Viruskannat
HCoV-229E (VR-740) ja HCoV-OC43 (VR-1558) lisättiin ihmisen diploidisissa keuhkojen MRC-5- fibroblasteissa (CCL-171) ja WI-38:ssa (CCL-75), (kaikki ATCC, Manassas, VA). Molempia ihmisen solulinjoja kasvatettiin MEM:ssä, jota täydennettiin 10 %:lla naudan sikiön seerumilla (FBS), 2 mM L-alanyyli-L-glutamiinilla, 100 U/ml penisilliinillä ja 100 μg/ml streptomysiinillä (Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA). Virusinfektioväliaine koostui MEM:stä tai RPMI-1640:stä ja 2 % lämpöinaktivoidusta FBS:stä HCoV-229E:lle ja HCoV-OC43:lle. Viruskannat lisättiin inokuloimalla pulloihin, jotka sisälsivät 24 tuntia vanhoja isäntäsoluja, jotka olivat 80-90 % juoksevia. Tunnin inkubaation jälkeen solun monokerros pestiin ja sitä inkuboitiin tuoreessa infektiomediumissa kolmen tai neljän päivän ajan 35 °C:ssa HCoV-229E:n osalta ja 33 °C:ssa HCoV-OC43:n osalta. Tämän jälkeen supernatantti, joka sisälsi toimivan viruskannan, kerättiin sentrifugoimalla (300 g 15 minuutin ajan). Virustitteri määritettiin 50 %:n kudosviljelmän infektiivisen annoksen TCID50 mukaan arvioimalla sytopaattisia vaikutuksia (CPE), jotka pisteytettiin kirkkaalla kenttämikroskoopilla (10 ×) sytoplasman vakuolisoitumisena, solujen pyöristymisenä ja irtoamisena.
Pöydän aerosolien säteilytyskammio
Aerosolien synnyttämisessä, altistamisessa ja aerosolien näytteiden keräämisessä käytettiin kertakäyntistä dynaamista aerosolien/virusten säteilyttämiskammiota, jossa aerosolinäytteet tuotettiin, asetettiin altistumiselle alttiiksi ja kerättiin, kuten on kuvattu aiemmin23. Virusaerosolit tuotettiin lisäämällä virusliuos suuritehoiseen laajennettuun aerosolihengityshoitosumuttimeen (Westmed, Tucson, AZ) ja käyttämällä ilmapumppua, jonka syöttövirtaus oli 11 L/min. Virus virtasi kammioon ja sekoitettiin kuivaan ja kostutettuun ilmaan, jotta ilmankosteus pysyi noin 50-70 prosentissa. Suhteellista kosteutta, lämpötilaa ja aerosolihiukkasten kokojakaumaa seurattiin koko toiminnan ajan. Aerosoli altistettiin kauko-UVC-valolle ja kerättiin lopuksi BioSamplerilla (SKC Inc., Eighty Four, PA).
Kauko-UVC-lamppu sijoitettiin noin 22 cm:n etäisyydelle UV-altistuskammiosta ja suunnattiin 26 cm × 25,6 cm × 254 μm:n UV-säteilyä läpäisevään muovi-ikkunaan (TOPAS 8007 × 10, TOPAS Advanced Polymers Inc., Florence, KY). Aiempien tätä kammiota käyttäneiden kokeidemme23 mukaisesti virtausnopeus järjestelmän läpi oli 12,5 l/min. UV-valotusalueen tilavuus oli 4,2 l, joten kukin aerosoli altistui noin 20 sekunnin ajan, kun se kulki ikkunan läpi. Koko säteilytyskammio sijaitsi bioturvallisuustason 2 kaapissa, ja kaikki ilmansyötöt ja -ulostulot oli varustettu HEPA-suodattimilla (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA), jotta ei-toivottuja kontaminaatioita ei pääsisi järjestelmään tai poistuisi sieltä.
Säteilytyskammion suorituskyky
Räätälöidyssä säteilytyskammiossa simuloitiin ihmisen yskimisen ja hengittämisen kautta tuotettujen aerosolisoituneiden virusten siirtymistä. Kammio toimi keskimääräisessä 66 %:n suhteellisessa kosteudessa ja 24 °C:n keskilämpötilassa kaikissa ajoissa. Keskimääräinen hiukkaskokojakauma oli 83 % välillä 0,3 μm-0,5 μm, 12 % välillä 0,5 μm-0,7 μm ja 5 % >0,7 μm (taulukko 3). Aerosolisoituneet virukset kulkeutuivat tehokkaasti järjestelmän läpi, minkä osoittaa kontrolli (nolla altistusta), jossa näkyi selkeä virusten integroituminen (kuvat 2 ja 3, vasemmanpuoleiset yläpaneelit).
Far-UVC-lamppu ja dosimetria
Tässä tutkimuksessa käytetty far-UVC-lähde oli USHIO American valmistama 12 W:n 222 nm:n KrCl-eksimerilamppumoduuli (Item #9101711, Cypress, CA). Lamppu on varustettu patentoidulla optisella suodatusikkunalla, joka vähentää lampun päästöjä 222 nm:n KrCl-emissiohuipun ulkopuolella. Lamppu sijoitettiin 22 cm:n päähän valotuskammion ikkunasta ja suunnattiin ikkunan keskelle. Optisen tehon mittaukset suoritettiin käyttämällä 818-UV/DB low-power UV-parannettua piifotodetektoria ja 843-R optista tehomittaria (Newport, Irvine, CA). Dosimetria suoritettiin ennen kokeen aloittamista, jotta kammion sisäinen fluenssi aerosolin kohdalla voitiin mitata.
Lampun ja säteilytyskammion välinen etäisyys mahdollisti sen, että yksi lamppu säteilytti tasaisesti koko altistusikkunan alueen. Piifotodetektorilla tehdyt mittaukset osoittivat, että valotuksen intensiteetti oli noin 90 μW/cm2 koko valotusalueella. Kammiossa on valotusikkunaa vastapäätä heijastava alumiinipinta. Kuten aiemmissa kammiota koskevissa töissämme23 , tämän pinnan heijastavuus oli noin 15 prosenttia. Siksi olemme arvioineet varovaisesti, että intensiteetti koko valotusalueella on 100 μW/cm2. Kun lamppu on sijoitettu 22 cm:n etäisyydelle ikkunasta ja kun otetaan huomioon, että aerosolihiukkasen kulkeminen valotusikkunan läpi kestää 20 sekuntia, laskimme hiukkasen kokonaisaltistusannokseksi 2 mJ/cm2 . Käytimme ylimääräisiä UV-säteilyä läpäiseviä muovi-ikkunoita vähentämään tasaisesti intensiteettiä koko altistusalueella erilaisten altistusolosuhteiden luomiseksi. Aiemmissa töissämme näillä levyillä mittasimme läpäisevyyden olevan lähempänä 65 prosenttia23 , mutta näissä testeissä kunkin levyn 222 nm:n läpäisevyydeksi mitattiin noin 50 prosenttia. Tämä läpäisykyvyn väheneminen johtuu todennäköisesti muovin hajoamisesta ajan myötä4. Kun valotusikkunaa peittää yksi tai kaksi muovilevyä, valotusannos pienenee vastaavasti 1 ja 0,5 mJ/cm2 :iin.
Kokeellinen protokolla
Kuten aiemmin on kuvattu23, virusliuos sumuttimessa koostui 1 ml:sta Modified Eagle’s Mediumia (MEM, Life Technologies, Grand Island, NY), joka sisälsi 107-108 TCID50 koronavirusta, 20 ml:sta deionisoitua vettä ja 0,05 ml:sta Hankin tasapainotettua suolaliuosta, jossa on kalsiumia ja magnesiumia (HBSS++). Säteilytyskammiota käytettiin siten, että aerosolisoituneet viruspartikkelit virtasivat kammion ja ohituskanavan läpi 5 minuutin ajan ennen jokaista näytteenottoa, jotta haluttu RH-arvo saatiin määritettyä. Näytteenotto aloitettiin muuttamalla ilmavirtausta ohituskanavasta BioSampleriin kolmitieventtiilien avulla. BioSampler täytettiin aluksi 20 ml:lla HBSS++:aa aerosolin keräämiseksi. Jokaisen näytteenottokerran aikana, joka kesti 30 minuuttia, säteilytyskammion sisäpuoli altistettiin 222 nm:n kauko-UVC-valolle, joka tuli muovi-ikkunan läpi. Aerosolihiukkasiin kohdistuvan kauko-UVC-annoksen vaihtelu saavutettiin lisäämällä ylimääräisiä UV-säteilyn läpäiseviä muovikalvoja edellä kuvatulla tavalla, jolloin saatiin kolme testiannosta: 0,5, 1,0 ja 2,0 mJ/cm2. Nolla-annoksen valvontatutkimukset tehtiin excimer-lampun ollessa sammutettuna. Kun näytteenottojakso oli päättynyt, BioSamplerin liuosta käytettiin viruksen infektiivisyysmäärityksiin.
Viruksen infektiivisyysmääritykset
TCID50
Käytimme 50 %:n kudosviljelmien infektiivisen annoksen määritystä viruksen infektiivisyyden määrittämiseksi28. Lyhyesti sanottuna 105 isäntäsolua sijoitettiin 96-kuoppalevyjen kuoppiin päivää ennen koetta. Solut pestiin kahdesti HBSS++:lla, ja soluille asetettiin BioSamplerista saadun altistuneen viruksen sarjalaimennokset 1:10 infektioväliaineessa kahden tunnin ajaksi. Tämän jälkeen solut pestiin kahdesti HBSS++:lla, peitettiin tuoreella infektiomediumilla ja inkuboitiin kolme tai neljä päivää 34 °C:ssa. Sytopaattiset vaikutukset (CPE) pisteytettiin kirkkaalla kenttämikroskoopilla (10 ×) sytoplasman vakuolisoitumisena, solujen pyöristymisenä ja irtoamisena. TCID50 laskettiin Reedin ja Muenchin menetelmällä28,38. CPE-pisteiden vahvistamiseksi näytteet kiinnitettiin 100-prosenttiseen metanoliin viideksi minuutiksi ja värjättiin 0,1-prosenttisella kristallivioletilla. Tulokset ilmoitetaan arviona plakkia muodostavista yksiköistä (PFU)/ml käyttäen muunnosta PFU/ml = 0,7 TCID50 soveltamalla Poisson-jakaumaa29.
Immunofluoresenssi
Arvioidaksemme, vähensivätkö kasvavat 222 nm:n valon annokset infektoituneiden solujen lukumäärää, suoritimme tavanomaisen fluoresenssi-immunovärjäysprotokollan virusantigeenin havaitsemiseksi isäntänä toimivassa ihmissolukuvussa23. Lyhyesti sanottuna 2 × 105 isäntäsolua (MRC-5-solut HCoV-229E:n osalta ja WI-38 HCoV-OC43:n osalta) sijoitettiin 48-kuoppalevyjen kuoppiin päivää ennen koetta. Kun säteilytyskammion läpi oli kuljettu 30 minuuttia, 150 μl BioSamplerista kerättyä virussuspensiota levitettiin isäntäsolujen monokerrokselle. Soluja inkuboitiin viruksen kanssa tunnin ajan, minkä jälkeen ne pestiin kolme kertaa HBSS++:lla ja inkuboitiin sitten yön yli tuoreessa infektiomediumissa. Tartunnan saaneet solut kiinnitettiin sitten 100-prosenttisessa jääkylmässä metanolissa 4 °C:ssa 5 minuutin ajan ja leimattiin anti-human coronavirus spike glycoproteinilla (40021-MM07, Sino Biologicals US Inc., Chesterbrook, PA) 1:200 HBSS++:ssa, joka sisälsi 1 % naudan seerumin albumiinia (BSA; Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA) huoneenlämpötilassa tunnin ajan kevyesti ravistellen. Solut pestiin kolme kertaa HBSS++:ssa ja leimattiin vuohen antihiiren Alexa Fluor-488:lla (Life Technologies, Grand Island, NY) 1:800 HBSS++:ssa, joka sisälsi 1 % BSA:ta, huoneenlämmössä 30 minuutin ajan pimeässä kevyesti ravistellen. Kolmen HBSS++-pesun jälkeen solut värjättiin DAPI:tä (4′,6-diamidino-2-fenylindoli) sisältävällä Vectashieldillä (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ja niitä tarkkailtiin Olympus IX70 -fluoresenssimikroskoopin 10-kertaisella objektiivilla, joka oli varustettu Photometrics PVCAM -korkearesoluutioisella, tehokkaalla digitaalikameralla ja Image-Pro Plus 6.0 -ohjelmalla (Media Cybernetics, Bethesda, MD). Kunkin 222 nm:n annoksen ja virussuvun osalta edustavat tulokset toistettiin kahdesti. Jokaisesta näytteestä otettiin enintään kymmenen näkökenttää yhdistettyjä DAPI- ja Alexa Fluor-488-kuvia.
Tietojen analysointi
Viruksen eloonjäämisfraktio (S) laskettiin jakamalla PFU/ml:n fraktio kullakin UV-annoksella käytetyllä PFUUV:llä (PFUUUV) nolla-annoksella käytetyllä fraktiolla käytetyllä PFUcontrols:lla: S = PFUUV/PFUcontrols. Eloonjäämisarvot laskettiin jokaiselle toistokokeelle ja ne muunnettiin luonnolliseksi logaritmiksi (ln), jotta virhejakauma saatiin lähemmäksi normaalia39. Robusti lineaarinen regressio, jossa käytettiin iteroituja uudelleen painotettuja pienimpiä neliöitä (IWLS)40,41 , tehtiin R 3.6.2 -ohjelmistolla käyttäen näitä normalisoituja ln-arvoja riippuvaisena muuttujana ja UV-annosta (D, mJ/cm2) riippumattomana muuttujana. Tätä lähestymistapaa käyttäen viruksen eloonjäämistä kuvattiin ensimmäisen kertaluvun kinetiikalla yhtälön4 mukaisesti:
jossa k on UV-inaktivoitumisnopeusvakio tai herkkyystekijä (cm2/mJ). Regressio suoritettiin siten, että leikkaustermi asetettiin nollaan, mikä edustaa määritelmää 100 prosentin suhteellisesta eloonjäämisestä UV-annoksen ollessa nolla, erikseen kullekin tutkitulle viruskannalle. Tietoja nolla-annoksella, jotka määritelmän mukaan edustavat ln = 0, ei otettu mukaan regressioon. Kunkin viruskannan k-parametrin epävarmuudet (95 prosentin luottamusväli, CI) arvioitiin bootstrapping-menetelmällä kullekin regressiomenetelmälle, koska bootstrapping-menetelmällä voidaan saada realistisempia epävarmuusestimaatteja verrattuna tavanomaiseen asymptoottiseen normaalisuuteen perustuvaan analyyttiseen approksimaatioon pienissä tietokokonaisuuksissa, kuten tässä käytetyissä tietokokonaisuuksissa (n = 3:lla HCoV-229E:llä ja n = 4:llä HCoV-OC43:lla). Soveltuvuutta arvioitiin määrityskertoimen (R2) avulla. Jäännösten analyysi autokorrelaation ja heteroskedastisuuden varalta tehtiin Durbin-Watson-testillä42 ja Breusch-Pagan-testillä (toteutettu lmtest R-paketissa)43. Kunkin viruskannan parametriestimaatteja (k) verrattiin toisiinsa 95 prosentin CI:n perusteella ja suoraan t-testillä käyttäen otoskokoja, k-arvoja ja niiden keskivirheitä. Viruksen inaktivoinnin poikkileikkaus D90, joka on UV-annos, joka inaktivoi 90 prosenttia altistuneesta viruksesta, laskettiin seuraavasti: D90 = – ln/k. Muut D-arvot laskettiin samalla tavalla.