgRNA:n.
Luteoviruksilla on suhteellisen lyhyet 5′- ja intergeeniset ei-koodaavat sekvenssit. Ensimmäistä ORF:ää edeltää 21 nt CABYV:n RNA:ssa ja 142 nt soijapavun kääpiöviruksen (SbDV) RNA:ssa. ORF:ien 2 ja 3 välillä on 112-200 nt ei-koodaavaa RNA:ta. ORF5:n jälkeisen sekvenssin pituudessa on huomattavaa vaihtelua: se vaihtelee CYDV-RPV:n 167 nt:stä SbDV:n 650 nt:iin.
Luteovirukset käyttävät monenlaisia strategioita kompaktin genominsa ilmentämiseen. ORF:t 0, 1, 2 ja 8 ilmentyvät suoraan genomisesta RNA:sta. Alempana olevat ORF:t ilmentyvät subgenomisista RNA:ista (sgRNA:ista), jotka transkriboituvat sisäisistä aloituskohdista viruskoodattujen RNA-riippuvaisten RNA-polymeraasien (RdRps) toimesta negatiivisjuosteisista RNA:ista ja jotka ovat 3′ ko-terminaalisia genomisen RNA:n kanssa. Koska polero- ja enamovirusten ORF0:n aloituskodoni on ORF1:n aloituskodonia ylempänä, ORF1:n translaatio käynnistyy ”vuotavalla skannauksella”, jossa ribosomit ohittavat ORF0:n AUG:n ja jatkavat genomisen RNA:n skannausta, kunnes ne saavuttavat ORF1:n AUG:n. ORF2:n proteiinituotteet ilmentyvät translaatiofuusiona ORF1:n tuotteen kanssa. ORF1:n ilmentymisen aikana translaatio jatkuu pienellä mutta merkittävällä frekvenssillä ORF2:een -1 frameshiftin kautta, joka tuottaa suuren proteiinin, joka sisältää sekä ORF1:n että ORF2:n koodaamia sekvenssejä yhdessä polypeptidissä. Frameshiftin välittävät ”liukas hepta-nukleotidisekvenssi” (muodossa X XXY YYZ) ja alempana oleva RNA:n sekundäärirakenne, jota kutsutaan pseudoknotiksi ja joka saa ribosomit pysähtymään ja siirtymään sitten yhden nt:n taaksepäin ennen kuin ne jatkavat kääntämistä uudessa lukukehyksessä. ORF8, joka on tunnistettu vain PLRV:ssä, sijaitsee kokonaan ORF1:n sisällä eri lukukehyksessä ja koodaa 5 kDa:n replikaatioon liittyvää proteiinia. ORF8:n ilmentämiseksi ORF:n sisällä olevat sekvenssit taittuvat rakenteeksi, jota kutsutaan sisäiseksi ribosomin sisääntulokohdaksi (IRES), joka rekrytoi ribosomeja aloittamaan translaation noin 1600 nt PLRV:n RNA:n 5′-päätteestä alavirtaan.
ORF:t 3a, 3, 4 ja 5 ilmentyvät vuotavan skannausmekanismin kautta sgRNA1:n 5′-terminaalista, joka sijaitsee noin 200 nt ORF3:sta ylävirtaan ORF2:n lopussa ja ulottuu genomin 3′-terminaaliin. ORF3a:n translaatio käynnistyy muusta kuin AUG-kodonista. Useimpien luteo- ja polerovirusten ORF4 sisältyy ORF3:een. Kaikissa luteoviruksissa ORF5 ilmentyy ainoastaan translaatiofuusiona ORF3:n tuotteiden kanssa, kun ORF3:n lopussa oleva UAG-stoppikodoni luetaan läpi, jolloin syntyy proteiini, jonka N-terminaalissa on ORF3:n tuote ja C-terminaalissa ORF5:n tuote. Läpilukua säätelevät paikalliset ja pitkän matkan RNA-RNA-vuorovaikutukset, ja luteovirusten ja joidenkin polerovirusten tapauksessa se edellyttää, että ORF3:n stop-kodonin alapuolella on CCXXXX-toistoja (jossa X on mikä tahansa emäs). Luteo- ja polerovirukset tuottavat toista pienempää sgRNA:ta, joka kykenee ilmentämään ORF:t 6 ja 7. Kolmannet sgRNA:t, jotka eivät näytä koodaavan proteiineja, tuotetaan hyvin runsaasti luteoviruksissa, mutta vain vähän PLRV:ssä.
Mikäli enamo- ja polerovirusten RNA:t sisältävät 5′ VPgs:iä, jotka ovat vuorovaikutuksessa translaation initiaatiotekijöiden kanssa, luteovirusten RNA:t sisältävät vain 5′ fosfaatin. Muokkaamattomat 5′-termiinit tunnistetaan huonosti translaation initiaatiota varten. Tämän ongelman kiertämiseksi BYDV-PAV-genomi sisältää lyhyen sekvenssin (BYDV-translaatioelementti; BTE), joka sijaitsee 3′ ei-koodaavalla alueella ORF5:n alajuoksulla ja joka on vuorovaikutuksessa sekvenssien kanssa, jotka ovat lähellä genomisen RNA:n ja sgRNA1:n 5′-terminiinejä, edistääkseen cap-riippumatonta translaation aloitusta.
Post-transkriptiivinen geeninvaimennus (PTGS) on synnynnäinen ja erittäin adaptiivinen antiviraalinen puolustus, joka esiintyy kaikissa eukaryooteissa ja joka aktivoituu kaksisäikeisillä RNA:illa (dsRNA:t), joita tuotetaan viruksen replikaation aikana. Luteovirusten koodaamien proteiinien toimintaa koskevat tutkimukset ovat osoittaneet, että ORF0:n koodaamat 28-34 kDa:n proteiinit tukahduttavat voimakkaasti polero- ja enamovirusten paikallista ja systeemistä PTGS:ää. Luteovirusten genomeista puuttuu ORF0, mutta luteovirusten ORF4:n tuote toimii systeemisen PTGS:n tukahduttajana.
Emalo- ja polerovirusten ORF1-koodatut proteiinit sisältävät VPg:n ja kymotrypsiinin kaltaisen seriiniproteaasin, joka vastaa ORF1-koodattujen polyproteiinien proteolyyttisestä prosessoinnista. Proteaasi pilkkoo ORF1-proteiinin sisäisesti vapauttaakseen VPg:n, joka on kovalenttisesti kiinnittynyt genomiseen RNA:han. PLRV:n ORF8:n ilmentämää proteiinia tarvitaan viruksen replikaatioon. Luteovirusten ORF2:lla koodataan 59-67 kDa:n proteiineja, jotka ovat hyvin samankaltaisia kuin tunnetut RdRps:t ja edustavat siten todennäköisesti viruksen replikaasin katalyyttistä osaa.
Luteo- ja polerovirusten ORF3a tuottaa erittäin konservoituneita 4,8-5,3 kDa:n proteiineja, jotka ovat välttämättömiä pitkän matkan liikkumiselle. ORF3 koodaa luteovirusten tärkeintä CP:tä, jonka koko on 21-23 kDa. ORF5:n koodauskapasiteetti on 29-56 kDa. ORF5 ilmentyy kuitenkin vain translaatiofuusiona ORF3:n tuotteen kanssa, kun noin 10 prosenttia ajasta translaatio ei pysähdy ORF3:n päähän vaan jatkuu ORF5:n loppuun asti. Tämän läpileikkausproteiinin ORF5-osan on todettu olevan osallisena kirvojen siirtymisessä ja viruksen stabiilisuudessa. Kokeet PLRV:llä ja BYDV-PAV:llä ovat osoittaneet, että ORF5-lukuproteiinin N-terminaalinen alue määrittää viruspartikkelien kyvyn sitoutua kirvovektoreiden endosymboottisten bakteerien tuottamiin proteiineihin. Virushiukkasten vuorovaikutus näiden proteiinien kanssa näyttää olevan välttämätöntä virusten pysyvyydelle kirvoissa. PEMV-1:n ORF5:n nukleotidisekvenssimuutokset poistavat kirvojen tarttuvuuden. ORF5-proteiinien N-terminaaliset osat ovat erittäin konservoituneita luteovirusten keskuudessa, kun taas C-terminaaliset osat ovat paljon vaihtelevampia.
Luteo- ja polerovirusten genomeissa on ORF4, joka sisältyy ORF3:een ja koodaa 17-21 kDa:n proteiineja. Virukset, jotka sisältävät mutaatioita ORF4:ssä, pystyvät replikoitumaan eristetyissä kasvin protoplasteissa, mutta niiden systeeminen liikkuminen kokonaisissa kasveissa on puutteellista tai viivästyy. Näin ollen ORF4:n tuote näyttää olevan välttämätön viruksen liikkumiselle tartunnan saaneissa kasveissa. Tätä hypoteesia tukee havainto, että enamoviruksista puuttuu ORF4. Vaikka luteo- ja polerovirukset rajoittuvat floemiin ja siihen liittyviin kudoksiin, enamovirus PEMV-1 pystyy liikkumaan systeemisesti muissa kasvikudoksissa PEMV-2:n läsnä ollessa, joka luonnollisissa olosuhteissa esiintyy poikkeuksetta yhdessä PEMV-1:n kanssa.
Joidenkin luteo- ja polerovirusten genomit sisältävät pieniä ORF:iä ORF5:n sisällä ja/tai sen jälkeen. Luteoviruksissa näistä ORF:istä ei ole havaittu proteiinituotteita infektoiduissa soluissa. BYDV-PAV-genomit, jotka eivät ilmentäisi ORF6:ta, pystyvät silti lisääntymään protoplastissa. PLRV:n ORF:ien 6 ja 7 ilmentämien proteiinien ennustettu koko on 7,1 ja 14 kDa. Mutaatiotutkimusten perusteella on ehdotettu, että nämä genomin alueet saattavat säädellä transkriptiota infektion myöhäisessä vaiheessa.