Pään ja kaulan syöpätauti on seitsemänneksi yleisin syöpätyyppi esiintyvyydeltään ja kuolleisuudeltaan 890 000 uudella tapausluvullaan ja 450 000:lla kuolemantapauksellaan ympäri maailmaa vuonna 2018 . Hoito on edelleen haastavaa, sillä nykyiset hoitomuodot johtavat paikallisesti pitkälle edennyttä tautia sairastavien potilaiden viiden vuoden eloonjäämisasteeseen, joka on alle 50 % . Lääkeresistenssi ja toksisuus rajoittavat kemoterapioiden, kuten cis- tai karboplatiinin, 5-fluorourasiilin ja taksaanien, tehoa. Kohdennettujen lääkeaineiden, kuten setuksimabin, nivolumabin tai pembrolitsumabin, käyttöönotto paransi hoitotuloksia, mutta ei ratkaissut primaarisen tai hankitun hoitoresistenssin ongelmaa suurimmalla osalla potilaista . Vain hyvin harvoja biomarkkereita käytetään tällä hetkellä kliinisessä käytännössä tai niiden validointi rutiinikäyttöä varten on edennyt . Luotettavat prekliiniset mallit ovat siksi ratkaisevan tärkeitä, jotta voidaan paremmin ymmärtää HNSCC:n hoitoresistenssiin ja etenemiseen liittyviä molekyylimekanismeja ja kehittää tehokkaampia hoitostrategioita.
HNSCC:n kasvaimista peräisin olevat immortalisoidut solulinjat ovat arvokas väline hoitoresistenssin toiminnallisessa analysoinnissa. Lääkkeiden seulonta yksikerroksisissa soluviljelmissä on edelleen yleinen lähestymistapa uusien terapeuttisten aineiden tunnistamiseksi. Kolmiulotteiset (3D) viljelmät, jotka edustavat paremmin kasvainkudoksen arkkitehtuuria ja soluympäristöä, saattavat kuitenkin olla parempia ennustettaessa lääkkeiden tehoa potilailla. Kolmiulotteisia soluviljelmiä käyttävissä tutkimuksissa on nimittäin havaittu suuria vaihteluita säteily- ja lääkeaineherkkyydessä, jotka ovat samankaltaisia kuin in vivo -kasvaimissa havaitut vaihtelut. Vaikka 3D-viljelmät ovat hyödyllisiä eri solupopulaatioiden välisten vuorovaikutusten tutkimisessa, ne eivät täysin vastaa HNSCC:n monimutkaisuutta. Näin ollen uusien hoitomuotojen kehittäminen saattaa viime kädessä edellyttää kliinisesti merkityksellisiä HNSCC:n eläinmalleja, jotka edustavat tarkasti ihmisen syövän syntyyn ja etenemiseen liittyviä solu- ja molekyylimuutoksia. Tältä osin HNSCC-tutkimuksen alalle ovat tulleet karsinogeenien aiheuttamat HNSCC-mallit, siirtogeeniset eläimet ja siirrettävät ksenograft-mallit. Tässä katsauksessa kuvataan yleisimmin käytettyjä HNSCC:n prekliinisiä malleja (kaavamaisesti kuvassa 1) ja annetaan yleiskatsaus niiden vahvuuksista ja rajoituksista. Käsittelemme myös näihin malleihin perustuvia uusia lähestymistapoja yksilöllisen hoidon valintaan.
Kuvio 1
kaavamainen yleiskatsaus lähestymistavoista, joiden avulla on luotu prekliinisiä HNSCC-malleja. a Potilaiden luomat mallit luodaan pääosin kirurgisesta tuumorikudoksesta. Mekaanisen ja entsymaattisen dissosioinnin jälkeen kasvainsoluja kasvatetaan in vitro 2D-solukerroksina muovilla tai 3D-sferoidirakenteina solunulkoisessa matriisissa (ECM). Potilasperäisten ksenotransplantaattien (PDX) tuottamiseksi kasvainfragmentit siirretään ihon alle immuunipuutteisiin hiiriin. Klassisille potilasperäisille malleille on ominaista, että niissä ei ole ihmisen immuuni- ja stroomasoluja. b Suun levyepiteelisolusyövän geneettisesti muunnettuja hiirimalleja voidaan tuottaa onkogeenien valikoivalla aktivoinnilla tai kasvainsuppressorigeenien (TSG) inaktivoinnilla epiteelisoluissa. c 4-Nitrokinoliini-1-oksidin antaminen hiirten juomaveteen useiden viikkojen ajan edistää suuontelon karsinogeneesiä suurella esiintyvyydellä
Ex vivo -mallit
Immortalisoituja HNSCC-solulinjoja
Neljä vuosikymmentä sitten raportoitiin ensimmäiset HNSCC-soluviljelyjen ex vivo-käytännöt . Kun aiemmat esteet, kuten fibroblastien liikakasvu ja riippuvuus syöttökerroksista, oli ratkaistu näillä protokollilla, HNSCC-solulinjat perustettiin onnistuneesti. Viljelytekniikoita on sittemmin parannettu entisestään, ja erilaisia HNSCC-solulinjoja, jotka kasvavat vakaasti useiden läpikäyntien ajan, on tuotettu. Kaikkien saatavilla olevien HNSCC-solulinjojen yksityiskohtainen kuvaus ei kuuluisi tähän katsaukseen. Haluamme näin ollen viitata kahteen aiempaan katsausartikkeliin . Koska kuolemattomia HNSCC-solulinjoja voidaan helposti ylläpitää ja laajentaa, niitä on käytetty laajalti geneettisten muutosten ja biologisten vasteiden tutkimiseen kemiallisiin ja geneettisiin häiriöihin, potentiaalisten molekyylikohteiden tunnistamiseen ja uusien pienimolekyylisten ja biologisten terapeuttisten aineiden kehittämiseen . Viime aikoina on saatu näyttöä siitä, että näitä solulinjoja voidaan käyttää myös kasvainsisäisen heterogeenisuuden ja klonaalisen evoluution tutkimiseen hoitopaineen alaisena . Näillä malleilla tehdyistä kattavista molekulaarisista ja toiminnallisista tutkimuksista saadut tiedot on koottu kirjastoihin, kuten Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) -tietokantaan, joka edustaa arvokasta tietovarastoa ihmisen syövän monimuotoisuudesta .
Vaikka kaksiulotteisissa (2D) solukerrosviljelmissä kasvatetut HNSCC-solulinjat ovat edelleen tärkeitä malleja etsittäessä uusia terapeuttisia lähestymistapoja tälle taudille, ne kärsivät yleensä siitä, että ne ovat kyvyttömiä kuvastamaan kasvaimen histologista luonnetta, kolmiulotteista (3D) arkkitehtuuria ja rakenteellisia ja toiminnallisia eroavaisuuksia elävässä muodossa. Nämä rajoitukset vaikuttavat merkittävästi sellaisten in vitro -tutkimusten informatiiviseen arvoon, joissa arvioidaan vakiintuneiden ja uusien HNSCC:n hoitomuotojen tehoa yksikerrosviljelmissä. HNSCC-solulinjojen 2D- ja 3D-viljelmien herkkyydessä säteilylle ja lääkehoidolle, esimerkiksi sisplatiinille, setuksimabille ja mTOR-inhibiittorille AZD8055 , on todettu huomattavia eroja. Vertaileva molekyylianalyysi 2D- ja 3D-viljelmissä kasvavista soluista tarjosi mahdollisia selityksiä 3D-viljelmissä kasvavien solujen alhaisemmalle herkkyydelle, kuten DNA:n korjaukseen liittyvien geenien ilmentyminen ja aktivoituminen sekä epiteeli-mesenkymaaliseen siirtymään ja kantakykyyn liittyvien geenien lisääntynyt ilmentyminen 3D-olosuhteissa.
Geneettinen epävakaus ja kloonien valikoituminen soluviljelmien viljelyssä in vitro -prosessin aikana ovat syöpäsolulinjojen mahdollisia rajoitteita, ja ne voivat selittää sen, miksi tuloksia, jotka on saatu aikaan käyttämällä solulinjoja, on usein hankala toistaa. Yleisesti käytettyjen MCF7-rintasyöpä- ja A549-keuhkosyöpäsolulinjojen kantojen kattava analyysi paljasti, että kantojen genominen vaihtelu on laajaa ja että se liittyy biologisesti merkityksellisten soluominaisuuksien vaihteluun. Tärkeää on, että kun kantoja testattiin 321:llä syövänvastaisella yhdisteellä, havaittiin huomattavia eroja lääkevasteissa: vähintään 75 prosenttia yhdisteistä esti voimakkaasti joitakin kantoja, mutta oli täysin inaktiivisia toisissa. Tämä tutkimus korostaa selvästi, että tarvitaan kiireellisesti parempia ex vivo -malleja, jotka tukevat mahdollisimman hyvin toistettavaa syöpätutkimusta.
HNSCC:n kehittyneet ex vivo -mallit
Köpf-Maier ja kollegat loivat ensimmäisenä menetelmän, jonka avulla eri histologisia kokonaisuuksia, kuten nielun levyepiteelisolusyöpiä, edustavat ihmiskarsinoomasolut pystyivät järjestäytymään in vitro ”organoidirakenteiksi”. He osoittivat, että nämä organoidiviljelmät säilyttivät in vivo -tilan kriittiset ominaisuudet, kuten 3D-arkkitehtuurin, yksittäisen karsinooman heterogeenisten solutyyppien kasvun ja morfologisen erilaistumisen suhteellisen yksinkertaisissa kokeellisissa olosuhteissa . Myöhemmässä tutkimuksessa sama ryhmä osoitti, että näitä organoidiviljelmiä voidaan käyttää lääketestaukseen ja että niistä saadut vastetiedot vastasivat potilaiden hoitovastetta . Kirjoittajat olivat ensimmäiset, jotka ehdottivat organoidiviljelmiä yksilölliseksi in vitro -lääketestausalustaksi, joka mahdollistaa karsinoomien yksilöllisen kemosensitiivisyyden ennustamisen muutamassa päivässä .
Sen jälkeen tekniikoita, joilla kudoksia kasvatetaan in vitro 3D:ssä organotyyppisinä rakenteina, on hiottu. Aikuisten ja alkion kantasoluista on kehitetty protokollia organoidien muodostamiseksi, jotka pystyvät itseorganisoitumaan 3D-rakenteiksi, jotka heijastavat alkuperäkudosta (katsaus ks. Clevers, 2016 ). Ensimmäiset aikuisten kantasoluista peräisin olevat organoidiviljelmät perustettiin hiiren suoliston kantasoluista, jotka sijoitettiin suoliston kantasolujen nicheä jäljitteleviin olosuhteisiin . Ehdollisen uudelleenohjelmoinnin, joka indusoitiin lisäämällä R-spondiini-1:tä, epidermaalista kasvutekijää (EGF) ja Nogginia elatusaineeseen ja upottamalla solut solunulkoista matriisia tarjoavaan tyvikalvouutteeseen, on osoitettu stimuloivan aikuisia kantasoluja uusiutumaan, lisääntymään ja muodostamaan erilaistuneita jälkeläisiä, jotka muistuttavat suoliston epiteeliä . Tätä tekniikkaa, joka alun perin kehitettiin ihmisen ruoansulatuskanavan infektoituneen, tulehduksellisen ja neoplastisen kudoksen tutkimiseen, on käytetty organoidiviljelmien perustamiseen erilaisista ihmisen normaaleista kudoksista, mutta myös potilaista peräisin olevasta kasvainkudoksesta. Nämä tutkimukset ovat merkittävästi laajentaneet ja parantaneet käytettävissä olevien syöpämallien joukkoa.
Viime aikoina Köpf-Maierin ja kollegoiden varhaiset havainnot siitä, että HNSCC:n organoidiviljelmät ovat sopiva in vitro -lääketestausalusta, vahvistettiin useissa itsenäisissä tutkimuksissa. Vaikka HNSCC-potilaiden primaaristen pitkäaikaisesti kasvavien organoidiviljelmien perustamisen onnistumisasteissa on raportoitu huomattavia eroja (30 % vs. 65 % ), kaikissa tähänastisissa tutkimuksissa on yksimielisesti kuvattu, että organoidit säilyttävät monia alkuperäisen kasvaimen ominaisuuksia, mukaan lukien intratumoraalinen heterogeenisuus , mutaatioprofiili ja proteiinien ilmentymismallit . Lisäksi osoitettiin, että organoidit säilyttivät tumorigeenisen potentiaalinsa ksenotransplantaation yhteydessä . Vasteiden lääkehoitoon in vivo todettiin olevan samankaltaisia kuin IC50-arvot, jotka laskettiin organoideista lääkeherkkyysmäärityksillä in vitro Lisäksi organoiditesteistä saadut säteilyherkkyystiedot korreloivat potilaiden kliinisen vasteen kanssa. Tärkeää on, että organoidimalleissa voidaan tutkia paitsi hoitoon liittyviä vaikutuksia kasvaimissa myös ei-toivottuja hoidon sivuvaikutuksia normaalissa kudoksessa. Esimerkiksi potilailta peräisin olevia sylkirauhasen organoideja on käytetty molekyyliperustan selvittämiseen hyposalivaatiolle, joka on usein säteilyn vakava sivuvaikutus .
Jatkotutkimuksessa HNSCC-potilaiden kasvaimista saadut primaariset 2D-soluviljelmät tunnistettiin arvokkaaksi ex vivo HNSCC-malliksi . Tässä tutkimuksessa yksilöllisessä laajamittaisessa syövänvastaisten terapioiden seulonnassa tunnistettiin toistettavasti lääkkeitä, joilla oli kasvainvastaista aktiivisuutta sovitetuissa potilasperäisissä ksenotransplantaattimalleissa (PDX-malleissa), ja näin saatiin lisänäyttöä siitä, että primaarisia HNSCC-soluviljelmiä voitaisiin käyttää tukemaan terapeuttista päätöksentekoa rutiininomaisessa kliinisessä ympäristössä.
Miehen normaaleista, dysplastisista ja pahanlaatuisista kielikudoksista muodostettuja organoidiviljelmiä on käytetty myös kielikasvainten syntymisen tärkeimpiä vaiheita jäljitettäessä . Histomorfometria-, immunohistokemia- ja elektronimikroskopia-analyysit kollageenimatriisissa olevien kielestä peräisin olevien primaaristen keratinosyyttien ja fibroblastien 3D-ko-kulttuureissa osoittivat, että kerrostunut kasvu, solujen proliferaatio ja erilaistuminen olivat vertailukelpoisia ko-kulttuureiden ja vastaavien natiivien kudosten välillä, mutta ne kuitenkin poikkesivat toisistaan suurelta osin viljelmissä, joita kasvatettiin ilman fibroblasteja . Nämä tulokset tukevat aiempia tutkimuksia, jotka osoittavat syöpään liittyvien fibroblastien tärkeän roolin HNSCC:n patogeneesissä . Nämä tiedot yhdessä kirjallisuudesta saatavien laajojen todisteiden kanssa kasvaimen mikroympäristön (TME) kasvainta edistävistä vaikutuksista puhuvat vahvasti sen puolesta, että tulevaisuudessa olisi käytettävä kehittyneempiä prekliinisiä malleja, jotka sisältävät kaikki tärkeimmät TME:n osatekijät. Nykyään on saatavilla uusia protokollia sellaisten organoidien tuottamiseksi, jotka sisältävät stroomasolujen lisäksi myös potilaan immuunisoluja . Vaikka organoidiviljelyyn liittyykin rajoituksia, kuten huomattava aika- ja resurssikulutus sekä kokeiden lopputulokseen mahdollisesti vaikuttavien määrittelemättömien ulkoisten tekijöiden sisällyttäminen (taulukko 1), nämä viljelmät saattavat olla sopivia malleja tulevien hoitostrategioiden, kuten immuno-onkologisten lääkkeiden, kehittämiseen ja optimointiin.
eläinmallit
Suun syövän karsinogeenin aiheuttamat eläinmallit
Suunsuolen syövän karsinogeenin aiheuttamat eläinmallit
Useimpien ihmisen SCC:iden tiedetään olevan kroonisen altistumisen karsinogeeneille aiheuttamia. Alun perin kokeelliset lähestymistavat suun pahanlaatuisten kasvainten aikaansaamiseksi kemiallisesti epäonnistuivat aina, koska suun limakalvo oli vastustuskykyisempi kemikaalien vaikutukselle kuin iho. Lopulta 9,10-dimetyyli-1,2-bentsantraseenin (DMBA) avulla HNSCC voitiin onnistuneesti indusoida hamsterin poskipussissa eläinmallina. Potilaiden tilannetta muistuttaen limakalvon karsinogeneesi tapahtui neljässä peräkkäisessä vaiheessa: hyperplasia, epätyypillinen hyperplasia, carcinoma in situ ja levyepiteelikarsinooma . Oli kuitenkin vaikeaa erottaa toisistaan epiteelin muutokset, jotka johtuivat suorasta kosketuksesta karsinogeenin kanssa, ja todellinen premaligni muutos, koska muutokset olivat ohimeneviä ja palautuvia DMBA:n aiheuttamissa poskikasvaimissa. Lisäksi DMBA:n aiheuttamissa kasvaimissa ei ollut monia erilaistuneen HNSCC:n histologisia piirteitä, eivätkä ne muistuttaneet läheisesti ihmisen varhaisia vaurioita. Vielä tärkeämpää on, että kasvain esiintyi hamsterin poskipussissa, joka edustaa immuunipuutteista aluetta, jota ei ole ihmisillä, joten tämä malli ei jäljittänyt kovin hyvin ihmisen HNSCC:tä. Vaikka DMBA:ta käytettiin sittemmin laajalti hamsterin ja rotan suusyöpämalleissa, osoittautui vaikeaksi aiheuttaa suusyöpää DMBA:lla hiirissä. 4-Nitrokinoliini-1-oksidi (4-NQO), vesiliukoinen kinolonijohdannainen, otettiin sitten käyttöön voimakkaana suukasvainten aiheuttajana. 4-NQO:n antaminen juomaveden mukana tai sen paikallinen käyttö johti moniin dysplastisiin, preneoplastisiin ja neoplastisiin vaurioihin pitkäaikaishoidon jälkeen sekä rotta- että hiirimalleissa, ja nämä vauriot muistuttivat läheisesti ihmisen suuontelon neoplastisia muutoksia. Useiden muutosten jälkeen Tang et al. vakioivat mallin ja osoittivat, että 4-NQO:n antaminen C57BL/6-hiirten juomaveteen 16 viikon ajan edistää suuontelon karsinogeneesiä suurella esiintyvyydellä.
Kerratessaan tapahtumien kulkua ja ihmisen karsinogeneesin aikana havaittujen vaurioiden tyyppiä edellä kuvatut karsinogeenin aiheuttamat eläinmallit tarjoavat erinomaisen in vivo -järjestelmän suuontelon karsinogeneesin keskeisten ajuritapahtumien tutkimiseen. Näitä malleja on myös käytetty laajalti syövän kemopreventiostrategioiden kehittämiseen, kun taas harvemmissa tutkimuksissa näitä eläinmalleja on käytetty hyväksi arvioitaessa lääkkeiden tehoa vakiintuneiden kasvainten hoidossa. Yksi merkittävä rajoitus lääkkeiden seulonta-alustana on se, että testattavan yhdisteen vaikutusten arviointiin kuluu paljon aikaa (taulukko 1). Useimmat HNSCC:n karsinogeeni-indusoidut eläinmallit tarvitsevat jopa 40 viikkoa kehittyäkseen täysimittaisiksi karsinoomiksi, ja vielä pidempään, jos tutkimuksen päätepisteenä on etäpesäkkeiden muodostuminen. Tässä yhteydessä Wangin ja kollegoiden hiljattain julkaisema raportti tarjoaa mahdollisen oikotien käyttämällä 4NQO-solulinjasta peräisin olevia kielen kasvaimen ksenotransplantaatteja vaihtoehtoisena ja tarkoituksenmukaisempana syngeenisenä hiirimallina .
4NQO:n aiheuttaman eläinmallin suurimpana etuna on sen soveltuvuus karsinogeenisten ja geneettisten tekijöiden vaikutusten tutkimiseen kasvainten synnyssä erityisesti immunokompetentissa ympäristössä. Se tarjoaa siten sopivan alustan HNSCC:n immunoterapeuttisten hoitomuotojen kehittämisen nopeuttamiseksi. Mallia on myös käytetty menestyksekkäästi tutkimaan oletettujen syöpäkantasolujen roolia hoitoresistenssissä, uusiutumisessa ja etäpesäkkeiden muodostumisessa. Sen mahdollisuudet kehittää uusia terapeuttisia strategioita, jotka kohdistuvat proliferatiivisen kasvainmassan lisäksi myös suhteellisen hiljaiseen syöpäkantasolujen osapopulaatioon, on todettu .
Geenitekniikalla muunnetut hiirimallit
Kemikaalien aiheuttamat DNA-vauriot tapahtuvat sattumanvaraisesti, mutta kasvaimen evoluutioteorian mukaan mutaatioiden satunnaista hankkimista eri puolilla perimää seuraa sellaisten kloonien valikoituminen, joissa on geneettisiä muutoksia, jotka helpottavat solujen eloonjäämistä ja leviämistä. Molekyyliprofilointitutkimuksissa on tunnistettu useita oletettuja kuljettajageenejä, jotka vaikuttavat syövän kehittymiseen HNSCC:ssä. Nämä molekyylitutkimukset eivät kuitenkaan ole antaneet suoraa näyttöä syy-yhteydestä tai yksityiskohtaista tietoa biologisista mekanismeista, joilla nämä geenit ohjaavat kasvaimen kehitystä. Vaikka karsinogeenien aiheuttamat eläinmallit voivat hyvin jäljitellä ihmisen primaarikasvainten genomimuutosten heterogeenista maisemaa, vain murto-osa näistä mutaatioista ohjaa tuumorigeneesiä vaikuttamalla onkogeeneihin tai kasvainsuppressorigeeneihin, mutta monet mutaatiot ovat matkustajia, joilla ei ole selkeää vaikutusta kasvaimen kehitykseen. Näistä tutkimuksista ei myöskään käy ilmi, ovatko ajurit välttämättömiä kasvaimen ylläpidon kannalta, joten niistä voi olla vain vähän hyötyä tehokkaiden hoitostrategioiden suunnittelussa. Sitä vastoin prekliiniset mallijärjestelmät, kuten geneettisesti muunnetut hiirimallit (GEMM-mallit), tarjoavat kokeellisesti helposti lähestyttävän lähestymistavan, jossa tiettyjen mutaatioiden biologisia vaikutuksia voidaan tutkia yksityiskohtaisesti kontrolloidussa geneettisessä taustassa. Seuraavissa luvuissa kuvataan keskeisiä havaintoja aiemmista GEMM-malleihin perustuvista tutkimuksista HNSCC:ssä.
Vähän GEMM-malleja, jotka liittyvät spontaaniin HNSCC:n muodostumiseen ilman kroonista karsinogeenialtistusta, on tähän mennessä kuvattu (taulukko 2). Geneettisesti muunnetun suusyövän hiirimallin esittivät ensimmäisenä Schreiber ja kollegat . Kun v-Ha-ras-geenin siirtogeeniset hiiret oli risteytetty ihmisen papilloomaviruksen (HPV)-16 E6/E7-geeniä kantavien siirtogeenisten hiirten kanssa, havaittiin, että suussa, korvassa ja silmässä kehittyi kasvaimia, jotka alkoivat noin 3 kuukauden iässä. Kuuteen kuukauteen mennessä 100 prosentille bi-transgeenisistä eläimistä oli kehittynyt suukasvaimia, kun taas jommassakummassa yksittäisessä transgeenisessä ryhmässä esiintyvyys oli 0 prosenttia. Toisen geneettisen osuman edellytys kasvainten syntymiselle raportoitiin myös K-rasG12D:n siirtogeenisessä mallissa, jossa tamoksifeeni-indusoitavaa Cre-rekombinaasia käytettiin keratiini-14:n (K14) promoottorin valvonnassa endogeenisen K-ras-lookuksen kohdentamiseen. Yhden geenin mallissa havaittiin vain suuria papilloomia suuontelossa ja hyperplasioita kielessä 1 kuukauden tamoksifeenihoidon jälkeen . Jos hiiret kuitenkin risteytettiin floxed p53:n ehdollisen knockout-hiirten kanssa, 100 prosentille yhdistelmähiiristä kehittyi kielen karsinooma jo 2 viikon kuluttua tamoksifeeni-induktiosta . Viruksen onkogeenien E6/E7 ilmentymisen ja TP53:n menetyksen lisäksi transkriptiotekijä krüppelin kaltaisen faktorin 4 (KLF4) homotsygoottinen deleetio ja SMAD4:n heterotsygoottinen deleetio on tunnistettu toisiksi geneettisiksi osuuksiksi, jotka yhdessä onkogeenisen kuljettajamutaation kanssa edistävät suusuolisten kasvainten muodostumista suurella esiintyvyydellä (taulukko 2).
HNSCC:n etenemistä toistavista malleista huolimatta edellä kuvattujen HNSCC-mallien soveltuvuus alustaksi uusien molekyylitason kohdennettujen hoitokeinojen tutkimiseen on edelleen jossain määrin kyseenalainen, kun otetaan huomioon, että näissä eläimissä kasvainten syntyä ohjaavat geneettiset muutokset puuttuvat tai niitä esiintyy vain harvoin HNSCC-potilailla. Kaiken kaikkiaan HRAS- ja KRAS-mutaatioita havaittiin vain 6 ja 0,2 prosentilla HNSCC-potilaista ja KLF4:n ja SMAD4:n homotsygoottinen deleetio 0 ja 4 prosentilla tapauksista. Lisäksi The Cancer Genome Atlas (TCGA) HNSCC-kohortissa ei ole tunnistettu tapauksia, joissa oli jokin edellä kuvattujen GEMM:ien kasvaimille altistavista yhdistelmägenotyypeistä. Spontaanin HNSCC:n GEMM, joka muistuttaa enemmän ihmisen taudin molekyylipiirteitä, saattaa olla Bornsteinin ja kollegoiden raportoima pään ja kaulan epiteelissä esiintyvän SMAD4:n yksittäisen geenin poiskytkentämalli (HN-Smad4del/del) . Vaikka homotsygoottinen deletoituminen on harvinaista, SMAD4:n heterotsygoottista häviämistä havaitaan 30-35 prosentissa primaarisista HNSCC-taudeista, mikä liittyy Smad4-ekspressiotason alaregulaatioon . Viime aikoina on raportoitu SMAD4-kadon merkittävästä intratumoraalisesta heterogeenisyydestä primaarisissa HNSCC-kasvaimissa . Mielenkiintoista on, että PDX:stä peräisin olevissa ex vivo -viljelmissä solujen osapopulaatio, jossa esiintyy heterotsygoottista SMAD4-menetystä deletoitumalla tai vähentyneellä ilmentymällä, päihitti solut, joilla oli villityyppinen SMAD4-genotyyppi vanhempien kasvaimesta, mikä viittaa Smad4-puutteellisten solujen eloonjäämisetuun . Tämän yhden kopioinnin GEMM:n soveltuvuutta tukee myös se, että HN-Smad4del/del-hiirten HNSCC:llä oli lisääntynyttä genomista epävakautta, mikä korreloi Fanconin anemian/BRCA:n DNA:n korjausreitin proteiineja koodaavien geenien heikentyneen ilmentymisen ja toiminnan kanssa, mikä liittyy myös HNSCC-alttiuteen ihmisillä. Lisäksi sekä normaalissa pään ja kaulan kudoksessa että HN-Smad4del/del-hiirten HNSCC:ssä esiintyi voimakasta tulehdusta, joka on liitetty patogeneesiin myös ihmisillä, joilla suun bakteerit ja parodontiittisairauteen liittyvät tulehdusvälittäjäaineet voivat olla osatekijöitä suun SCC:n käynnistymisessä ja edistämisessä.
Suomen HN-Smad4del/del-mallia on käytetty vuonna 2009 julkaistun alkuperäisen raportin jälkeen HN-Smad4-del/del- mallin avulla HNSCC:n kasvainten syntyyn osallistuvien molekulaaristen prosesseja on pystytty analysoimaan yksityiskohtaisesti. Tietojemme mukaan sitä ei ole vielä hyödynnetty uusien terapeuttisten strategioiden kehittämisessä. Tämä rajoitus saattaa selittyä sillä, että kasvaimen kehittymisen mediaaniaika tässä mallissa on 40 viikkoa, mikä on samanlainen rajoitus kuin suusyövän karsinogeenien aiheuttamissa eläinmalleissa (taulukko 2). Syöpää aiheuttavan hoidon yhdistäminen kasvaimen muodostumisen nopeuttamiseksi yhden geenin GEMM-malleissa saattaisi näin ollen olla sopiva tapa ratkaista tämä rajoitus, kuten on jo menestyksekkäästi osoitettu tutkimuksissa GEMM-malleissa, joissa on deleetio kasvainsuppressorigeenissä (GRHL3 , PTEN ) tai joissa onkogeenisiä mikroRNA:ita ekspressoidaan liikaa (taulukko 1).
Potilasperäiset ksenotransplanttimallit
Vaikeasti immuunipuutteisten hiirikantojen kehittäminen ja parantaminen on merkittävästi lisännyt PDX-mallien saatavuutta syöpätutkimukseen. Useat tutkimusryhmät ovat raportoineet HNSCC:n PDX-mallien onnistuneesta perustamisesta. Omassa sarjassamme havaittiin 48 %:n yleinen tarttumisaste, mutta tarttumisasteet näyttivät kuitenkin vaihtelevan suuresti eri potilasalaryhmien välillä. Veriviljelyä rajoittavia tekijöitä ei ole vielä selvästi tunnistettu. Implantointipaikka ja hiirikannat näyttävät vaikuttavan tarttumisasteeseen. Lisäksi patologiset riskitekijät, kuten kasvaimen histologia ja HPV-status, ovat tärkeitä PDX:n muodostumiseen vaikuttavia tekijöitä. Yleisesti ottaen erilaistumattomat HPV-negatiiviset kasvaimet, joilla on aggressiivinen kasvu, siirtyvät todennäköisemmin. Näin ollen PDX-transplantaation nopeus ja kinetiikka on yhdistetty potilaiden epäsuotuisaan ennusteeseen. Toisin kuin HPV-negatiiviset kasvaimet, HPV-assosioituneet HNSCC-kasvaimet eivät useinkaan siirry. Koska nämä kasvaimet kasvavat immunologisesti assosioituneissa paikoissa, kuten nielurisoissa tai kielen tyvessä, niiden siirto immuunipuutteisiin hiiriin, joilla ei ole immunologista kontrollia virusinfektoituneisiin soluihin, sisältää riskin Epstein-Barr-virus (EBV) -positiivisten B-solujen rinnakkaissiirrosta. Tämän seurauksena tapahtuu usein hallitsematonta B-solujen lisääntymistä ja muuntumista EBV+-lymfoomaksi. Koska näiden keinotekoisten lymfoomien lisääntymisnopeus on paljon suurempi kuin kasvainsolujen lisääntymisnopeus SCC:n siirretyissä kudosfragmenteissa, alkuperäiset kasvainsiirteet kasvavat usein umpeen. Näin ollen PDX:n histopatologinen validointi laillistetun patologin toimesta on välttämätöntä mallin levyepiteelikarsinooman histologian vahvistamiseksi.
Kysymystä siitä, kuinka hyvin PDX:t muistuttavat potilaan primaarikasvainta, on käsitelty monissa ryhmissä. Kuten muiden kasvainkokonaisuuksien kohdalla on osoitettu, hiirissä vakiintuneissa HNSCC-malleissa on histopatologisia piirteitä kuten alkuperäisessä potilaan kasvaimessa . Primäärikasvainten ja johdettujen PDX-mallien kattava geneettinen analyysi seuraavan sukupolven sekvensoinnilla paljasti samanlaisia molekyyliaberraatioiden malleja ja alleelitaajuuksia . Alkuperäisten kasvainten ja johdettujen mallien mutaatioprofiilien välinen korrelaatio oli huomattavasti suurempi PDX-malleissa (R = 0,94) kuin solulinjoissa (R = 0,51) . Metylooma-analyysi osoitti myös suurta yhteneväisyyttä PDX- ja potilaskasvainten välillä. Itse asiassa keskimäärin vain 2,7 prosentissa tutkituista CpG-kohdista tapahtui merkittäviä metylaatiomuutoksia, kun kasvaimia siirrettiin hiiriin . Lisäksi geeniekspressiotutkimukset osoittivat vanhempien kasvainten ja niiden PDX-kasvainten yleisen sukulaisuuden, minkä vahvisti niiden klusteroituminen yhteen valvomattomassa hierarkkisessa klusterointianalyysissä . Vaikka PDX- ja primaaristen HNSCC-kasvainten genomi- ja transkriptomiprofiilien vastaavuudesta on yhä enemmän näyttöä, proteiiniekspressiosta on vain vähän tietoa. Ensimmäinen alustava analyysi PDX-kudoksesta käyttäen käänteisfaasiproteiiniarrayta (RPPA) paljasti proteiiniprofiileja, jotka olivat vertailukelpoisia TCGA:n HNSCC-proteiiniekspressiotietojen kanssa , mikä viittaa samankaltaisuuteen alkuperäisen kudoksen ja johdetun mallin välillä myös tällä tasolla.
PDX:n keskeinen piirre on stroomaalisen osaston säilyminen. Vaikka ihmisen strooma korvautuu hiiren stroomalla ensimmäisten läpikäyntien aikana, integroitu strooma säilyy, mikä mahdollistaa tähän osastoon kohdistuvien yhdisteiden tai stroomaosaston ja kasvainsolujen välisten ristikkäisvaikutusten arvioinnin. Lisäksi hiirissä kasvatetut kasvaimet muodostavat oman kasvainverisuonistonsa, mikä tarjoaa mahdollisuuden arvioida angiogeneettistä verkostoa ja interferenssiä angiogeneesiin kohdistuvilla yhdisteillä. Mallin luomisen jälkeen hiirissä kasvatetut kasvaimet voidaan kerätä talteen, pakastaa elintärkeässä tilassa ja tarvittaessa sulattaa ja siirtää uudelleen hiiriin. Kaiken kaikkiaan PDX:ää voidaan pitää sopivana menetelmänä kasvainkudoksen laajentamiseen ja lupaavana prekliinisenä mallijärjestelmänä mekanistisia tutkimuksia ja terapeuttisten strategioiden kehittämistä varten.
Kun immunoterapia on hiljattain tullut mukaan monien syöpätyyppien, myös HNSCC:n, hoito-algoritmiin, toimivan immuuniympäristön puuttumisesta PDX:ssä on tullut merkittävä este, joka on voitettava. Erilaisia strategioita on ehdotettu immuunijärjestelmän toteuttamiseksi immuunipuutteisissa hiirissä. Mosierin ja kollegoiden uraauurtavassa tutkimuksessa osoitettiin, että ihmisen perifeeristen mononukleaaristen solujen (PBMC-solujen) injektio johti vakaan ja pitkäaikaisen toiminnallisen ihmisen immuunijärjestelmän palauttamiseen hiiriin, joilla oli vaikea yhdistetty immuunipuutos (SCID). Näin ollen immuunipuutteisia PDX-malleja voitiin luoda siirtämällä potilaan PBMC-soluja PDX-hiiriin. Tästä lähestymistavasta puuttuu kuitenkin asianmukainen immuunisolujen kehitys ja T-solujen alustus, mikä johtaa siihen, että tietyt ihmisen immuunisolujen linjat puuttuvat hiiristä. Myöhemmin kehitetyt kehittyneemmät immunologiset rekonstituutioprotokollat perustuvat ihmisen CD34+-kantasolujen siirtoon NSG-hiiriin sekä ihmisen sikiön kateenkorvan ja maksakudoksen istuttamiseen näiden hiirten munuaiskapselin alle. Tämän lähestymistavan tuloksena saatiin aikaan ihmisen täydellisen immuunijärjestelmän pitkäaikainen kiinnittyminen ja systeeminen rekonstituutio, mukaan lukien ihmisen monilinjaiset immuunisolut, jotka koostuvat T-, B-, NK-, dendriittisistä soluista ja makrofageista . Valitettavasti tämä menetelmä ei ole toteutettavissa suurelle määrälle PDX-yksilöitä mallin monimutkaisuuden vuoksi. Melanoomassa on ehdotettu lupaavampaa menettelyä, jossa PDX:n tuottamiseen käytetystä kasvainkudoksesta eristettyjä kasvaimeen tunkeutuvia T-lymfosyyttejä (TIL) laajennettiin in vitro ihmisen interleukiini 2:lla (IL2) ennen injektiota kasvainta kantaviin PDX-hiiriin.
Pdx-mallien potentiaali ohjata potilaiden hoitoa
Pdx-mallien arvoa yksittäisten potilaiden hoitopäätösten tekemisessä ei ole vielä pystytty selvittämään. Yleensä potilaiden ja PDX-mallien väliset korrelaatiot eri kasvainkokonaisuuksissa, joissa verrataan hiirten ja potilaiden hoitovasteita, on tehty käyttämällä taannehtivia tietoja kliinisistä tuloksista. Tietojemme mukaan tällaisia vertailuja ei ole tehty HNSCC:ssä riittävän suurilla näytemäärillä. Tällaisten lähestymistapojen soveltuvuutta haittaavat lääkkeen annostelu hiirillä, joka yleensä heijastaa suurinta siedettyä annosta, annosten vaihtelu eri hiirikannoissa ja erityisesti kliinisesti merkityksellisen päätetapahtuman määrittely. Kliinisessä ympäristössä kasvainvasteet määritetään RECIST-menetelmällä. Hiirillä yksittäisten lääkehoitojen tehon määrittämiseksi on käytetty hyvin heterogeenista joukkoa mahdollisia päätetapahtumia, kuten kasvaimen taantumista suhteellisena kasvun estona ilmaistuna, kasvaimen tilavuutta kontrolliryhmään verrattuna, kasvaimen kasvun estoa ja aikaa päätetapahtumaan. Muita yleisiä mallin rajoituksia ovat PDX:n perustamisesta aiheutuvat korkeat kustannukset, vaihteleva verensiirtymisaste ja aika, joka kuluu ensimmäisestä siirrosta hoidon seulontatuloksiin. Tähän mennessä emme ole pystyneet määrittämään lääkekohtaisten kasvainvasteiden ennustearvoa ksenotransplantaattimallissa lähes 80 HNSCC:n PDX-mallista koostuvassa laajassa kokoelmassamme. Useat yritykset mainostavat kuitenkin PDX-mallia hoitovasteen ennustamisen välineenä. Champions Oncology käynnisti vuonna 2016 toteutettavuustutkimuksen (NCT02752932) tutkiakseen PDX:n ennustearvoa. Valitettavasti tuloksia ei ole toistaiseksi julkaistu.
PDX:n suurin haittapuoli on mallin perustamiseen ja laajentamiseen tarvittava pidempi aika verrattuna organoideihin, mikä tekee niiden tulevasta käytöstä yksittäisten lääkkeiden seulonta-alustana kliinisessä rutiinissa epätodennäköisempää. Lisäksi uudelleenasettaminen potilasperäisillä TME-komponenteilla, jotka puuttuvat molemmista nykyisillä protokollilla tuotetuista malleista, olisi saavutettava paljon helpommin organoideissa kuin ksenograft-hiirimalleissa. Tämä mahdollistaa TME:hen vaikuttavien syöpähoitojen (esim. everolimuus, bevasitsumabi, PD-1/PD-1 L-vasta-aineet) sisällyttämisen tuleviin ex vivo -seulontamenetelmiin.