Abstract
Sepsis on systeeminen reaktio mikrobien aiheuttamaan infektioon. Joko bakteerien tai muiden mikrobien aiheuttaman infektion erotusdiagnostiikka on olennaista tehokkaan hoidon ja ennusteen arvioinnin kannalta. Nykyiset kliiniset laboratoriomenetelmät bakteeri-infektioiden diagnosoinnissa ovat joko epäspesifisiä tai vaativat pidempiä läpimenoaikoja. Prokalsitoniini (PCT) on biomarkkeri, joka on spesifisempi kuin muut proinflammatoriset merkkiaineet (esim. sytokiinit) sepsistä sairastavien potilaiden tunnistamisessa ja jota voidaan käyttää bakteeri-infektioiden diagnosointiin. Tässä artikkelissa tarkastelemme PCT:tä koskevaa nykytietämystä ja sen käyttöä kliinisessä laboratoriossa.
Potilaiden tulehduksen bakteeriperäisen syyn tunnistaminen on ollut tärkeä kehitysalue kliinisessä laboratoriossa. Useita kliinisiä laboratoriotestejä on sovellettu sepsiksen diagnosointiin.1 Liemiviljelymenetelmä on kultainen standardi bakteeri-infektion diagnosoinnissa, mutta lopullisen tuloksen saaminen voi kestää 24 tuntia tai kauemmin ennen kuin lopullinen diagnoosi saadaan. Useita tulehdusmerkkiaineita, kuten leukosyyttisolujen määrää, C-reaktiivista proteiinia (CRP) ja sytokiineja (TNF-α, IL-1β tai IL-6), on käytetty tulehduksen ja infektion diagnosointiin, mutta niiden spesifisyyden puute on herättänyt jatkuvaa kiinnostusta kehittää spesifisempiä kliinisiä laboratoriotestejä.2 Eräs lupaava merkkiaine on ollut prokalsitoniini (PCT), jonka konsentraation on todettu olevan koholla sepsiksessä. Koska PCT on spesifinen bakteeri-infektioille, sitä on ehdotettu sopivaksi merkkiaineeksi bakteeri-infektioiden nopeassa diagnosoinnissa erityisesti sairaaloiden päivystysosastoilla ja tehohoitoyksiköissä käytettäväksi. Sen jälkeen, kun PCT tunnistettiin ja yhdistettiin sepsikseen 1990-luvulla, on tehty lukuisia tutkimuksia PCT:stä ja sen kliinisestä käytöstä. PCT-pitoisuuksien määrittämiseen tarkoitettu testi on ollut saatavilla Euroopassa jo useita vuosia, ja FDA hyväksyi sen äskettäin käytettäväksi Yhdysvalloissa.3
PCT:n biokemia
Prokalsitoniini on 116 aminohappoa sisältävä peptidi, jonka likimääräinen megawattimassa (MW) on 14,5 kDa, ja se kuuluu peptidien kalsitoniini- (CT-) superperheeseen. Se voidaan jakaa kolmeen osaan, joihin kuuluvat PCT-alueen aminoterminaali, epäkypsä kalsitoniini ja kalsitoniinin karboksyyliterminaalipeptidi-1 (CCP-1, jota kutsutaan myös katakalsiiniksi) (kuva 1).4 Prokalsitoniinia koodaa kromosomissa 11 sijaitseva CALC-1-geeni. CALC-1-geenin primaarisen transkriptin 1 kohdassa tapahtuva pilkkominen tuottaa pre-PCT:tä, jonka signaalisekvenssi pilkkoutuu proteolyyttisesti ja tuottaa PCT:tä.5,6 Muita CT-peptidien superperheeseen kuuluvia peptidejä ovat kalsitoniinigeeniin liittyvät peptidit I ja II (CGRP-I, CGRP-II), amyliini ja adrenomedulliini. Kalsitoniinigeeniin liittyvää peptidiä I koodaa myös CALC-1-geeni, ja se syntyy CALC-1-mRNA:n primaarisen transkriptin vaihtoehtoisella liittämisellä. Kalsitoniinigeeniin liittyvää peptidiä II, amyliiniä ja adrenomedulliinia koodaavat muut geenit (taulukko 1).
Prokalsitoniinin ilmentyminen tapahtuu kudosspesifisesti. Infektion puuttuessa PCT:tä tuottavan CALC-1-geenin transkriptio ei-neuroendokriinisessä kudoksessa tukahdutetaan, paitsi kilpirauhasen C-soluissa, joissa sen ilmentyminen tuottaa PCT:tä, joka on CT:n esiaste terveillä ja ei-infektoituneilla henkilöillä.5 Syntetisoitu PCT käy sitten läpi posttranslationaalisen prosessoinnin tuottaakseen pieniä peptidejä ja kypsää CT:tä, joka syntyy, kun peptidyyliglysiiniä α-amidoiva monooksygenaasi (PAM) poistaa C-terminaalisen glysiinin epäkypsästä CT:stä.7 Kypsä CT varastoituu sihteerigranulaatioon, ja se erittyy vereen kalsiumkonsentraation säätelyä varten. Mikrobi-infektion yhteydessä myös muut kuin neuroendokriiniset kudokset ilmentävät CALC-1-geeniä tuottaakseen PCT:tä. Mikrobi-infektio indusoi CALC-1-geenin ilmentymisen huomattavan lisääntymisen kaikissa elimistön parenkyymikudoksissa ja erilaistuneissa solutyypeissä, jotka tuottavat PCT:tä.8 Sen pitoisuudet lisääntyvät merkittävästi vakavissa systeemisissä infektioissa verrattuna muihin mikrobi-infektioiden parametreihin.9 Muissa kuin neuroendokriinisissä kudoksissa syntetisoituvan PCT:n funktio mikrobi-infektiossa on tällä hetkellä epäselvä; sen havaitseminen on kuitenkin auttanut tulehdusprosessien erotusdiagnostiikassa.
Yleiskatsaus sepsikseen
Sepsiksellä tarkoitetaan systeemistä reaktiota mikrobiperäisten taudinaiheuttajien, kuten bakteereiden, sienten ja hiivojen, aiheuttamaan infektioon, jossa potilaalle kehittyy tyypillisesti kuumetta, takykardiaa, takykardiaa, takykardiaa, takyyppistä hengitystä (tachypnea) ja leukosytoosia. Verestä tai infektiokohdasta otetut mikrobiologiset viljelmät ovat usein, vaikkakaan eivät poikkeuksetta, positiivisia. Vaikeaan sepsikseen liittyy vähintään yhden elimen hypoperfuusio tai toimintahäiriö. Kun vakavaan sepsikseen liittyy hypotensio tai usean elimen vajaatoiminta, tilasta käytetään nimitystä septinen sokki. Epidemiologisten tutkimusten mukaan Yhdysvalloissa esiintyy vuosittain noin 750 000 sepsistapausta.10 Sepsiksen merkit ja oireet vaihtelevat suuresti, ja niihin vaikuttavat monet tekijät, kuten taudinaiheuttajan virulenssi ja biokuorma, tartuntaportti ja isännän alttius. Ensisijaisia paikkoja ovat hengitystieinfektiot, joita seuraavat virtsa- ja sukupuolielinten infektiot ja ruoansulatuskanavan infektiot.11 Viime aikoina on raportoitu yhä useammin sairaalahoitopotilaiden bakteeri-infektioista, mikä johtuu katetroinnin ja immunosuppressiivisten hoitojen aiheuttamien sairaalainfektioiden lisääntyneestä määrästä sairaalahoidossa olevien potilaiden lisääntyneistä sairaalainfektioista ja metisilliinille vastustuskykyisen stafylokokin (MRSA) lisääntyneistä aiheuttajista.11 Sairaalahoidossa olevilla potilailla esiintyvää immuunireaktiota käsiteltäessä bakteeri-infektiosta, muusta mikrobiperäisestä infektiosta tai elimen hyljintätilasta johtuvien inflammaatioiden erottaminen on tärkeää. Yleinen ongelma kliinisessä käytännössä on se, että bakteeri- ja virusinfektioiden merkit ja oireet ovat laajalti päällekkäisiä, erityisesti hengitystieinfektioissa. Toisinaan diagnostinen epävarmuus säilyy vielä potilaskertomuksen hankkimisen, fyysisen tutkimuksen, rintakehän röntgentutkimuksen ja laboratoriokokeiden suorittamisen jälkeenkin. Näin ollen spesifisempi laboratoriotesti parantaisi merkittävästi kliinistä erotusdiagnoosia näissä tapauksissa. Lisäksi infektion erotusdiagnoosi auttaisi päättämään, olisiko antibioottihoidosta hyötyä. Tältä osin noin 75 prosenttia kaikista antibioottiannoksista määrätään akuutteihin hengitystieinfektioihin, joiden etiologia on pääasiassa virusperäinen.5 Antibioottien liiallinen käyttö on tärkein syy antibiooteille resistenttien bakteerien leviämiseen. Näin ollen antibioottien käytön vähentäminen on olennaista antibiooteille vastustuskykyisten mikro-organismien lisääntymisen torjumiseksi.
Kuvio 1
Kaavio, jossa on esitetty prokalsitoniinin, kalsitoniinin ja kalsitoniinikarboksypeptidi-1:n suhde.
Skeema, joka osoittaa prokalsitoniinin, kalsitoniinin ja kalsitoniinikarboksypeptidi-1:n suhteen.
Sepsiksen diagnosointimenetelmät
Perinteiseen sepsiksen diagnosointimenetelmään kuuluu veren, virtsan, aivo-selkäydinnesteen (CSF) tai keuhkoputkenesteen näytteiden viljely, ja se kestää yleensä 24-48 tuntia. Valitettavasti kliiniset oireet ilmenevät usein ilman positiivista viljelyä. Perinteiset infektion kliiniset oireet ja sepsiksen rutiininomaiset laboratoriokokeet, kuten CRP tai leukosyyttien määrä, eivät ole riittävän tarkkoja ja joskus harhaanjohtavia. Vaikeissa infektioissa useimmat klassiset pro-inflammatoriset sytokiinit, kuten TNF-α, IL-1β tai IL-6, lisääntyvät vain lyhytaikaisesti tai ajoittain, jos lainkaan. Kun otetaan huomioon edellä mainitut diagnostiset ja terapeuttiset dilemmat, yksiselitteisempi testi infektion ja sepsiksen erotusdiagnostiikkaa varten on ensiarvoisen tärkeää.
Kalsitoniinin superperheen peptidien välinen suhde
| Kromosomi . | 11 . | 11 . | 11 . | 12 . | 11 . | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| geenit | CALC-1 | CALC-II | CALC-II | CALC-II | CALC-II | CALC-II | CALC-III | CALC-…IV | CALC-V | |
| Peptidit | *PCT I | CGRP-II | Pseudogeeni (non-käännetty geeni)31 | Amyliini | Adrenomedulliini | |||||
| *PCT II | ||||||||||
| CGRP-I |
| Kromosomi . | 11 . | 11 . | 11 . | 12 . | 11 . | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| geenit | CALC-1 | CALC-II | CALC-II | CALC-II | CALC-II | CALC-II | CALC-III | CALC-…IV | CALC-V | |
| Peptidit | *PCT I | CGRP-II | Pseudogeeni (non-käännetty geeni)31 | Amyliini | Adrenomedulliini | |||||
| *PCT II | ||||||||||
| CGRP-I |
PCT II eroaa PCT I:stä 8:lla aminohapolla C-päässä.
Kalsitoniinin superperheen peptidien välinen suhde
| Kromosomi . | 11 . | 11 . | 11 . | 12 . | 11 . | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| geenit | CALC-1 | CALC-II | CALC-II | CALC-II | CALC-II | CALC-II | CALC-III | CALC-…IV | CALC-V | |
| Peptidit | *PCT I | CGRP-II | Pseudogeeni (non-käännetty geeni)31 | Amyliini | Adrenomedulliini | |||||
| *PCT II | ||||||||||
| CGRP-I |
| Kromosomi . | 11 . | 11 . | 11 . | 12 . | 11 . | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| geenit | CALC-1 | CALC-II | CALC-II | CALC-II | CALC-II | CALC-II | CALC-IIIV | CALC-V |
| Peptidit | *PCT I | CGRP-II | Pseudogeeni (non-käännetty geeni)31 | Amyliini | Adrenomedulliini | |||
| *PCT II | ||||||||
| CGRP-I |
PCT II eroaa PCT I:stä 8 aminohapon verran C-päässä.
PCT-mittaukset bakteeri-infektioiden diagnostiikassa
1990-luvun puolivälistä lähtien PCT-mittauksia on käytetty yhä enemmän systeemisten bakteeri-infektioiden tunnistamisessa.3 PCT:n lyhyt puoliintumisaika (25-30 tuntia plasmassa) yhdistettynä siihen, että se on lähes terve ja spesifinen bakteeri-infektioiden suhteen, antaa sille selvän edun muihin bakteeri-infektion merkkiaineisiin verrattuna.3,4,4 Tutkimukset ovat myös osoittaneet, että PCT-pitoisuuksien nousu on vähäistä virusinfektioissa, kun taas pitoisuudet nousevat nopeasti endotoksiinin yksittäisen injektion jälkeen.12,13 PCT-pitoisuuden nousu ei myöskään liity tiettyihin bakteerikantoihin, vaikka Rowtherin ja kollegoiden tutkimuksessa tunnistettiin ja luetteloitiin septisten potilaiden kannat, joiden seerumin PCT-pitoisuudet olivat >2 ng/ml.14 Hiljattain Jacquot työtovereineen osoitti, että PCT:n nopealla mittaamisella voitiin sulkemaan pois sairaalainfektio teho-osastolla sairaalahoidossa olleilta vastasyntyneiltä.15
Toisessa tutkimuksessa de Jager ja kollegat tutkivat PCT-pitoisuuksien mittaamisen arvoa Legionella pneumophila -bakteerin aiheuttaman yhteisperäisen keuhkokuumeen (CAP) saaneiden potilaiden verestä verrattuna muihin tavanomaisiin parametreihin, kuten CRP:hen ja WBC:n määrään.16 He havaitsivat, että alkuvaiheen korkeat PCT-pitoisuudet viittasivat vaikeampaan tautiin, mikä näkyi potilaan pidempinä oleskeluajankohtina teho-osastolla ja / tai sairaalakuolemaan. Lisäksi jatkuvasti kohonneet PCT-pitoisuudet olivat aina osoitus epäsuotuisasta lopputuloksesta. Näin ollen PCT-tasojen määrittäminen antoi arvokasta tietoa potilaan ennusteesta, jota ei voitu määrittää tavanomaisista tulehdusparametreista, kuten CRP:stä ja WBC-arvoista. Lisäksi PCT-mittausten käytön potilaiden tehokkaassa antibioottihoidossa on osoitettu lyhentävän potilaiden sairaalassaoloaikaa. Kristoffersen ja kollegat raportoivat, että niillä potilailla, joilla oli krooninen obstruktiivinen keuhkosairaus, yksi seerumin PCT-määritys sairaalahoitoon ottamisen yhteydessä lyhensi sairaalahoidon keskimääräistä kestoa 7,1 päivästä 4,8 päivään.17
PCT:n mittaaminen
Prokalsitoniinia voidaan mitata kvantitatiivisella homogeenisella määrityksellä (BRAHMS, Hennigsdorf, Saksa). Määritys perustuu TRACE-tekniikkaan (Time Resolved Amplified Cryptate Emission) (kuva 2). Typpilaser, jonka lämpötila on 337 nm, kohdistetaan näytteeseen, joka sisältää PCT:tä ja kahta fluoresoivasti leimattua vasta-ainetta, jotka tunnistavat PCT-peptidin eri epitooppeja. Määrityksen periaate perustuu säteilemättömän energian siirtoon ”luovuttaja-” ja ”vastaanottajamolekyylien” välillä. Kun luovuttajamolekyyli herätetään, se lähettää pitkäikäisen fluoresoivan signaalin milli-sekuntien alueella 620 nm:ssä, kun taas kun akseptorimolekyyli herätetään, se lähettää lyhytikäisen signaalin nanosekuntien alueella 665 nm:ssä. Kun molemmat molekyylit tuodaan lähelle toisiaan sitoutumalla PCT:hen, syntyvä signaali vahvistuu 665 nm:ssä ja pitkittyy muutaman mikrosekunnin mittaiseksi. Tämä pidentyminen varmistaa, että signaali voidaan mitata sen jälkeen, kun taustafluoresenssi (joka on yleistä biologisissa näytteissä) on hävinnyt. BRAHMS-määrityksessä luovuttajamolekyyli on Europium-kryptatilla leimattu polyklonaalinen lampaan vasta-aine, joka tunnistaa epitooppeja epäkypsällä CT-alueella, kun taas akseptorimolekyyli on XL665-leimattu monoklonaalinen vasta-aine, joka on kasvatettu PCT:n CCP-1-aluetta vastaan18,19 .
Kaavio, jossa esitetään TRACE-tekniikan periaatteet.
Kuva 2
Kaavio, jossa esitetään TRACE-tekniikan periaatteet.
Määritykseen soveltuvat näytteet voivat olla seerumia tai plasmaa käyttäen antikoagulantteina joko EDTA:ta tai hepariinia, mutta ei sitraattia, koska sen on osoitettu aliarvioivan PCT-pitoisuuksia.18
PCT-mittaukset muissa sairauksissa
PCT:n käyttökelpoisuutta diagnostisena merkkiaineena muissa tulehduksellisissa sairaustiloissa ovat arvioineet ja tarkastelleet muun muassa Becker ja työtoverit.20 Malariassa PCT-pitoisuudet ovat koholla sekä vaikeassa että komplisoitumattomassa Plasmodium falciparum -malariassa, mutta PCT:n avulla ei voitu tehdä eroa näiden kahden malariatyypin välillä, joten PCT:stä oli vain rajoitetusti hyötyä malarian diagnosoinnissa.21,22 PCT:n arvoa keuhkotuberkuloosin (PTB) diagnosoinnissa on niin ikään selvitetty, ja sen arvo on osoittautunut vähäiseksi.19 Baylanin ja työtovereiden tutkimuksessa todettiin, että aktiivista PTB:tä sairastavilla aktiivisilla PTB:tä sairastavilla potilailla seerumin PCT- pitoisuudet olivat hieman koholla sairaalaan tultaessa, kun verrataan niitä kontrollitiloihin ja potilaisiin, jotka saivat antituberkuloottista sytostaattikemiaa. Vaikka tämä ero oli tilastollisesti merkitsevä, useimpien PTB-tapausten PCT-tasot (58,7 %) olivat alle tavanomaisen raja-arvon (0,5 ng/ml).23 Näin ollen PCT ei ollut luotettava indikaattori aktiivisen PTB:n diagnosoinnissa, eikä sitä voitu korvata mikrobiologisilla, epidemiologisilla, kliinisillä ja radiologisilla tiedoilla.23 Nyamande ja Lalloo havaitsivat kuitenkin, että PCT-tasot voivat olla hyödyllisiä erotettaessa tavallisista bakteereista, kuten Mycobacterium tuberculosis (TB) ja Pneumocystis jirovecii (PJP), johtuvaa yhteisperäistä keuhkokuumetta (CAP) korkeassa HIV:n esiintyvyysasteessa, jossa epätyypilliset taudinkuvaukset aiheuttivat usein sekaannusta empiirisessä kliinisessä diagnoosissa.24 Heidän tutkimuksensa osoitti, että PCT-pitoisuudet eroavat merkittävästi potilailla, joilla on tuberkuloosista, PJP:stä ja bakteereista johtuva CAP.
Prokalsitoniinimäärityksillä on todettu olevan huomattavaa arvoa sen tunnistamisessa, johtuuko elinsiirron jälkeinen tulehdus bakteeri-infektiosta vai elimen hylkimisestä. Mendonca ja kollegat osoittivat, että maksansiirron saaneilla potilailla plasman PCT-pitoisuudet olivat merkittävästi suurentuneet infektoituneilla potilailla verrattuna akuuttia maksan hyljintää sairastaviin potilaisiin, joilla pitoisuudet olivat samankaltaisia kuin komplikaatiota sairastamattomilla potilailla.25 Madershahian ja kollegat osoittivat, että PCT-pitoisuudet sydämensiirron jälkeen voivat toimia hyödyllisenä ennusteen merkkiaineena.26 Prokalsitoniinipitoisuuksien todettiin olevan johdonmukaisesti alhaisia (<10 ng/ml) potilailla, joilla elinsiirron jälkeinen taudinkulku oli sujuva, mutta ne olivat useammin suurentuneet potilailla, joilla oli postoperatiivisia komplikaatioita, ja ne olivat jopa yhteydessä lisääntyneeseen kuolleisuuteen varhaisessa vaiheessa postoperatiivisesti, kun arvot ylittivät 80 ng/ml. Näin ollen PCT-pitoisuudet ensimmäisinä sydämensiirron jälkeisinä päivinä voisivat auttaa tunnistamaan potilaat, joilla on komplikaatioriski, kun pitoisuudet ylittävät siirron jälkeisen ”normaalin” vaihteluvälin.26
Pitoisuudet PCT:n mittauksessa
Kirjallisuudessa on myös raportteja, joissa PCT-pitoisuuksien kohoamiset eivät liittyneet bakteeri-infektioihin. Lisämunuaisen vajaatoiminnan aiheuttama addisonikriisi on yhdistetty kohonneisiin PCT-pitoisuuksiin.27 Kohonneita PCT-pitoisuuksia, jotka ovat verrattavissa vakavassa sepsiksessä havaittuihin, on havaittu myös elinsiirtopotilailla, jotka saivat pan-T-soluvasta-ainehoitoa.28 Viime aikoina Brodska ja kollegat raportoivat PCT- ja CRP-tasojen huomattavasta kohoamisesta potilailla, joille oli suunniteltu hematopoieettista kantasolusiirtoa ja jotka saivat antitymosyyttiglobuliinia hoidon aikana.29
Yhteenveto
Viimeisten 15 vuoden aikana PCT:n käyttö systeemisen tulehduksen bakteeriperäisen tai muun kuin bakteeriperäisen alkuperän selvittämiseksi on saanut laajaa kannatusta, ja on todennäköistä, että tämä suuntaus jatkuu. Vaikka PCT on osoittautunut mielenkiintoiseksi sepsiksen merkkiaineeksi, sen fysiologinen rooli on edelleen epävarma. On näyttöä siitä, että PCT:n käyttö sepsistä sairastavien potilaiden seurannassa vähentää näiden potilaiden sairastuvuutta ja kuolleisuutta. PCT:n antaminen verenmyrkytykseen sairastuneille hamstereille lisäsi niiden kuolleisuutta, kun taas PCT-vasta-aineen antaminen lisäsi niiden eloonjäämisastetta.30 PCT:n ilmentymisen puuttuminen terveessä tilassa lähes kokonaan ja sen ilmentyminen käytännöllisesti katsoen jokaisessa elimessä sepsiksen aikana antaa aihetta olettaa, että PCT:n ilmentyminen liittyy olennaisesti vakavalle sepsikselle ominaiseen elinten sammumiseen. Lisätutkimukset, joiden tarkoituksena on selvittää PCT:n roolia sepsiksessä, auttaisivat ymmärtämään sepsiksen patogeneesiä, jotta voitaisiin kehittää parempia ja tehokkaampia hoitokeinoja.
Tekijät haluavat kiittää Chris Ciottia, Stephen Barnesia ja Jim Bromleya (BRAHMS USA) hyödyllisistä keskusteluista PCT-määrityksen teknisistä ja kliinisistä näkökohdista.
.
.
.
;
:
–
.
.
.
.
;
:
–
.
et al. .
.
.
;
:
–
.
.
.
.
;
:
–
.
.
.
.
;
:
–
.
.
.
.
;
:
–
.
.
.
.
;
:
–
.
ym .
.
.
;
:
–
.
ym. .
.
.
;
:
–
.
ym.
.
.
;
:
–
.
.
.
.
;
:
–
.
.
.
.
;
:
–
.
ja muut.
.
.
;
:
–
.
ja muut .
.
.
;
:
–
.
.
.
.
;
:
–
.
ym.
.
.
;
:
–
.
et al.
.
.
;
:
–
.
Ohjekirja (versio 4.0us) artikkelinumero: 825.050: Immunofluoresenssimääritys PCT:n (prokalsitoniinin) määrittämiseksi ihmisen seerumista ja plasmasta. BRAHMS PCT sensitive KRYPTOR 2008 (Hennigsdorf, Saksa).
et al.
.
.
;
:
–
.
.
.
.
;
:
–
.
et al.
.
.
;
:
–
.
ym .
.
.
;
:
–
.
ym .
.
.
;
:
–
.
.
.
.
;
:
–
.
ym.
.
;
. .
et al. .
.
.
;
:
–
.
ym .
.
.
;
. .
et al. .
.
.
;
:
–
.
ym .
.
.
;
:
.
Jr.
ym .
.
.
;
:
–
.
ym.
.
.
;
:
–
.