Alai

RTT-fibroblastien autofagian aktivoituminen nälkiintymisolosuhteissa on puutteellista

Varmistaaksemme RTT-potilaiden autofagiahypoteesin, analysoimme autofagian aktivoitumista nälkiintymisolosuhteissa RTT-potilaista (n = 4) ja terveistä henkilöistä (n = 4) eristetyissä ihon primaarisissa fibroblasteissa17,19.

Määritimme ensin terveiden ja RTT- fibroblastien, joita viljeltiin nälkäkasvatusmediassa, elinkelpoisuuden ajan mittaan sekä MTT- että Trypan sinisen poissulkemistesteillä. Normaalissa väliaineessa kasvatettujen RTT-fibroblastien elinkelpoisuuteen verrattuna RTT-fibroblastien elinkelpoisuus väheni 4 tunnin nälkiintymisen jälkeen (20 ± 3,3 % kuolevia soluja, p < 0,05); tämä prosenttiosuus kasvoi huomattavasti 6-8 tunnin nälkiintymisen jälkeen (60 ± 5,1 % kuolevia soluja, p < 0,05) (kuva 1a). Sitä vastoin terveet fibroblastit olivat edelleen täysin elinkelpoisia 4 tunnin nälkiintymisen jälkeen, ja elinkelpoisuus väheni vain hyvin vähän 6-8 tunnin jälkeen (10 ± 1,2 % kuolevista soluista, p < 0,01) verrattuna vakiomuotoisessa väliaineessa kasvatettujen fibroblastien elinkelpoisuuteen (kuva 1a). Näin ollen kahden solulinjan elinkelpoisuuden suorasta vertailusta kussakin aikapisteessä kävi ilmi, että RTT-fibroblastien elinkelpoisuus oli vakavasti heikentynyt ajasta 4 h alkaen (ks. yksityiskohdat kuvien legendoissa, p < 0,05). Lisäksi Western blotting (WB) -analyysi osoitti, että RTT-fibroblasteissa, joita oli näännytetty 4 h, poly(ADP-riboosi)polymeraasi-1:n (PARP) p25-fragmenttia vastaava kaistale oli kasvanut huomattavasti (96 ± 4 %, p < 0,001) verrattuna heikosti havaittavaan kaistaleeseen ajanhetkellä 0. Tämä fragmentti vapautuu proteiinin kaspaasi-riippuvaisesta hajoamisesta apoptoosin indusoitumisen varhaisvaiheessa (kuvio 1b)35. Terveissä fibroblasteissa p25-fragmenttia ei ollut havaittavissa juuri lainkaan samoissa koeolosuhteissa.

Nämä tiedot vahvistivat, että RTT-fibroblastit eivät sietäneet kasvua nälkäkasvatusmediassa, ja ne menivät nopeasti apoptoosiin. Siksi tutkimme edelleen autofagista virtausta seuraamalla LC3B-II-merkkiaineen puhdistumaa lysosomi-inhibiittorin, kuten klorokiinin (CQ)24,25,26,27,28,29,30, läsnä ollessa ja ilman sitä.

Kun CQ:hen liittyvä sytotoksinen vaikutus oli suljettu pois (lisäkuva S1), terveitä ja RTT-fibroblasteja kasvatettiin joko lepotilassa tai nälkäkasvatusmediassa 2 tunnin ajan 20 µM CQ:n läsnäollessa tai poissaollessa, jotta LC3B-II/GAPDH-suhde voitiin kvantifioida WB-menetelmällä (kuva 2a). LC3B-II/GAPDH-suhteen (tai minkä tahansa muun sisäisen kontrollin, jota autofagia ei muokkaa) mallia autofagian aktivointiolosuhteissa ja CQ:n (tai minkä tahansa muun lysosomaalisen inhibiittorin) läsnäollessa ja poissa ollessa pidetään pätevänä strategiana autofagian virtauksen seuraamiseksi.

Terveissä fibroblasteissa, joita viljeltiin vakioalustassa, LC3B-I oli selvästi immuno-havainnoitavissa, kun taas LC3B-II näkyi heikosti. LC3BII/GAPDH-suhde terveissä fibroblasteissa, joita viljeltiin vakioalustassa ilman CQ:ta ja CQ:n läsnä ollessa, oli vertailukelpoinen (kuva 2a, vasen paneeli). Tämä havainto viittaa siihen, että basaalinen autofagia oli lähes mahdoton havaita terveissä fibroblasteissa (kuva 2a, vasen paneeli).

Kun näitä soluja kasvatettiin nälkäkasvatusmediassa ja ilman CQ:ta 2 tunnin ajan, LC3B-II/GAPDH-suhde kasvoi (60 ± 4.8 %, p < 0,05) verrattuna terveisiin fibroblasteihin, joita viljeltiin tavanomaisessa väliaineessa joko ilman CQ:ta tai CQ:n läsnä ollessa (joka oli, kuten aiemmin mainittiin, identtinen) (kuva 2a, vasen ja oikea paneeli). Tämä käyttäytyminen osoittaa, että LC3-I todella lipidoitui LC3B-II:ksi, joka on autofagian aktivoitumisen varhainen merkkiaine24,25,26,27,28,29,30. Tämän autofagian aktivoitumisen testaamiseksi viljelimme soluja nälkäkasvatusmediassa CQ:n läsnäollessa 2 tuntia, ja niissä LC3B-II/GAPDH-suhde kasvoi edelleen (94 ± 5,5 %, p < 0,001) verrattuna terveisiin fibroblasteihin, joita viljeltiin tavallisessa mediassa (kuva 2a, vasen ja oikea paneeli).

Lisäksi nälkäkasvatusmediassa ilman CQ:ta ja CQ:n läsnä ollessa kasvatettujen terveiden fibroblastien LC3B-II/GAPDH-suhteen ero oli tilastollisesti merkitsevä (p < 0,05, kuva 2). 2a, vasen paneeli)

Näin ollen LC3B-II-kuvion vakiotulkinnan mukaan WB-analyysin avulla kokonaistulos osoittaa, että ravinteiden puuttuessa terveet fibroblastit stimuloivat autofagosomien muodostumista, jotka kerääntyvät CQ:n läsnä ollessa. Tämä käyttäytyminen on yhteensopiva normaalin autofagivirran kanssa24,25,26,27,28,29,30. Mielenkiintoista on, että tavanomaisessa väliaineessa kasvatetuissa RTT-fibroblasteissa LC3B-I oli selvästi immunologisesti havaittavissa, mutta LC3B-II oli hyvin heikosti havaittavissa soluissa sekä ilman CQ:ta että CQ:n läsnä ollessa (kuva 2a, vasen paneeli). Nälkiintymisolosuhteissa ja ilman CQ:ta LC3B-II:tä vastaavan haalean kaistan esiintyminen RTT-fibroblasteissa vasta suodattimen pitkän altistuksen jälkeen viittasi siihen, että LC3B-I:n lipidoituminen oli ainakin vähäistä (kuva 2a, vasen paneeli). Näin ollen LC3B-II/GAPDH-suhde RTT-fibroblastien välillä, joita kasvatettiin nälkäkasvatusmediassa ilman CQ:ta, oli suurentunut (93 ± 5,5 %, p < 0,001) verrattuna RTT-fibroblasteihin, joita kasvatettiin vakiomediassa ilman CQ:ta (kuva 2a, oikea paneeli).

CQ:n antaminen nälkäkasvatusmediassa kasvatetuille RTT-fibroblasteille ei kuitenkaan lisännyt entisestään LC3B-II/GAPDH-suhdetta, joka lisääntyi (95 ± 3,5 %, p < 0,001), jos sitä verrattiin soluihin, joita kasvatettiin vakiomediumissa ilman CQ:ta, mutta joka ei lisääntynyt merkitsevästi verrattuna nälkäkasvatusmediumissa kasvatettujen RTT-fibroblastien LC3B-II/GAPDH-suhteeseen, kun niitä kasvatettiin nälkäkasvatusmediumissa, jossa ei ollut läsnä CQ:ta (kuva 2 a, vasemmanpuoleinen paneeli). Tämä havainto viittasi siihen, että RTT-soluissa ei tapahdu autofagosomien kertymistä, ja WB-analyysi tuki sitä, että autofagivirta on jollakin tasolla estynyt24,25,26,27,28,29,30,31.

Vahvistaaksemme entisestään hypoteesejamme mahdollisesta viallisesta autofagivirrasta tarkistimme kahden tunnistetun autofagian reportterisubstraatin hajoamisen terveissä ja RTT-kuitublasteissa, joita oli nälkiinnytetty 2 ja 4 tuntia ilman CQ:ta, nimittäin: (i) p62/SQSMT1-proteiini, joka auttaa poistamaan polyubikititoituneita proteiiniaggregaatteja ja jota lysosomaaliset hydrolyysit itse hajottavat36; (ii) 20 S-proteasomi, joka hajoaa nopeasti nälkiintymisolosuhteissa37,38. Näiden kahden proteiinin perustasoon (eli aikaan 0) verrattuna p62/tubuliinisuhteen (44 ± 10 % 4 tunnin kuluttua, p < 0,001) ja PSMA-3/GAPDH-suhteen (eli 20 S-proteasomin α7-alayksikön) (45 ± 3,1 % 2 tunnin kuluttua, 11 ± 5,2 % 4 tunnin kuluttua, molemmissa tapauksissa p < 0,001) havaittiin vähenevän ajan mittaan terveissä fibroblasteissa (kuvio 2b, ylempi osa).

RTT-fibroblastien tapauksessa p62/tubuliinisuhteen väheneminen ajan myötä ei ollut tilastollisesti merkitsevää edes 4 h:n jälkeen (89 ± 9 %), kun taas PSMA3/GAPDH-suhteen väheneminen 2 h:n (81 ± 4,4 %, p < 0,05) ja 4 h:n (78 ± 5,1 %, p < 0,05) kohdalla poikkesi merkitsevästi toisistaan, jos sitä verrattiin proteiinien lähtötasoon (eli ajankohtaan 0) (kuvio 2b, alempaa paneelia). Erot terveiden ja RTT-ryhmien välillä olivat kuitenkin tilastollisesti merkitseviä p62/tubuliinisuhteen osalta vain 4 h:n kohdalla (p < 0,05), kun taas PSMA3/GAPDH-suhde erosi merkitsevästi koeryhmien välillä sekä 2 h:n kohdalla (p < 0.05) ja 4 h (p < 0,001) (kuva 2b, alempi paneeli).

Mielenkiintoista on, että β-tubuliini- ja GAPDH-kuviot, joita käytettiin sisäisinä kontrolleina p62-värjäykselle ja PSMA3-värjäykselle, säilyivät muuttumattomina 4 h nälkäkuolema-aikana terveissä fibroblasteissa. Kuitenkin β-tubuliinikaistaleen ja GAPDH-kaistaleen intensiteetti väheni merkittävästi RTT-fibroblasteissa, joita oli nälkiinnytetty 4 tuntia, verrattuna siihen, mitä näillä soluilla oli havaittu ajanhetkellä 0 tai ajanhetkellä 2 tuntia (kuva 2b, ylempi paneeli). Tämä väheneminen johtui todennäköisesti siitä, että tässä vaiheessa kerättyjen elävien RTT-fibroblastien määrä oli pienempi (mikä vastaa RTT-fibroblastien huonoa elinkelpoisuutta 4 tunnin nälkäkuolema-aikana, josta on raportoitu kuvassa 1a), eikä β-tubuliinin alenevasta säätelystä ajan kuluessa. Kokonaisuutena havaittiin, että RTT-fibroblastit eivät tehokkaasti hajottaneet näitä autofagian reportterisubstraatteja, mikä tukee hypoteesia viallisesta autofagiasta.

Valostaaksemme tarkemmin tämän eston piirteitä suoritimme immunofluoresenssianalyysin käyttämällä LC3B-vasta-ainetta. Analysoimme terveitä ja RTT-fibroblasteja, joita kasvatettiin vakioalustassa ilman CQ:ta (lepotila) ja nälkäkasvatusalustassa 2 tunnin ajan 20 µM CQ:n läsnäollessa tai puuttuessa (kuva 2c). Ensisijaisten solujen hitaan aineenvaihduntanopeuden mukaisesti havaitsimme, että lepotilassa olevilla terveillä ja RTT-fibroblasteilla oli heikko ja diffuusi LC3B+ -värjäytyminen, jossa oli vain pieni osuus soluista, joissa oli yli 10 pistettä (eli autofagosomia) (8 ± 5 % ja 1 ± 0,5 %), mikä osoittaa, että immunofluoresenssilla perustason autofagia oli vain heikosti havaittavissa, kuten kuvassa 1.2.2 raportoidut tiedot osoittavat. 2 a.

Vakiomediumissa kasvatettuihin soluihin verrattuna niiden terveiden fibroblastien prosenttiosuus, joita kasvatettiin nälkäkasvatusmediumissa (ilman CQ:ta) ja joissa näkyi vähintään 10 LC3B+ autofagosomia, lisääntyi selvästi (82 ± 10 %, p < 0,005), kun taas nälkäkasvatusmediumissa kasvatetuissa RTT-fibroblasteissa esiintyi lievää lisäystä (17 ± 8 %, p < 0,001). Itse asiassa nälkäkasvatusmediassa kasvatettujen terveiden fibroblastien prosenttiosuus, joissa näkyi vähintään 10 autofagosomia, oli merkittävästi suurempi kuin samoissa koeolosuhteissa kasvatettujen RTT-fibroblastien prosenttiosuus (p < 0,005). Autofagosomit olivat pääasiassa lokalisoituneet perinukleaariselle alueelle. CQ:n läsnä ollessa havaittiin lisäksi odotettu diffuusi ja voimakas LC3B+-värjäytyminen, vaikka tässä tapauksessa diffuusi värjäytyminen ei mahdollistanut pisteiden lukumäärän tarkkaa kvantifiointia.

CQ:n anto oli tehotonta RTT-fibroblasteissa, mikä osoitti selvästi autofagosomien biogeneesin olevan vakavasti heikentynyt (kuva 2c).

Ottaen huomioon autofagosomien biogeneesin oletetun heikentymisen merkityksen otettiin käyttöön ylimääräinen lähestymistapa tämän havainnon vahvistamiseksi. Sekä terveet että RTT-fibroblastit, joita oli näännytetty 2 tuntia ilman CQ:ta, värjättiin autofagosomikalvolle spesifisellä väriaineella (Cyto-ID) ja analysoitiin immunofluoresenssilla. Tässäkin tapauksessa, kun terveissä fibroblasteissa havaittiin itse asiassa useita autofagosomeja, RTT-fibroblasteissa havaittiin vain rajallinen määrä pieniä ja eristettyjä vesikkeleitä (täydentävä kuva S2). Ero niiden solujen prosenttiosuudessa, joissa oli vähintään 5 Cyto-ID-positiivista pistettä, terveiden ja RTT-fibroblastien välillä oli huomattavan merkittävä (80 ± 4 % vs. 8 ± 6 %, p < 0,001). Näin ollen kokonaisanalyysi antoi näyttöä siitä, että RTT:n primaarisissa fibroblasteissa esiintyy viallinen autofagosomien biogeneesi.

R255X MeCP2 -mutaatiota kantavien RTT-potilaiden kypsät punasolut säilyttävät mitokondrioita

Seuraavaksi pyrimme selvittämään, voidaanko RTT-potilailla havaita ex vivo muita merkkejä puutteellisesta autofagiasta. Koska mitokondrioiden puhdistuminen on klassinen autofagiaan perustuva mekanismi, joka tapahtuu verenkierrossa olevissa retikulosyyteissä RBC-soluiksi kypsymisen loppuvaiheessa32,33,34, laajensimme tutkimuksemme myös ex vivo ihmisen RBC-soluihin tarkistaaksemme, säilyvätkö mitokondriot näissä soluissa.

Siten RTT-potilaiden (n = 15) ja terveiden luovuttajien (n = 11) RBC-soluja analysoitiin transmissio-elektronimikroskoopilla (TEM, transmission electron microscopy). TEM-tutkimus toi esiin mitokondrioita muistuttavien rakenteiden (SRM) esiintymisen kaksoiskuperan muotoisissa RBC:ssä, jotka oli eristetty suurimmasta osasta RTT-potilaita (11 potilasta 15:stä). Näistä 11:stä RTT-potilaasta kolmella oli vaikeimmat oireet ja myös suuri määrä RBC:tä (20 ± 4 %) (kuva 3a-h). Odotetusti SRM:ää ei voitu havaita terveissä RBC:ssä (kuva 3I). Erot terveiden ja RTT-henkilöiden välillä olivat tilastollisesti merkitseviä (p < 0,0004; kuva 3, alempi paneeli).

Oireiden vaikeusaste perustui kuitenkin kliiniseen arvioon, ja vastaavasti niillä kolmella potilaalla, joilla oli vaikeimmat oireet, oli kaikilla MeCP2-geenin R255X-mutaatio, joka liittyy vaikeaan ennusteeseen39.

Tämän vuoksi ja ottaen huomioon, että meillä ei ollut mahdollisuutta ottaa mukaan suurempaa määrää tutkittavia, joilla oli muita mutaatioita, joilla oli matala tai nollataajuus mitokondrioita säilyttävissä punasoluissa, keskityimme näiden kolmen potilaan analyysiin. TEM-analyysi osoitti, että näissä kolmessa edellä mainitussa tapauksessa esiintyi rakenteita, jotka muistuttivat ehjiä tai osittain hajonneita mitokondrioita (joko elektronitiheitä tai läpikuultavia), jotka olivat normaalin tai käpylehmän (pitkänomaisen) muotoisia ja yleensä pieniä, ja niissä oli heikot cristae-rakenteet (kuvat 3a-h). Itse asiassa näiden rakenteiden koon ja yleisen muodon todettiin olevan yhdenmukaisia muiden kirjoittajien raportoimien, muiden kuin RTT-hiirten makroautofagian (eli Ulk1-/-hiiret) tai mitofagian (eli Nix-/-hiiret) viallisten makroautofagian mallien32,33 mitokondrioiden koon ja yleismuodon kanssa, jotka ovat säilyneet kypsissä punasoluissa. Mielenkiintoista on, että havaitsemamme mitokondrioiden morfologiset muutokset, kuten pienentynyt ulottuvuus, pitkänomainen (eli käsipainon muotoinen) rakenne ja erityisesti haaleat cristae-rakenteet on jo kuvattu RTT-potilaiden lihaksissa ja pikkuaivoissa20,21. Vahvistaaksemme SRM:n mitokondriaalisen identiteetin värjäsimme terveiden luovuttajien ja näiden vakavista oireista kärsivien RTT-potilaiden RBC:t anti-COX-IV (sytokromi c-oksidaasi) -vasta-aineella. Tilastollisesti merkittävässä osassa näiden kolmen RTT-potilaan RBC:tä verrattuna terveiden koehenkilöiden RBC:hen (35 ± 5 % vs. 0,2 ± 0,01 %, p < 0,005) näkyi COX-IV+ pistemäinen kuvio, joka viittasi mitokondrioiden jäämiseen (kuva 4). Mitokondrioiden keskimääräiseksi pitoisuudeksi solua kohti laskettiin 1,2 ± 0,2 organellia RBC:tä kohti RTT-potilailla ja 0,002 ± 0,0002 terveillä koehenkilöillä (p < 0,005) (Kuva 4). Erot mitokondrioita sisältävien punasolujen prosentuaalisessa osuudessa TEM- ja IF-tutkimusten välillä johtuvat siitä, että mahdollisuus havaita organellit TEM:llä on tiukasti riippuvainen solun ohuesta poikkileikkauksesta, joka voi estää niiden esiintymisen, kun taas IF-menetelmää ei ole rajoitettu tällä tavoin.

Vahvistaaksemme nämä tulokset tarkemmin suoritimme sytofluorimetrisen analyysin sekä terveiden koehenkilöiden että kolmen RTT:tä sairastavan potilaan RBC-veriviljelynäytteistä käyttämällä anti-CD71- (transferriinireseptori) ja anti-COX-IV-vasta-aineita. CD71-positiivisuuden, joka on epäkypsän RBC:n merkkiaine, esiintymistiheys ei eronnut merkittävästi terveillä ja RTT-potilailla (1,34 ± 0,13 % vs. 1,03 ± 0,3 %; lisäkuva S3). On korostettava, että tutkimukseen osallistuneilla RTT-potilailla oli normaalit hematologiset parametrit, ja vaikka retikulosyytti-indeksi oli ainakin parilla tutkittavista alhaisempi kuin terveillä tutkittavilla, kokonaiserot näiden kahden potilasryhmän välillä eivät olleet tilastollisesti merkittäviä (taulukko 1). Sitä vastoin terveissä RBC-soluissa havaittiin hyvin heikko COX-IV+-populaatio, kun taas RTT:n RBC-soluissa havaittiin suurempi COX-IV+-solujen esiintymistiheys (0,056 ± 0,004 % vs. 1,15 ± 0,19 %, p < 0,01). Nämä tulokset vahvistettiin edelleen käyttämällä Mitotracker Green (MT) -värjäystä (lisäkuva S3), jossa dokumentoitiin MT+ RBC-solujen lisääntyminen yhdellä RTT-potilaalla (jolla oli R255X MeCP2-mutaatio) verrattuna yhteen terveeseen potilaaseen (0,37 % vs. 0,16 %), joka oli samanlainen kuin aiemmin kuvatulla COX-IV-vasta-aineella havaittu.

SRM:n identiteetin tarkemmaksi validoimiseksi sama määrä RBC:tä lysoitiin ja analysoitiin WB:llä denaturoivissa ja pelkistävissä olosuhteissa. Suodat värjättiin vasta-aineilla sirtuin-3:aa vastaan, joka on erityisesti mitokondriomatriisissa ilmentyvä deasetylaasi40. Sirtuin3 valittiin mitokondriaaliseksi merkkiaineeksi tässä lähestymistavassa, koska toisin kuin COX-IV ja muut mitokondriaaliset merkkiaineet, sen molekyylipaino ei ole päällekkäinen hemoglobiiniketjujen tai hemoglobiinioligomeerien molekyylipainon kanssa elektroforeettisessa kuvassa. Tutkituilla kolmella RTT-potilaalla havaittiin tilastollisesti merkitsevä sirtuin-3/GAPDH-suhteen kasvu jokaisella potilaalla verrattuna samaan suhteeseen terveiden RBC-verisolujen lysaateissa (p < 0. 001) (Täydentävä kuva S4).

Näillä kolmella potilaalla, joilla kaikilla oli MeCP2-mutaatio (eli R255X), esiintyi kaikkein pahin fenotyyppi, sillä hyvin suuressa prosenttimäärässä RBC-verisoluissa näkyi vähintään yksi mitokondrio. Koska käytössämme oli kuitenkin hyvin rajallinen määrä potilaita, oli vaikea tehdä tilastollisesti merkittäviä johtopäätöksiä siitä, oliko taudin vaikeusasteen ja mitokondrioiden jäämisen laajuuden välillä yhteyttä kypsissä punasoluissa. Toinen seikka, joka vaikuttaa mainitsemisen arvoiselta, on se, että mitokondrioiden retentio kypsien punasolujen sisällä aiemmin mainituissa Ulk1-/- ja Nix-/- -hiirimalleissa johti anemiaan tai muihin veripatologioihin, jotka todennäköisesti johtuivat siitä, että pernan makrofagit poistivat nämä epänormaalit erytrosyytit entistä tehokkaammin32,33. Tähän tutkimukseen osallistuneilla RTT-potilailla havaittiin vain hyvin vähäinen ja tilastollisesti merkityksetön hematologisten arvojen lasku, eivätkä he näyttäneet olevan aneemisia tai kärsivän muista veripatologioista. Tulostemme ja hiirimalleista saatujen tulosten välinen ristiriita saattaa johtua siitä, että makroautofagia- tai mitofagia-geenien tyrmääminen (eli Ulk1-/- ja Nix-/- hiiret) johtaa siihen, että mitokondrioita sisältävien punasolujen prosenttiosuus on hyvin suuri ja että useita organelleja säilyy punasolujen sisällä, mikä on huomattavasti vakavampi vika kuin RTT-potilailla todettu vika32,33. Vaikka havaitsimme R255X-mutaatiota kantavilla potilailla huomattavan suuren määrän mitokondrioita säilyttäviä RBC-verisoluja (kuva 4), organellien määrä kussakin solussa oli hyvin pieni RTT-RBC-verisoluissa (kuva 4). Tämä ei ehkä riitä aiheuttamaan merkittäviä morfologisia ja toiminnallisia muutoksia RBC:ssä. On syytä mainita, että vaikka mitokondrioiden pidättyminen RBC-solujen sisällä voikin olla ainakin yksi tekijä, joka määrittää RTT RBC-soluissa havaitun vakavan redox-tasapainon epätasapainon yhdessä energiatilan ja aineenvaihdunnan merkittävän muutoksen kanssa (ts, ATP/ADP- ja NADH/NAD-suhde), viimeaikaisissa tutkimuksissa on raportoitu, että hapen sitoutumisen hemoglobiiniin ja hapen diffuusion kinetiikka on lähes yhteneväinen terveiden potilaiden kanssa16,17,23,41.

Tulostemme ja hiirimalleista saatujen tulosten välinen ilmeinen ristiriita saattaa selittyä myös sillä, että RTT-oireyhtymä on X-sidonnainen sairaus, joka vaikuttaa lähes yksinomaan naissukupuoleen, ja toisen X-kromosomin kahdesta kopiosta inaktivoituminen (XCI) on satunnaisilmiö, joka tapahtuu alkionmuodostuksen aikana, kuten laajalti on dokumentoitu42,43. Näin ollen RTT-oireyhtymän tapauksessa satunnaisen XCI:n odotetaan tuottavan somaattisissa soluissa mosaiikkia, jossa puolet soluista ilmentää villityyppistä alleelia ja toinen puoli ilmentää MeCP2-geenin mutatoitunutta alleelia. Mielenkiintoista on, että mahdollisuus, että ainakin osa MeCP2-mutaatioista voisi liittyä ei-sattumanvaraiseen XCI:hen hermosolukudoksessa, on sopusoinnussa RTT-potilaiden fenotyyppisen vaihtelun kanssa (ja myös tuttujen RTT-tapausten kanssa), mikä on laajasti dokumentoitu ominaisuus42,43. Teoriassa, jos puolet luuytimen hematologisista esiasteista säilyttää MeCP2-mutaation sisältävän X-kromosomin, vain puolet verenkierrossa olevista kypsistä punasoluista kantaisi patologista alleelia, mikä rajoittaisi verenkierrossa olevien mitokondrioita sisältävien punasolujen määrää. Sporadisten RTT-potilaiden verenkierrossa olevissa leukosyyteissä on kuitenkin havaittu lisääntynyt ei-sattumanvaraisen XCI:n esiintyvyys villin tyypin alleelin hyväksi42,43. Tältä osin olisi hyvin haastavaa selvittää, onko potilailla, joilla mitokondrioita sisältävien RBC-solujen määrä on vähäinen vai ei, myös mitofagian heikentyminen vähäisempää tai ei-sattumanvarainen XCI, mikä johtaisi villityyppistä MeCP2-alleelia kantavien hematologisten esiasteiden positiiviseen valikoitumiseen.

Ottaen huomioon RTT:n patologian monimutkaisuuden haluamme siis mieluummin väittää, että RTT-potilaat yhdessä Pearsonin oireyhtymästä kärsivien potilaiden kanssa voisivat edustaa ensimmäisiä tapauksia, joissa mitokondrioiden retentio on havaittavissa ihmisen kypsissä RBC-verisoluissa44.

Todisteet viallisesta autofagiasta Mecp2-null-hiirten pikkuaivoissa

Koska RTT on neurologinen kehityshäiriö, tukeaksemme entisestään tuloksiamme, jotka viittaavat systeemiseen vialliseen autofagiaan, teimme immuno-histokemiallisia analyysejä p62:n ja ubikitiinin suhteen pikkuaivoissa (i.eli elimestä, jossa on havaittu mitokondrioiden muutoksia ja muita merkittäviä histologisia poikkeavuuksia)21,45 9 viikon ikäisistä villityypin hiiristä ja 5 viikon ikäisistä (oireettomista) ja 9 viikon ikäisistä (oireisista) Mecp2 -/y-hiiristä. Kunkin koetilanteen osalta analysoitiin kolmesta eläimestä eristetty elin. Verrattuna wt:hen RTT-pikkuaivoissa p62- (kuva 5a) ja Ub-värjäytymisen (kuva 5b) voimakkuus lisääntyi kaikissa kerroksissa (eli rakeissa, Purkinje- ja kortikaalikerroksissa), mikä oli lineaarista eläinten iän myötä. Lisäksi hypervärjäytyneet rakenteet muistuttivat solunsisäisiä aggregaatteja. Joko p62/SQSTM1:n ja Ubin värjäytymisen voimakkuuden puolikvantitatiivisen arvioinnin mukaan erot 5 viikon ikäisten eläinten pikkuaivojen ja terveiden eläinten sekä 9 viikon ikäisten eläinten ja 5 viikon ikäisten eläinten pikkuaivojen välillä olivat tilastollisesti merkitseviä (p < 0.05).

Oireettomien ja oireilevien eläinten välinen histologinen ero viittaa siihen, että autofagian muutos voi puuttua tai olla heikko syntyessään, kun taas se voimistuu asteittain ensimmäisten elinviikkojen aikana (ja mahdollisesti silloin, kun MeCP2:n aktiivisuus on huipussaan), ja se synnyttää oireita.