Laboratoriolääketiede on edistynyt merkittävästi kahden viime vuosikymmenen aikana. Viruskuormitusmääritykset ovat kehittyneet pesäkkeellisistä PCR-määrityksistä transkriptiovälitteiseen monistukseen ja reaaliaikaiseen PCR:ään, ja ne kehittyvät edelleen digitaalisen PCR:n kaltaisten menetelmien myötä. Tämä kehitys on johtanut entistä herkempiin viruskuormitusmäärityksiin, joilla on laajempi dynaaminen alue, minkä ansiosta lääkärit voivat paremmin ymmärtää potilaan vastetta hoitoon ja taudin etenemistä.
Yksi esimerkki molekyylidiagnostiikan kehittymisen myötä parantuneesta potilaan hoidosta on ollut HIV-1-potilaiden hoito. Nykyisten hoito-ohjeiden mukaan hoidon onnistuminen määritellään HIV-1 RNA-pitoisuudeksi, joka on alle 75 kopiota/ml.1 Hoidon epäonnistumisen määritelmä vaihtelee maailmanlaajuisissa, kansallisissa ja maakohtaisissa ohjeissa, mutta yleensä se määritellään HIV-1 RNA-pitoisuudeksi, joka on välillä 50-1000 kopiota/ml.1-3
Nämä hoidon raja-arvot ovat reaaliaikaisten PCR-testien dynaamisen alueen alarajalla, jossa tarkkuus ja uusittavuus voivat olla haasteellisia. Viruskuormitusmäärityksen suorituskykyyn mahdollisesti vaikuttavia tekijöitä ovat automatisoitu alusta, nukleiinihappouuttokemia, PCR-alukkeiden ja koettimien valinta ja suunnittelu, PCR-monistusolosuhteet ja määrityksen kalibrointistrategia. Seuraavassa tarkastellaan erilaisia suunnittelutapoja ja niiden mahdollisia vaikutuksia määrityksen suorituskykyyn ja kliinisiin tuloksiin. (Kuva 1)
Extraktioprosessi
Extraktiokemian valinnassa on otettava huolellisesti huomioon näytetyyppi ja analyytti. Esimerkiksi HIV-1-tapauksissa Department of Health and Human Services (DHHS) neuvoo, että HIV-1 RNA:ta tulisi käyttää HIV-1:n viremian merkkiaineena.1
HIV-1 RNA:n ja proviraalisen DNA:n erottaminen toisistaan on tärkeää, sillä jälkimmäinen ei ole aktiivisen viruksen replikaation merkkiaine vaan pikemminkin soluihin jo integroituneen viruksen piilevän reservoirin vapautumista. Uuttokemia, joka puhdistaa sekä HIV-1 RNA:n että proviraalisen DNA:n, ei antaisi lääkärille tarkkaa kuvaa todellisesta viruksen replikaatiosta; sen vuoksi tämän viruksen tapauksessa olisi käytettävä vain sellaista uuttokemiaa, joka nimenomaan puhdistaa HIV-1 RNA:n, jotta proviraalinen DNA voidaan sulkea pois jatkokvantifioinnista.
Vaihtoehtoisesti kokonaisnukleiinihapon (TNA) uuttokemian käyttö HIV-1:n kvantifioinnissa voisi mahdollisesti johtaa vääriin positiivisiin tuloksiin tai epätarkkaan kvantitointiin, millä olisi haitallisia vaikutuksia potilaan hoitoon. TNA-uuttokemiaa voidaan käyttää vaikeammissa näytetyypeissä, kuten virtsassa tai ulosteessa, tai määrityksissä, joissa on osoitettava molemmat RNA/DNA-kohteet.
Kohteen valinta
Hiv-, HBV- ja HCV-kantojen äärimmäinen virusmonimuotoisuus on erittäin tärkeää, jotta voidaan varmistaa, että molekyylidiagnostiikan (MDx) testit antavat oikean tuloksen riippumatta näytteessä esiintyvästä (esiintyvistä) kannoista.
Tämän ongelman ratkaisemiseksi optimaalinen määrityssuunnittelu olisi aloitettava valitsemalla alukkeen/koettimen kohdealue geneettisesti konservatiiviselta alueelta, jossa viruksen monimuotoisuudella on vähiten mahdollista vaikutusta. Geneettisesti konservatiiviset alueet voidaan määrittää vain vertailemalla erilaisten viruskantojen sekvenssejä.
Tämän tarpeen täyttämiseksi maailmanlaajuinen seurantaohjelma on ratkaisevan tärkeä, jotta voidaan kattavasti arvioida HIV-, HBV- ja HCV-kantojen nykyistä virusten monimuotoisuutta.4 Seurantaohjelmassa maantieteellisesti erilaisilta alueilta kerätyistä kannoista tuotettuja sekvenssejä käytetään sen määrittämiseksi, mitkä viruksen genomin alueet ovat parhaiten konservoituneita ja molekyylidiagnostisella testillä havaittavia. Käyttämällä kiertäviä virussekvenssejä testien suunnittelussa pienennetään merkittävästi riskiä siitä, että testit eivät löydä kantoja.
Sondin suunnittelu ja PCR-sykliolosuhteet
Kohdealueen valinnan lisäksi koettimen suunnittelu ja PCR-sykliolosuhteet ovat kriittisiä, kun pyritään varmistamaan tarkka viruskuorman kvantitointi. Koettimen suunnittelun on kestettävä luonnossa esiintyviä polymorfismeja ja sitä kautta mahdollisia epäsuhtaisuuksia, joita voi esiintyä tietyllä kohdealueella. Ajan myötä koettimien teknologia on kehittynyt, samoin kuin PCR-menetelmät. PCR-tekniikkaan perustuvien MDx-sovellusten laajempi kirjo viruksen kvantifioinnin lisäksi edellyttää erilaisten koettimien suunnittelua. Pieniin uriin sitoutuvia koettimia käytetään tyypillisesti genotyypin määrittämiseen ja yhden nukleotidin polymorfismin havaitsemiseen.
TaqMan-koettimia käytetään usein määrityksissä, joissa kohdealueet ovat pitkälle säilyneitä. Osittain kaksisäikeisiä koettimia, jotka sietävät paremmin suurta geneettistä heterogeenisuutta lähinnä koettimen pituudesta ja sitoutumisolosuhteista johtuen, käytetään alueilla, joilla heterogeenisuus on suurta.5
Sondien suunnittelun lisäksi myös sykliolosuhteet ovat usein suunnittelun optimoinnin kohteena, jotta saavutetaan suorituskykyvaatimus (esim. mahdollisten epäsovitusten sietokyky). Vaihesovitettu sykli on yksi lähestymistapa, joka sisältää syklejä matalammassa lämpötilassa alkuperäisen tiukkuuden alentamiseksi, jota seuraavat syklit korkeissa lämpötiloissa spesifisyyden säilyttämiseksi. Tämä lähestymistapa lieventää mahdollisten alukevirheiden haitallista vaikutusta näytteen kvantifiointiin. Jos harvinaisten polymorfismien merkittävää vaikutusta on vaikea välttää, määrityssuunnitelmaan voidaan sisällyttää toisen kohteen havaitseminen. Kun sekvenssidiversiteetti vaikuttaa viruksen genomin yhden alueen havaitsemiseen, toisen alueen havaitseminen varmistaa tarkan tuloksen saamisen. Kun otetaan huomioon molekyylimääritysten monimutkaisuus ja virusten suuri monimuotoisuus, molekyylimäärityksiä suunniteltaessa olisi harkittava kokonaisvaltaista lähestymistapaa, jossa hyödynnetään maailmanlaajuista valvontaa ja kohdekohtaista koettimien suunnittelua. Pelkkä yhden strategian, kuten kaksoiskohde-testin, mukauttaminen voi antaa vääränlaisen turvallisuuden tunteen.
Kalibrointistrategia
Kalibrointistrategia on olennainen osa molekyylimääritysten suunnittelua, ja se on ratkaisevan tärkeä toistettavuuden varmistamiseksi laajalla dynaamisella alueella. Useimmissa kvantitatiivisissa menetelmissä hoidon hallinnassa käytetään tällä hetkellä ulkoista kalibrointikäyrää analyytin pitoisuuden määrittämiseksi.
Näissä määrityksissä potilasnäytteen analyyttisignaalia verrataan sarjaan näytteitä, joiden pitoisuus tunnetaan, ja viruskuorman laskemiseen käytetään yksinkertaista lineaarista regressiota (y=mx+b). Tässä lähestymistavassa käytetään tyypillisesti kalibraattoreita, jotka käsitellään potilasnäytteinä koko prosessin läpi, mikä mahdollistaa sekä uutto- että monistusreagenssien ja -välineiden kalibroinnin.
Vaihtoehtoisesti voitaisiin käyttää kalibraattoreita, joita ei käsitellä uuton läpi, mutta tähän lähestymistapaan liittyy kuitenkin riski, että eroa talteenotossa tai reagenssin koostumuksen muutosta ei otettaisi huomioon, mikä voi johtaa eroihin kvantifioinnissa.
Toinen harvemmin käytetty strategia on sisäinen kvantitatiivinen standardi. Tässä sovelluksessa käytetään 3. kertaluvun polynomista regressiosuoraa (y = ax3 + bx2 + cx + d) lineaarisella alueella, jossa on sallittu suurin ero lineaarisuudesta. Aiemmissa tutkimuksissa on esitetty, että joidenkin määritysten hyväksyttävä sallittu ero lineaarisuudesta oli ± 0,2 Log10.6 Tämä sallittu ero lineaarisuudesta ja kalibrointimenetelmä selittää myös menetelmien välillä usein havaittavan harhan sekä suuremman epätarkkuuden dynaamisen alueen matalassa päässä, jossa usein tehdään kliinisiä päätöksiä.
Johtopäätökset
Johtopäätökset
Molekyylimäärityksen tarkka ja täsmällinen suoritusarvo on kriittisen tärkeä asianmukaisen hoidon hallinnan kannalta. Viruskuormitustulosten epätarkkuus voi johtaa epätarkoituksenmukaiseen hoitoon, ja potilas voi jäädä tehottomaan hoitoon. Tällä virheellisellä diagnoosilla on paljon laajempia vaikutuksia kuin yksittäisen potilaan hoidolla, sillä se voi myös johtaa resistentin viruskannan leviämisen lisääntymiseen. Hoidon hallinnan näkökulmasta virusta, jossa on resistenssiin liittyviä mutaatioita, on haastavampi hoitaa suppeammilla hoitovaihtoehdoilla. Lisäksi väärien positiivisten tulosten määrä voi lisätä tarpeettomia kustannuksia uusintatestauksesta tai kalliimmasta resistenssitestauksesta sekä aiheuttaa ahdistusta potilaalle ja lääkärille.
- Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Adults and Adolescents with HIV developed by Department of Health and Human Services. https://aidsinfo.nih.gov/guidelines). Accessed September 2019.
- European AIDS Clinical Society (EACS). EACS Guidelines Version 9.1 October 2018.
- National Department of Health, South Africa, April 2015, accessed August 2, 2017: https://aidsfree.usaid.gov/sites/default/files/tx_south-africa_pmtct_2015.pdf.
- Brennan CA, Bodelle P, Coffey R, et al. HIV global surveillance: foundation for retroviral discovery and assay development. Journal of medical virology. 2006;78 Suppl 1:S24-29.
- Luk KC, Devare SG, Hackett JR, Jr. Osittain kaksisäikeiset lineaariset DNA-koettimet: uudenlainen suunnittelu geneettisesti polymorfisten kohteiden herkkää havaitsemista varten. Journal of Virological Methods. 2007;144(1-2):1-11.
- Vermehren J, Colucci G, Gohl P, ym. Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan hepatiitti C -viruksen kvantitatiivisen testin toisen version kehittäminen, jossa on parannettu genotyyppien inklusiivisuutta. Journal of Clinical Microbiology. 2011;49(9):3309-3315.
Kiitos: Kirjoittaja haluaa antaa tunnustusta ja kiittää Mary Rodgersia ja Shihai Huangia tämän artikkelin tarkistamisesta.