Alai

Lämpötila-alueen määrittäminen

Laboratorio-olosuhteet, joita käytetään yleisesti Macrostomum lignano -bakteeriviljelyssä, ovat seuraavanlaiset: lämpötilan ollessa 20 °C, ilmankosteuden ollessa 60 %, ja valoisan/pimeän vuorokauden jakson ollessa 14 h/10 h. Nämä olosuhteet valittiin pääasiassa siksi, että ne ovat optimaaliset matojen pääasiallisena ravinnonlähteenä toimivan Nitzschia curvilineata -diatomin kasvulle. Arvioidaksemme kokeessa käytettäviä lämpötilaolosuhteita määritimme ensin lämpötila-alueen, jossa madot selviytyvät. Vaikka matojen jäädyttäminen osoittautui tappavaksi, ne selviytyivät, kun niitä pidettiin 4 °C:ssa vähintään kaksi viikkoa. Koska diatomi ei kuitenkaan kasva näissä olosuhteissa, päätimme jättää 4 °C:n lämpötilan pois jatkokokeista. Myös muut alle 20 °C:n lämpötilat jätettiin kokeen ulkopuolelle, koska tutkimuksen ensisijaisena tavoitteena oli löytää olosuhteet, jotka nopeuttavat kasvua ja kehitystä. Lämpötilaspektrin toisella puolella madot liukenivat, kun niitä pidettiin 42 °C:ssa kaksi tuntia, ja ne kuolivat viikon kasvatuksen jälkeen 37 °C:ssa. Siksi päätimme käyttää koeolosuhteina 20 °C:ta, 25 °C:ta, 30 °C:ta ja 35 °C:ta tutkiaksemme lämpötilan pitkäaikaisvaikutuksia M. lignanoon (kuva 1).

Lämpöshokkivaste

Selvittääksemme sitä, mitkä lämpötilat indusoivat stressivasteen matoihin, seurasimme lämpöshokki 20:n promoottorin aktiivisuutta (Mlig-hsp20). Ensin suoritimme kvantitatiivisen RT-PCR:n Mlig-hsp20:n ilmentymistason mittaamiseksi lämpötiloissa 20 °C, 25 °C, 30 °C, 33 °C, 34 °C ja 35 °C. Hsp20:n ilmentymistasossa ei ollut merkittävää eroa 20 °C:n ja 25 °C:n välillä (kuva 2a). Ekspressiossa havaittiin kuitenkin pieni (2-kertainen) mutta merkitsevä (P = 0,027, t-testi) lisäys 30 °C:ssa verrattuna 20 °C:een (kuva 2a). Ekspressiotason yli kymmenkertaistuminen havaittiin 33 °C:ssa, ja se kasvoi yli 100-kertaiseksi korkeimmassa testatussa lämpötilassa 35 °C:ssa (kuva 2a). Toisessa testissä loimme siirtogeenisen linjan, joka ilmentää mScarlet-I-proteiinia Mlig-hsp20-promoottorin ohjaamana (kuva 2b), ja mittasimme fluoresenssin tason 24 tunnin kuluttua kahden tunnin inkubaatiosta eri lämpötiloissa, jotka vaihtelivat 20 °C:sta 37 °C:een (kuvat 2c, d). Fluoresenssin yli kaksi- ja kymmenkertaistuminen havaittiin 34 °C:n ja 37 °C:n lämpötiloissa (kuva 2c).

Alkiokehityksen nopeus

Morrisin ym. mukaan Macrostomum-munien täyskehitys kestää Morrisin ym. mukaan noin 120 tuntia (viisi vuorokautta), kun munia pidetään 20 °C:ssa. Tutkiaksemme, miten lämpötila vaikuttaa alkionkehityksen ja kuoriutumisen nopeuteen, poimimme tuoreet alkiot ja seurasimme niiden kehitystä kuoriutumiseen asti eri lämpötiloissa. Tutkiaksemme mahdollisia geneettisestä taustasta johtuvia eroja käytimme kahta M. lignano -linjaa, joita käytetään tällä hetkellä useimmissa M. lignanoa koskevissa tutkimuksissa, DV1- ja NL10-linjoja. Nämä linjat ovat itsenäisesti peräisin samasta maantieteellisestä sijainnista peräisin olevista villityypin populaatioista, ja ne eroavat toisistaan kokokromosomiduplikaatiolla, mutta käyttäytyvät muuten hyvin samankaltaisesti laboratorio-olosuhteissa. Tutkimme ensin alhaisen lämpötilan vaikutusta. Munien kehitys pysähtyy 4 °C:n lämpötilassa, ja niitä voidaan säilyttää vähintään kuukauden ajan, ja niiden kehitys jatkuu, kun ne palautetaan korkeampiin lämpötiloihin. Seuraavaksi tutkittiin, kuinka nopeasti munat kehittyvät 20-35 °C:n lämpötiloissa. Kuten kuvasta 3 käy ilmi, kun munia pidettiin vakio-olosuhteissa (20 °C), ne alkoivat kuoriutua kuuden päivän kuluttua. Lämpötilan nostaminen johti suhteellisesti nopeampaan alkionkehitykseen ja aikaisempaan kuoriutumiseen, joka oli kaksi kertaa nopeampaa 35 °C:ssa kuin 20 °C:ssa ja kesti vain kolme päivää. Huomionarvoista on, että noin 10 prosenttia munista jäi kuoriutumatta kahdeksan päivän haudonnan jälkeen 20 °C:ssa, kun taas korkeammissa lämpötiloissa vastaava luku oli alle 5 prosenttia, mikä viittaa siihen, että korkeimmallakaan testatulla 35 °C:n lämpötilalla ei ole haitallisia vaikutuksia alkioiden selviytymiseen.

Sukupuolistuminen

Sukupuolistumisnopeus on erittäin tärkeä tekijä malliorganismille, sillä eläimet, joilla on lyhyempi sukupolven aika, mahdollistavat nopeamman tiedon tuottamisen geneettisissä kokeissa. Lisäksi jos eläimet tuottavat suuren määrän jälkeläisiä, tuotetulla datalla on useimmissa tapauksissa suurempi tilastollinen teho.

Arvioidaksemme lämpötilan vaikutusta M. lignano -lajin lisääntymisnopeuteen olemme vertailleet eri lämpötilaolosuhteissa pidettyjen matojen viiden viikon aikana tuottamien jälkeläisten määrää. Koe aloitettiin poikasilla, jotta postembryonaalinen kehitys saatiin sisällytettyä tutkimukseen, ja siinä käytettiin sekä DV1- että NL10-linjaa. Molempien linjojen poikasilla kesti kolme viikkoa kasvaa ja tuottaa ensimmäiset jälkeläiset 20 °C:n lämpötilassa, kun taas 25 °C:n lämpötilassa NL10-linjan poikasia havaittiin kahdessa viikossa, mutta DV1-linjan poikasia ei. 30 °C:ssa ja 35 °C:ssa molemmat linjat tuottivat jälkeläisiä jo kahden viikon kuluttua (kuva 4). Kolmesta viikosta alkaen viikoittain tuotettujen poikasten määrä kasvoi alle 200:sta 20 °C:n lämpötilassa yli 300:aan yli 20 °C:n lämpötiloissa; poikasten määrä oli suurin 30 °C:ssa pidetyillä matoilla. Tämä päti molempiin geneettisiin taustoihin, emmekä havainneet merkittäviä eroja DV1- ja NL10-linjojen välillä (kuva 4).

Vaikka 30 °C:n ja sitä korkeammissa lämpötiloissa kuoriutui enemmän poikasia, se aktivoi myös lämpösokkivasteen (kuva 2). Tutkiaksemme kohonneen lämpötilan pitkäaikaisvaikutusta ja sen matoihin mahdollisesti aiheuttamia stressitekijöitä pidimme matoja valituissa lämpötiloissa ja seurasimme morfologisia poikkeavuuksia kolmen ja kuuden kuukauden viljelyn jälkeen. 25 °C:ssa pidetyissä matoissa ei ollut morfologisia muutoksia kummassakaan tarkastuspisteessä verrattuna 20 °C:ssa pidettyihin matoihin (kuva 5). Sekä 30 °C:n että 35 °C:n lämpötiloissa havaittiin kuitenkin erilaisia poikkeavuuksia yleisessä morfologiassa. Kolmen kuukauden kuluttua kystien, vaurioituneen kudoksen ja suurentuneiden kivesten määrä kasvoi yleisesti sekä DV1- että NL10-linjoissa (kuva 5). Yksikään 35 °C:n lämpötilassa pidetyistä madoista ei selvinnyt kuuden kuukauden tarkastuspisteeseen asti, ja kaikissa 30 °C:n lämpötilassa elossa olleissa matoissa oli morfologisia poikkeavuuksia (kuva 5). Näin ollen pitkäaikainen altistuminen yli 30 °C:n lämpötiloille on haitallista M. lignanolle.

Regeneraatioaika

Koska M. lignanon tärkein vetovoimatekijä malliorganismina on sen uudistumiskyky, tutkimme seuraavaksi, miten lämpötila vaikuttaa uudistumiseen. On yleisesti hyväksytty, että korkeampi lämpötila johtaa yleisen metabolisen aktiivisuuden lisääntymiseen . Arvioidaksemme lämpötilan vaikutusta aikaan, jonka mato tarvitsee kehon täydelliseen uudistumiseen kivesten alueen yläpuolella tapahtuneen amputaation jälkeen, seurasimme kivesten uudistumista ja siittiöiden ilmaantumista vesicular seminalikseen käyttämällä aiemmin luotua siirtogeenistä linjaa NL22, joka ilmentää GFP:tä kiveksille ja siittiöille spesifisen ELAV-promoottorin ohjaamana . Tällaisen siirtogeenisen merkkiaineen käyttö tarjoaa paremman tarkkuuden, johdonmukaisuuden ja tehokkuuden regeneroitumisen laajuuden arvioinnissa. Emme nimittäin havainneet merkittävää vaihtelua arvioitaessa GFP-signaalin ilmestymisajankohtaa amputaation jälkeen kaikissa testatuissa lämpötiloissa (taulukko 1).

Odotusten mukaisesti regeneraation nopeus lisääntyi lämpötilan myötä (taulukko 1). Jos vakionopeudeksi otetaan regeneraatioaika 20 °C:n lämpötilassa, lasketut lämpötilakertoimet kivesten regeneraatiolle ovat Q10 = 4 25 °C:n lämpötilassa ja Q10 = 3 30 °C:n ja 35 °C:n lämpötiloissa. Tämä osoittaa, että suurin vaikutus saadaan, kun lämpötilaa nostetaan 25 °C:een, ja nopein regeneraatio tapahtuu 30 °C:ssa ilman, että lämpötilan nostamisesta olisi muuta hyötyä regeneraatioaikaan. Näin ollen 25 °C:n ja 30 °C:n lämpötilat olisi otettava huomioon M. lignano -lajin regeneraatiokokeissa, koska se lyhentää kokeen kestoa kahdesta kolmeen kertaan (taulukko 1).

RNA-interferenssi

Geenien ilmentymisen vähentäminen RNA-interferenssillä (RNAi) on tällä hetkellä ensisijainen lähestymistapa M. lignano -lajilla tehtävissä toimintakyvyn häviämisen tutkimuksissa. Tässä lähestymistavassa eläimiä liotetaan kaksisäikeisellä RNA:lla kohdegeeniä vastaan, ja fenotyypin havaitsemiseen tarvitaan usein useita viikkoja kestäviä pitkäkestoisia käsittelyjä . Olemme testanneet, miten lämpötila vaikuttaa fenotyypin kehittymisen nopeuteen RNAi-hoidon jälkeen. Tätä varten tyrmäsimme Mlig-ddx39-geenin, joka tunnetaan M. lignanon solujen lisääntymiseen liittyvästä toiminnastaan, ja saimme aikaan vankan tappavan tyrmäysfenotyypin . Samoin kuin lisääntymiskokeessa, käytimme tähän kokeeseen DV1- ja NL10-linjoja (taulukko 2). 20 °C:ssa kesti noin 20 päivää, ennen kuin kaikki eläimet kuolivat Mlig-ddx39:n knockdownin jälkeen. Kun matoja pidettiin korkeammissa lämpötiloissa, kuolema tapahtui nopeammin: 25 °C:ssa pidetyillä matoilla 11 ja 30 °C:ssa pidetyillä matoilla 8 päivässä. Kokeessa käytettyjen kahden kannan välillä ei ollut näkyvää eroa (taulukko 2). Seuraavaksi tutkittiin, johtuuko ddx39 RNAi -fenotyypin ilmenemisnopeuden havaittu nopeutuminen korkeammissa lämpötiloissa RNAi:n avulla tapahtuvan geenin tyrmäyksen suuremmasta tehokkuudesta vai muista tekijöistä. Tätä varten mittasimme qRT-PCR:llä Mlig-ddx39-transkriptien runsauden eri ajankohtina RNAi-kokeen aloittamisen jälkeen eri lämpötiloissa (kuva 6). Vertailukontrolleina käytettiin eläimiä, joita oli käsitelty dsRNA:lla gfp:tä vastaan. Kaikissa testatuissa lämpötiloissa Mlig-ddx39:n ekspressiotasoissa ei havaittu merkittäviä eroja kontrollinäytteiden välillä kokeen aikana (kuva 6). Samaan aikaan Mlig-ddxx39-dsRNA:lla käsitellyissä eläimissä ddx39-transkriptien taso laski ~ 80 prosenttia jo yhden hoitopäivän jälkeen 20 °C:n tai 25 °C:n lämpötiloissa, ja 30 °C:n lämpötilassa lasku oli vielä suurempi, ~ 90 prosenttia. Seuraavien päivien aikana knockdown-tasot kuitenkin vakiintuivat noin 95 prosenttiin kaikissa lämpötiloissa. Näin ollen voimme päätellä, että lämpötila ei vaikuta merkittävästi itse RNAi:n kinetiikkaan. Sen sijaan havaittu Mlig-ddx39 RNAi -fenotyypin ilmenemiseen kuluvan ajan lyheneminen korkeammissa lämpötiloissa voidaan selittää lisääntyneellä solujen vaihtumisnopeudella.

Testataksemme, voidaanko RNAi-fenotyyppien kehittymisen kiihtyminen korotetuissa lämpötiloissa yleistää koskemaan muitakin geenejä, tutkimme Mlig-sperm1-geeniä, jonka tyrmäys johtaa epänormaaliin siittiöiden morfologiaan ja suurentuneisiin kiveksiin . Tämä on hidas RNAi-fenotyyppi, jonka kehittyminen 20 °C:ssa kestää 2-3 viikkoa . Kvantifioidaksemme fenotyypin laajuuden eri lämpötiloissa laskimme RNAi-hoidon neljäntenä päivänä niiden eläinten osuuden, joiden kivekset olivat laajentuneet niin paljon, että ne koskettivat toisiaan. (Kuva 7). Samoin kuin Mlig-ddx39 RNAi:lla saadut tulokset, korkeammat lämpötilat johtivat fenotyypin nopeampaan kehittymiseen, ja vaikka neljän päivän dsRNA-hoidon jälkeen 20 °C:n lämpötilassa ei havaittu yhtään riittävän suurentunutta kivestä, 25 °C:n lämpötilassa 25 %:lla ja 30 °C:n lämpötilassa 85 %:lla eläimistä oli suurentuneet kivekset (taulukko 2). Uudistumisen tavoin RNAi-fenotyypit voivat siis nopeutua lämpötilan myötä M. lignano -lajissa, ja korkeampia lämpötiloja voidaan käyttää kokeiden keston lyhentämiseksi.

.