Alai

Aksiaaliset kromatiinista vapaat ontelot esiintyvät kasveissa, joiden keskimääräinen 2C-DNA-pitoisuus ylittää 0.8 pg kromosomia kohti

Joidenkin kasvien nafaasi- ja telofaasikromatideissa on aksiaalialueilla kromatiinittomia onkaloita, jotka erottavat nämä kasvit suurimmasta osasta muita tähän mennessä tutkittuja kasveja ja eläimiä (Kuva 1a, b). Tietojemme mukaan tällaista kromosomiorganisaatiota kuvaavat raportit rajoittuvat kasveihin, joilla on suuri genomi, ja voidaan olettaa, että tällainen morfologinen organisaatio on näiden kasvien erityispiirre. Varmistaaksemme tämän oletuksen analysoimme myös 12 lajin anafaasi- ja telofaasikromatideja elektronimikroskopian avulla (taulukko 1; kuvat 1a, b; lisätiedosto 1: kuva S1). Kuva 1c osoittaa, että aksiaalisia kromatiinittomia onteloita näkyi selvästi vain sellaisten kasvien kromosomien sisällä, joilla oli suuret genomit ja suuret kromosomit, mutta näytti siltä, että keskimääräinen kromosomikoko korreloi paremmin näiden onteloiden esiintymisen tai puuttumisen kanssa. Kasveista, joissa oli aksiaalisia onkaloita, Hordeum vulgaren genomi oli pienin ja keskimääräinen 2C-DNA-pitoisuus kromosomia kohti oli pienin (0,79 pg). Tämä kromosomiorganisaatio on siis tunnusomaista kasvien kromosomeille, joiden 2C-DNA-pitoisuuden voidaan karkeasti arvioida ylittävän 0,8 pg kromosomia kohti.

Kromosomikondensaatio/dekondensaatio voidaan havainnollistaa puoliohuissa leikkauksissa N. damascena-soluissa 4′,6-diamidino-2-fenylindoli (DAPI) -värjäyksen jälkeen

Kasvien kromosomien tutkimiseen sopivin kohde, juuren apikaalinen meristemi, ei mahdollista korkearesoluutioisten kuvien ottamista tarkennuksen ulkopuolisen fluoresenssin vuoksi. Tässä käytimme menetelmää, joka perustuu LR White -mediumiin upotettujen juurten puoliohuiden (200-250 nm) leikkausten levittämiseen. Näiden leikkeiden paksuus oli huomattavasti pienempi kuin optisten leikkeiden, vaikka käytettiin konfokaalimikroskooppia. Löytääksemme morfologiset ominaisuudet, joiden avulla pystyimme tunnistamaan eri mitoosivaiheissa olevat solut, analysoimme DAPI:lla värjättyjen solujen morfologiaa.

N. damascena -juuren kromosomiorganisaatiossa oli useita muutoksia, jotka olivat helposti havaittavissa jopa fluoresenssimikroskoopilla. Varhaisen profaasin tuman sisällä näkyi osia ohuista kromosomeista (halkaisijaltaan noin 0,6 μm) (kuva 2a). Keskimmäisessä profaasissa muodostui paksumpia profaasikromosomeja (noin 1,2 μm), joiden sisällä voitiin erottaa ohuempia kuituja, jotka todennäköisesti vastasivat taittuneita varhaisen profaasin kromosomeja (kuva 2b). Myöhäisen profaasin (kuva 2c), metafaasin (kuva 2d) ja anafaasin (kuva 2e) kromosomit olivat tiheästi tiivistyneitä, eikä sisäistä organisoitumista havaittu. Dekondensaation aikana telofaasissa halkaisijaltaan noin 0,4 μm:n suuruisten kromatiinisäikeiden erottuminen johti kromatiinittomien onteloiden ilmaantumiseen kromatidien aksiaalialueille (kuva 2f), joiden koko kasvoi vähitellen telofaasin aikana (kuvat 2g ja h). Kromatiinikuitujen halkaisija telopaasikromosomeissa oli verrattavissa varhaisen profaasin kromosomien kokoon. Näin ollen N. damascena -lajin kaikki mitoosivaiheet olivat helposti havaittavissa DAPI:lla värjätyissä puoliohuissa leikkeissä.

Kromosomien kondensoituminen/dekondensoituminen mitoosin aikana analysoituna 5-etynyyli-2′-deoksiuridiinin (EdU) inkorporaation jälkeen

Profaasin aikana ohuet varhaisen profaasin kromosomit muuttuivat paksuiksi myöhäisen profaasin kromosomeiksi. Profaasikromosomien paksuuntuminen voi johtua joko varhaisen profaasin kromosomien taittumisesta tai sen asteittaisesta paksuuntumisesta. Näiden kahden mahdollisen mekanismin tutkimiseksi oli tarpeen merkitä erilliset kromosomipesäkkeet, jotka olivat lineaarisesti järjestäytyneet varhaisen profaasin kromosomien sisällä, ja sen jälkeen analysoida niiden tilallisia uudelleenjärjestelyjä profaasin tiivistymisen aikana. Kuten kuvassa 3a on esitetty, siirtyessään varhaisesta profaasista myöhäiseen profaasiin tällaiset fokaalit joko menettävät lineaarisen järjestyksensä (taittuminen) tai säilyttävät lineaarisen järjestyksensä ja venyttävät fokaalit ohuiksi kaistoiksi (paksuuntuminen). Kromosomialueiden merkitsemiseksi sisällytimme kromatiiniin replikaation aikana synteettistä nukleotidia EdU:ta, joka voidaan havaita klikkauskemian avulla.

EdU:ta inkorporoitiin 30 minuutin ajan N. damascena -lajin juuriin, ja erilaisten ajojaksojen (2-14 h) jälkeen tehtiin kromosomilevitykset. Kromosomien leimautumisessa havaittiin kolme mallia: erillisten alueiden leimautuminen (malli 1), kromosomivarsien mutta ei sentromeerien leimautuminen (malli 2) ja sekä kromosomivarsien että sentromeerien leimautuminen (malli 3) (kuva 3b). Kuvio 1 havaittiin useammin 4 tunnin kuluttua EdU:n sisällyttämisestä, mikä osoittaa, että tällainen merkintä oli tyypillistä myöhäiselle S-vaiheelle (kuva 3c; lisätiedosto 2: kuva S2). Kuvion 1 tapauksessa homologisten kromosomien leimautuminen oli samanlaista (lisätiedosto 3: kuva S3), mikä viittaa erityiseen EdU:n sisällyttämismalliin. Kromosomivarret leimattiin S-vaiheen loppupuolella (kuviot 2 ja 3), mutta myös sentromeeriset alueet leimattiin suunnilleen varhaisen ja myöhäisen S-vaiheen rajalla (kuvio 3) (kuva 3c) (kuva 3).

Analysoimme siirtymiä varhaisesta profaasista myöhäiseen kromosomeihin käyttämällä kromosomeja, joissa myöhään monistuva kromatiini oli leimattu (kuvio 3). Varhaisen profaasin kromosomeissa leimatut alueet jakautuivat lineaarisesti pitkin ohuita kromosomeja (kuva 4a). Myöhäisen profaasin kromosomeissa, jotka olivat noin kaksi kertaa paksumpia kuin varhaisen profaasin kromosomit, merkityt alueet menettivät lineaarisen jakautumisensa (kuva 4b). Tämä havainto ei ollut täysin pätevä, koska profaasi- ja metafaasikromosomit koostuvat kahdesta kromatidista, jotka vähitellen segregoituvat , ja tämä voi johtaa leimattujen alueiden lineaarisen jakautumisen häviämiseen. Siksi analysoimme edelleen anafaasikromatideja (eli täysin tiivistyneitä kromosomeja kromatidien erottumisen jälkeen). Anafaasikromatideissa, joiden halkaisija oli suunnilleen sama kuin myöhäisen profaasin kromosomien halkaisija, leimatut kromatiinialueet eivät olleet lineaarisesti järjestäytyneitä, vaan ne jakautuivat koko kromatidien tilavuuteen (kuva 4c). Telofaasissa kromatiinittomat ontelot olivat selvästi näkyvissä kromatidien aksiaalisilla alueilla, mikä mahdollisti kromatiinikuitujen havaitsemisen, joiden sisällä leimatut alueet olivat järjestäytyneet lineaarisesti (kuva 4d). Siirryttäessä varhaisesta profaasista myöhäiseen profaasiin tapahtui siis varhaisen profaasin kromosomien taittuminen. Tämä tulos on sopusoinnussa havaintojen kanssa DAPI-värjätyistä keskimmäisen profaasin kromosomeista (kuva 2b), joiden sisällä näkyi selvästi taittuneita ohuita kuituja.

Kromosomien kondensaatio/dekondensaatio mitoosin aikana analysoituna elektronimikroskopialla

Kromatiinisäikeiden sisäisen järjestäytymisen havaitsemiseen, joiden taittumista kuvattiin valomikroskopialla, käytimme elektronimikroskopiaa. Kromatiinifibrillisten alarakenteiden havaitsemiseksi ja mittaamiseksi analysoimme kromatiinittomia onteloita, jotka erottivat kromatiinisäikeet toisistaan, kuten oletimme (Lisätiedosto 4: Kuva S4; Taulukko 2).

Välivaiheen tumat olivat täynnä 234 ± 49 nm (keskiarvo ± S.D.) paksujen 234 ± 49 nm:n (keskiarvo ± S.D.) kuitujen verkostoa (kuva 5a), jota voidaan kutsua ”välivaiheen kromosomiksi”, kuten muualla käsitellään . Elektronimikroskopian avulla voitiin havaita kolme kromosomien profaasikondensaation vaihetta, joista varhaisinta ei ollut mahdollista havaita valomikroskopian avulla, ja sitä kutsutaan tässä ”preprofaasiksi”. Toinen ja kolmas vaihe vastasivat edellä kuvattua varhaista ja myöhäistä profaasia (kuvat 2a ja c).

(1) Preprofaasissa kromosomit olivat huonosti erillään toisistaan, emmekä voineet mitata niiden halkaisijaa tarkasti (kuva 5b). Preprofaasikromosomit muodostuivat kuiduista, joiden halkaisija oli 148 ± 30 nm (taulukko 2), mikä vastasi todennäköisesti halkaisijaltaan 100-130 nm:n kuituja (kromonema), jotka ovat eläinsolujen profaasi- ja telofaasikromosomien pääasiallinen kromosomien alarakenne . Aineiston perusteella ei voitu selvittää interfaasin ja mitoosin kromoneemojen identiteettiä, mutta aiemmin raportoidut tiedot viittaavat siihen, että interfaasin kromoneemat ovat taitettujen kromoneemojen muodostamia komplekseja .

(2) Varhaisessa profaasissa tapahtui kromosomien erottuminen toisistaan (kuva 5c). Kromosomien halkaisija oli 527 ± 107 nm, ja myös nämä kromosomit muodostuivat kromoneemoista, joiden halkaisija oli 158 ± 46 nm.

(3) Lopuksi analysoimme myöhäisen profaasin soluja, jotka sisälsivät paksuuntuneita kromosomeja, joiden halkaisija oli 809 ± 185 nm (kuva 5d). Joissakin myöhäisen profaasin kromosomeissa oli aksiaalialueilla onkaloita, joiden avulla pystyimme erottamaan kuidut, joiden halkaisija oli 285 ± 102 nm (”300 nm:n kuitu”). Analyysi leimattujen kromosomisegmenttien avulla osoitti, että varhaisen profaasin kromosomit taittuivat muodostaen paksumpia myöhäisen profaasin kromosomeja (kuva 4). Siksi voidaan olettaa, että 285 ± 102 nm:n kuidut ja 527 ± 107 nm:n varhaisen profaasin kromosomit olivat samoja kuituja. Kuitujen pienentynyt halkaisija saattaa liittyä varhaisen profaasin kromosomien kromatiinin tiivistymiseen, mihin viittasi myös näkyvien kromosomien katoaminen.

Kromatiini metafaasikromosomien (kuva 5e) ja anafaasikromatidien (kuva 6a) sisäpuolella oli erittäin tiivistynyttä, ja vaikka niiden sisäpuolella oli havaittavissa harvinaisia kromatiinittomia onteloita, oli mahdoton erottaa tarkasti mahdollisia fibrillarisia alarakenteita. Varhaisen telopaasin kromosomeissa havaittiin selvästi kahdenlaisia onkaloita (kuva 6b). Suuret onkalot sijaitsivat kromatidien aksiaalisella alueella, minkä ansiosta pystyimme tunnistamaan ja mittaamaan kuituja, joiden halkaisija oli 422 ± 78 nm. Näiden kuitujen keskiosissa havaittiin pieniä onkaloita, joiden avulla voitiin tunnistaa toisen tyyppinen kuitu, jonka halkaisija oli 182 ± 47 nm. Ensin mainittu kuitutyyppi saattaa vastata myöhäisen profaasin kromosomien sisällä olevia ”300 nm:n kuituja” ja jälkimmäinen kuitutyyppi kromosomeja.

Viimeisessä telofaasissa (kuva 6c) ja G1-vaiheessa (kuva 6c). 6d), kromosomit dekondensoituivat kromosomialueiksi tytärytimissä, joissa niitä ei voida helposti havaita. Erilliset kromatidifragmentit oli kuitenkin mahdollista tunnistaa. Tässä vaiheessa kromatidit muodostuivat kuiduista, joiden halkaisija oli noin 250 nm, mikä vastaa suunnilleen interfaasikromosomien halkaisijaa. Tämä havainto sekä kromonemaattisten kuitujen katoaminen viittasivat siihen, että tässä mitoosin vaiheessa kromatiinikuidut taittuivat uudelleen muodostaen interfaasikomplekseja, jotka koostuivat tiivistyvästä kromatiinista.