Alai

a Huhtikuuhun 2015 mennessä asennettu ja suunniteltu selluloosaetanolin tuotanto miljoonina litroina vuodessa (MMLY). Kapasiteettitiedot on koottu erilaisista selluloosapohjaisia biopolttoaineita käsittelevistä erikoisjulkaisuista sekä mukana olevien konsortioiden ja yritysten lehdistötiedotteista. b Yksittäisten lajien tuottamien erilaisten teknisten entsyymivalmisteiden lukumäärä. c T. reesei (tummempi väri) tai muiden sienten (vaaleampi väri) tuottamien tietyn tyyppisten entsyymien lukumäärä. Molemmissa tapauksissa (B + C) tiedot haettiin teknisten entsyymien luettelosta (vuoden 2014 versio) entsyymivalmisteiden valmistajien ja formuloijien yhdistyksen (http://www.amfep.org) ystävällisellä luvalla. d Eri sieniä koskevien tutkimusjulkaisujen määrä vuodessa, jotka haettiin Scopus-haulla, jossa lajin nimi oli merkintänä. Tulokset keskiarvoistettiin kolmen vuoden välein satunnaisvaihtelun vaikutuksen vähentämiseksi. Jos lajille on olemassa toinen nimi, tehtiin kontrollihaku molemmilla nimillä ja koottiin luvut yhteen

T. reesei biomassan entsyymiyhdistelmä: uusia oivalluksia ja rajoituksia

Luonnossa lignoselluloosan dekonstruktiota suorittaa harvoin yksi organismi. Se tapahtuu pikemminkin useiden sellaisten organismien peräkkäisessä järjestyksessä ja yhteisin ponnistuksin, jotka tuottavat useita hiilihydraattiaktiivisia entsyymejä (CAZymes) eri polymeerien hajottamiseksi. Näin ollen ei ole yllättävää, että T. reesei -organismin erittyvää sellulaasiseosta oli mukautettava merkittävästi, jotta saataisiin kustannuksiltaan kilpailukykyinen entsyymivalmiste täydellistä lignoselluloosan sakkarointia varten. Tutkijat huomasivat jo varhain, että T. reesei -valmisteista puuttui riittävä β-glukosidaasiaktiivisuus, koska suurin osa aktiivisuudesta on sitoutunut sienen soluseinään. Näin ollen lisääntynyt β-glukosidaasiaktiivisuus paransi selluloosan hajoamista, koska se kumoaa sellobioosin aiheuttaman tuotteen eston, jota puolestaan vapautuu endoglukanaasien ja sellobiohydrolaasien yhteistoiminnan seurauksena. Tämä takaisinkytkentämekanismi hidastaa muuten vakavasti selluloosan sokeroitumista. Samoin hemiselluloosasta peräisin olevat ksylo- ja mannooligosakkaridit estävät T. reesei -organismin sellobiohydrolaaseja, mikä viittaa vahvasti siihen, että lignoselluloosan tehokas hajottaminen edellyttää riittävää β-ksylosidaasi- ja β-mannosidaasiaktiivisuutta. Foreman et al. kuvasivat vuonna 2003 kaksi proteiinia, jotka indusoituvat yhdessä tärkeimpien sellulaasien kanssa, ja nimesivät ne selluloosaindusoituneiksi proteiineiksi 1 ja 2 (CIP1 ja CIP2). Niiden on sittemmin osoitettu olevan tärkeitä lignoselluloosan tehokkaan hajottamisen kannalta. Viimeaikaiset tulokset osoittavat, että CIP1:llä on rakenteellisia yhtäläisyyksiä lyaasien kanssa, vaikka lyaasiaktiivisuutta ei ole voitu osoittaa, ja että CIP2 on CE15-perheeseen kuuluva glukuronoylesteraasi . Toinen tärkeä erittyvä proteiini on swolleniini SWO1 , joka sisältää hiilihydraatteja sitovan moduulin (CBM), joka on yhdistetty ekspansiinin kaltaiseen domeeniin . Huolimatta selluloosaa hajottavasta aktiivisuudesta SWO1 lisää synergisesti endoksylanaasi- eikä endoglukanaasi- tai sellobiohydrolaasiaktiivisuutta esikäsitellyn maissin tähkän entsymaattisen hydrolyysin aikana. Yksi ehdotettu vaikutustapa on, että se tekee lignoselluloosan ksylaaniosan helpommin saatavaksi ksylanaasien hajotettavaksi ja edistää siten epäsuorasti sellulaasien toimintaa. Viime vuosien suurin vallankumous selluloosan hajoamisessa oli luultavasti lyttisten polysakkaridimonooksygenaasien (LPMO) löytyminen. Nämä entsyymit ottivat käyttöön uuden, oksidatiivisen mekanismin polysakkaridien hajotuksessa. Selluloosan hajoamisessa oletetaan, että LPMO:t vaikuttavat kiteisten selluloosafibrillien pinnalla, jolloin ne ovat helpommin sellulaasien saatavilla. Mielenkiintoista on, että nämä entsyymit voivat saada prosessiin tarvittavat elektronit kasvin soluseinän ligniinistä pitkän matkan elektroninsiirron kautta, jolloin kasvin puolustusmekanismit kääntyvät sitä vastaan. Vaihtoehtoisesti GMC-oksidoreduktaasit tai sellobioosidehydrogenaasit voivat toimia elektronien luovuttajina . Tämä havainto voisi hyvin selittää, miten T. reesei ruokkii LPMO:taan, sillä aiemmin osoitettiin, että vehnän olki todellakin indusoi useita tällaisia GMC-oksidoreduktaaseja . Tämä hapetusmekanismi ei kuitenkaan suinkaan rajoitu selluloosan depolymerisaatioon. Alun perin kitiinille osoitetulla LPMO:lla on merkitystä myös ksyloglukaanin ja amyloosin hajoamisessa. CAZy-tietokannassa tähän ryhmään kuuluvat entsyymit on luokiteltu uudelleen ”aputoiminnoiksi” (AA) sen sijaan, että ne olisi aiemmin luokiteltu glykosidihydrolaaseiksi (esim. GH61), ja ne kuuluvat AA-perheisiin 9-11 ja 13 . Kuten edellä on esitetty, hemisellulolyyttiset toiminnot ovat tärkeitä lignoselluloosan täydelliselle sokeroitumiselle (ks. Harris et al. ). Yksittäisiä aktiviteetteja tarvitaan eri määriä sen mukaan, millaisia hemiselluloosatyyppejä substraatissa on. Siksi on huomionarvoista, että T. reesei -organismin entsymaattisella repertuaarilla on joitakin selkeitä rajoituksia tietyntyyppisten hemiselluloosakohtaisten sidosten osalta. Yksi tällainen puuttuva aktiivisuus on α-ksylosidaasi. α-ksylosidaasin lisääminen kaupalliseen T. reesei -entsyymivalmisteeseen lisäsi ksyloosin ja glukoosin vapautumista esikäsitellystä maissin tähteestä. Vastaavasti GH-perheen 5 sellulaasin lisääminen, jolla on aktiivisuutta glukomannaania ja ksylaania vastaan, paransi merkittävästi synteettistä T. reesei -entsyymivalmistetta . Muita T. reesei -sellulaasiseoksessa puuttuvia tai hyvin vähäisiä aktiivisuuksia ovat endoarabinaasi ja useat pektinaasiaktiivisuudet . Kaupallisten sellulaasiseosten täydentäminen näillä entsyymiaktiivisuuksilla paransi näin ollen eri substraattien sokerointia . Toinen kysymys, johon ei ole vielä saatu vastausta, on T. reesei -sienen genomissa koodattujen erittyvien lakkaasien kaltaisten multikuparioksidaasien in vivo -toiminta.

T. reesei -sienen parantaminen proteiinintuotannon isäntänä

Kun otetaan huomioon, että sellulaasit ja suurin osa muista lignoselluloosaa hajottavista entsyymeistä ilmentyvät koordinoituneesti ja ehdollisesti , niiden transkriptionaalinen säätely on looginen suunnittelukohde, jolla voidaan parantaa sienen sellulaasituotantoa. Yksi tärkeimmistä säätelijöistä on hiilikataboliittien repressiota välittävä C2H2-tyyppinen transkriptiotekijä CRE1. CRE1 sammuttaa kohdegeeniensä transkription, kun läsnä on edullisempia hiililähteitä, kuten glukoosia. Sen typistäminen on yksi tärkeimmistä syistä parempaan sellulaasituotantoon, joka on saavutettu T. reesei QM6a:n satunnaismutageneesiohjelmilla, jotka johtavat kantaan RUT-C30, jolla on korkeampi sellulaasituotannon perustaso ja indusoitu taso. Vastaavasti CRE1:ää sitovien motiivien korvaaminen tärkeimmän sellobiohydrolaasi cel7a:n promoottorialueella tunnetun sellulaasiaktivaattorin motiiveilla vähentää hiilikataboliitin repressiota ja lisää cel7a:n transkriptiota aktivoivissa ja repressiivisissä olosuhteissa . Lisäksi sellulaasin, ksylanaasin ja useiden muiden lignoselluloosan hajoamiseen osallistuvia entsyymejä koodaavien geenien transkriptio riippuu tiukasti Zn(II)2Cys6-tyyppisestä transkriptioaktivaattorista XYR1 . Tämä poikkeaa muista sienistä, kuten sordariomykeeteistä Neurospora crassa ja Fusarium fujikuroi, joissa XYR1-ortologi moduloi yksinomaan ksylanaasigeenin ilmentymistä . XYR1:n typistettyyn muotoon johtavan mutaation havaittiin aiheuttavan Natickin mutageneesiohjelmasta peräisin olevan kannan QM9136 sellulaasinegatiivisen fenotyypin. Vastaavasti sellulaasia yli- ja ylituottavien mutanttien mRNA-tasot ovat koholla transkriptionaalisten aktivaattoreiden xyr1:n mRNA:n osalta. On myös osoitettu, että XYR1:n yliekspressio johtaa sellulaasien korkeampaan ilmentymiseen ja kumoaa niiden kataboliittirepression glukoosin läsnä ollessa . Lisäksi XYR1:n oletetulla säätelyalueella oleva pistemutaatio johtaa samalla tavoin dereguloituneeseen ilmentymismalliin . XYR1:n ja CRE1:n lisäksi kolme transkriptiotekijää ACE1, ACE2 ja ACE3 säätelevät sellulaasien ja ksylanaasien ilmentymistä T. reeseissä . CRE1:n tavoin ACE1 on C2H2-sinkkisormirepressori, ja sen deletointi parantaa sekä sellulaasien että ksylanaasien tuotantoa . ACE2 ja ACE3 ovat XYR1:n tavoin Zn(II)2Cys6-tyyppisiä transkription aktivaattoreita . Kun ace2 puuttuu, sellulaasien ja ksylanaasien transkriptio vähenee vastaavasti, vaikka sellulaasin induktio sophoroosilla ei ilmeisesti vaikuta. Ace3:n poistaminen poistaa sellulaasien transkription kokonaan, mutta vähentää ainoastaan ksylanaasien transkriptiota. ACE2:n yliekspressiota ei ole vielä kokeiltu, mutta ACE3:n yliekspressio johtaa molempien entsyymityyppien aktiivisuuden lisääntymiseen, samoin kuin kuuden muun toistaiseksi tuntemattoman säätelijän yliekspressio . Näihin kuuluvat kaksi muuta Zn(II)2Cys6-tyyppistä transkriptiotekijää sekä kaksi WD40-proteiinia, bromodomeeniproteiini ja gcn5:een liittyvä asetyylitransferaasi. Kaikki kolme Zn(II)2Cys6-transkriptioaktivaattoria (XYR1, ACE2 ja ACE3) muistuttavat hyvin tunnettua S. cerevisiaen Gal4-proteiinia. On hyvin osoitettu, että Gal4 rekrytoi Gcn5:tä sisältävän SAGA-kompleksin ja edistää siten kohdegeeniensä transkriptiota histoniasetylaation ja euchromatiinin muodostumisen kautta. Itse asiassa T. reesei -organismin Gcn5-ortologi on välttämätön sellulaasin ilmentymiselle ja osallistuu histonien asetylaatioon cbh1-promoottorissa. Viime vuosina on syntynyt kuva, jonka mukaan sellulaasien ja niihin liittyvien CAZymien transkriptiota sienissä ohjaa monien transkriptiotekijöiden yhdistelmä, joka edustaa monimutkaista transkriptionaalista säätelyverkostoa, johon vaikuttavat vastakkain vaikuttavat aktivaattorit ja repressorit. Esimerkiksi Penicillium oxalicumissa kaksikymmentä transkriptiotekijää moduloi sellulaasigeenien aktivaatiota tai repressiota. Näistä ClrB tunnistettiin kaikkien muiden säätelijöiden ja niiden kohdegeenien keskeiseksi integroijaksi. Näiden säätelijöiden homologeja löytyy T. reesei -kasvista, mutta kun otetaan huomioon kasvien soluseinän säätelyn sopeutumisen moninaisuus, on odotettavissa, että myös muilla ja erilaisilla säätelijöillä on merkittävä rooli. Toinen keskeinen toimija sellulaasin säätelyssä on T. reesei -ortologi arvoitukselliselle Aspergillus LaeA -geenille, joka osallistuu sekundaarimetaboliittien geeniryhmien säätelyyn eri sienissä . Vaikka tämän oletetun proteiinimetyylitransferaasin deletio johtaa eri sellulaasi- ja muiden CAZyme-geenien voimakkaaseen alasäätelyyn, sen yliekspressio voi edistää voimakkaasti niiden ilmentymistä . Samanlaisia vaikutuksia havaittiin VELVET-kompleksin LAE1:n kanssa vuorovaikutuksessa olevalla VEL1-proteiinilla .

Useimmat edellä mainituista tutkimuksista tarjoavat perustavanlaatuisia näkemyksiä sellulaasin muodostumisen säätelystä. Koska useimmat näistä tutkimuksista tehtiin joko alkuperäisellä T. reesei-isolaatilla QM6a tai kohtalaisesti ylituottavalla kannalla QM9414, on edelleen epäselvää, voidaanko ja missä määrin nämä vaikutukset toteuttaa ylituottavissa kannoissa. Näissä kannoissa sellulaasituotannon lisäämistä saattavat rajoittaa sellulaasituotannon lisäämistä transkription sijasta sellulaasin translaation, erittymisen ja erittyneiden entsyymien vaihtumisen kaltaiset prosessit. On mielenkiintoista nähdä, voidaanko useita raportoiduista tavoista parantaa sellulaasigeenin ilmentymistä pinota ja miten tällaiset kannat suoriutuisivat satunnaisen mutageneesin avulla saatuihin hypertuottajiin verrattuna.

Haittavan geenin transkription pelkkä lisääminen ei aina johda parempaan tuotteen muodostumiseen etenkään muiden kuin sieniproteiinien kohdalla. Yksi menestyksekäs strategia vähäisen tuotteenmuodostuksen kiertämiseksi on fuusiogeeneihin perustuva lähestymistapa, jossa käytetään voimakkaasti ekspressoituvan geenin promoottorin ja terminaattorin alueen lisäksi myös koodattua proteiinia ekspression tehostajana. T. reesei -kasvintuhoojan tapauksessa tämä on sellobiohydrolaasia koodaava cel7A, joka on voimakkaimmin ekspressoituva proteiini sellulaasia indusoivissa olosuhteissa. Näiden geenifuusioiden uskotaan yleisesti lisäävän mRNA:n stabiilisuutta, tuontia ER:ään ja kulkua eritysreitin läpi. Tätä varten hyödynnetään usein CEL7A:n modulaarista rakennetta, joka koostuu katalyyttisestä moduulista, linkkeristä ja CBM:stä, jolloin C-terminaalinen CBM korvataan halutulla geenillä. Tästä geenifuusiomenetelmästä on nyt saatavilla muunnelmia, jotka kohdistavat proteiinin ER:ään oikeaa laskostumista, disulfidisillan muodostumista ja glykosylaatiota varten, mutta pyrkivät sen jälkeen solunsisäiseen proteiinikertymään, jotta vältetään halutun tuotteen hajoaminen solunulkoisten proteaasien vaikutuksesta. Eräässä tällaisessa strategiassa käytetään kantajina hydrofobiineja, joihin on kiinnitetty ER:n pidätyssignaali. Nämä fuusioproteiinit kasaantuvat itsestään mikkelimäisiksi rakenteiksi, ja ne voidaan puhdistaa käyttämällä pinta-aktiiviseen aineeseen perustuvaa vesipohjaista kaksifaasijärjestelmää. Toinen strategia proteiinien kohdentamiseksi ER:ään käyttää maissin varastoproteiinista peräisin olevaa γ-zeiinipeptidiä (ZERA). Vastaavasti nämä itsekokoavat fuusioproteiinit muodostavat ER-kalvon ympäröimiä proteiinikappaleita, jotka suojaavat niitä proteolyysiltä . Sienten kehittäminen nisäkäsproteiinien tehokkaiksi tuotantoisänniksi edellyttää myös fermentointiliemessä usein esiintyvien proteaasien inaktivointia. Järjestelmällisessä tutkimuksessa tunnistettiin erilaisia erittyviä proteaaseja, jotka liittyvät biolääkkeiden, kuten vasta-aineiden, interferoni α 2b:n ja insuliinin kaltaisen kasvutekijän hajoamiseen, ja useita niistä inaktivoitiin. Tämä johti paitsi proteaasiaktiivisuuden jyrkkään vähenemiseen myös kaikkien kolmen rekombinanttiproteiinin stabiilisuuden voimakkaaseen lisääntymiseen, ja vasta-aineen vaikutus oli voimakkain. Vaikka N-glykosylaatiomallia on jo aiemmin yritetty muokata arvokkaiden terapeuttisten proteiinien tuottamiseksi, aidon ihmisen glykosylaatiomallin luominen sieni-ekspressioisännässä ei näytä tällä hetkellä mahdolliselta. Siksi on kyseenalaista, tuotetaanko tällaisia biolääkkeitä tulevaisuudessa sienisolutehtaissa, varsinkin kun otetaan huomioon CHO-solujen nopea kehitys.

Edellä mainitut hydrofobiinit ovat toinen ryhmä proteiineja, jotka ovat saaneet paljon huomiota pinta-aktiivisten ominaisuuksiensa vuoksi . Nämä pienet solunulkoiset proteiinit kasaantuvat itsestään proteiinikerroksiksi hydrofobisten ja hydrofiilisten rajapinnoilla amfifiilisten ominaisuuksiensa ansiosta ja tekevät hydrofobisista pinnoista kostutettavia tai hydrofiilisistä pinnoista hydrofobisia. Niillä on laaja potentiaali elintarvike- ja lääketieteellisissä sovelluksissa hydrofobisten materiaalien dispergoimiseksi, vaahtojen stabiloimiseksi tai erilaisten molekyylien kohdistamiseksi pinnoille . Cerato-plataniinit ovat toinen ryhmä pieniä, erittyviä proteiineja, joissa on neljä konservoitunutta kysteiiniä. Ne sitoutuvat kitiiniin ja N-asetyyliglukosamiinioligosakkarideihin, ja niillä on itsekokoonpano-ominaisuuksia hydrofobisten ja hydrofiilisten rajapinnoilla. Toisin kuin hydrofobiinit, serato-plataniinit pikemminkin parantavat pintojen napaisuus-/apolarisuusominaisuuksia. Eri CAZymeissä esiintyvillä CBM:illä katsotaan olevan myös kohdentamistehtävä. Ne voivat parantaa sen katalyyttisen domeenin hydrolyyttistä aktiivisuutta, johon ne ovat kiinnittyneet, ja johtaa suotuisampaan pH- ja lämpötilaoptimaaliin . Niiden hiilihydraatteja sitovia ominaisuuksia voidaan lisäksi hyödyntää fuusioproteiinien affiniteettipuhdistuksessa esimerkiksi selluloosapylväiden avulla.

Trichoderma reesei for consolidated bioprocessing and whole cell catalysis

Consolidated bioprocessing (CBP) ymmärretään klassisesti selluloosaetanolin tuotantoprosessin sellulolyyttisen entsyymin tuotannon, entsymaattisen hydrolyysin ja fermentaatiovaiheiden integroimiseksi yhdeksi yksikkötoiminnoksi. Siksi olisi toivottavaa, että olisi yksi ainoa organismi, jolla on hyvät sellulolyyttiset ominaisuudet ja tehokas etanolin käymisreitti. Kuitenkin myös mikrobikonsortioiden käyttöön on kiinnitetty jonkin verran huomiota. Valitettavasti tällä hetkellä ei ole saatavilla yhtään yksittäistä organismia, joka täyttäisi molemmat vaatimukset (kuva 2). Tämän vuoksi on pyritty kehittämään etanologeja sellulolyyttisiksi tai sellulolyyttisiä organismeja etanologisiksi. Ensimmäisen skenaarion yhteydessä T. reesei on usein toiminut CAZyme-geenien luovuttajana, erityisesti sen kahta endoglukanaasia koodaavien cel5a:n ja cel7b:n sekä kahden sellobiohydrolaasin, cel6a:n ja cel7a:n, osalta (taulukko 1). Kaikissa julkaistuissa tutkimuksissa S. cerevisiaen suhteellisen alhainen erityskapasiteetti rajoitti erittyvien tai kalvoankkuroituneiden heterologisten CAZyymien substraattimuunnosta. Näin ollen korkeat etanolisadot realistisilla selluloosapohjaisilla substraateilla edellyttivät täydentämistä kaupallisilla T. reesei -entsyymikoktaileilla. Vaikka parhaillaan pyritäänkin parantamaan muokattujen S. cerevisiae -kantojen erittymis- ja pintanäyttökapasiteettia, tällä hetkellä saatavilla olevilla sellulaasia näyttävillä kannoilla on jo potentiaalia vähentää huomattavasti biomassan sakkarointiin tarvittavia entsyymikuormituksia. Toisen skenaarion yhteydessä T. reesei itsessään on lupaava kohdeorganismi. Vaikka tällä sienellä on luonnostaan kyky metaboloida kaikki biomassaan liittyvät sokerit ja muuntaa ne etanoliksi, saannot ovat kuitenkin alhaiset ja etikkahappoa muodostuu ei-toivottuna sivutuotteena. Toisaalta T. reesei -sienen laajamittaiset fermentointijärjestelmät ovat vakiintuneet hyvin, koska sitä käytetään laajalti kaupallisessa entsyymituotannossa, ja myös sen geenitekniikan molekulaariset välineet ovat hyvin kehittyneitä. Yksi jäljellä olevista suurista haasteista T. reesei -organismin käyttämisessä CBP-organismina on se, että useat sen sellulaasit ja glykolyyttiset geenit tukahdutetaan hypoksiassa, mikä on välttämätöntä etanolin tuotannossa. Lisäksi sellulaasien transkriptiorepressio etanolin läsnä ollessa on vielä yksi haaste, joka on ratkaistava. Sellulaasia liikaa tuottavalla RUT-C30-kannalla on kuitenkin suurempi etanolin sietokyky kuin Natick-linjan QM9414-kannalla , ja se on siksi täydellinen alustakanta T. reesei -organismin kehittämiseksi CBP-organismiksi, varsinkin kun se on myös hiilikataboliittirepressiivinen . Lisäksi lignoselluloosamassan läsnä ollessa RUT-C30:llä on fermentaation alkuvaiheessa pelletin kaltainen morfologia, joka voidaan saavuttaa kasvusta riippumattomalla tavalla lisäämällä pinta-aktiivista ainetta Triton X-100 ja joka johtaa myös suurempaan entsyymituotantoon . Tämä on tärkeää, koska huono sekoitettavuus ja filamenttisen kasvun aiheuttamat alhaiset solujen maksimitiheydet ovat tähän asti haitanneet T. reesei -organismin käyttöä CBP-organismina. Yleisemmin ottaen konsolidoitua bioprosessointia voitaisiin käyttää kuvaamaan myös muita integroituja prosesseja, joissa substraatti ei välttämättä ole lignoselluloosabiomassa vaan jokin muu biopolymeeri, kuten kitiini tai tärkkelys, ja tuote ei ole etanoli vaan jokin muu aineenvaihduntatuote . Tätä varten on tehty useita viimeaikaisia tutkimuksia, joissa on pyritty tuottamaan liikaa erilaisia aineenvaihduntatuotteita T. reesei -kasvintuhoojan avulla (taulukko 2). Saavutetut tuotokset olivat kuitenkin useimmissa tapauksissa kaukana kaupallistamisesta, joten ne vaativat lisäoptimointia.

Radarikaavio, joka osoittaa erilaisten sieni- ja bakteeriorganismien potentiaalin CBP-organismeina. Tiedot koottiin eri katsauksista ja alkuperäisjulkaisuista . Viisi biomassan sokeria ovat heksoosit glukoosi, mannoosi ja galaktoosi sekä pentoosit ksyloosi ja arabinoosi

Työkaluja solujen suunnitteluun ja insinöörityöhön

Vaikka kaksi kattavaa katsausta T. reesei:n ja muiden Trichoderma-lajien molekulaarisesta työkalupakista on annettu vasta hiljattain , haluamme päivittää nämä katsaukset alan viimeisimmillä saavutuksilla. Kohdennettu kantatekniikka sellulaasituotannon parantamiseksi tai aineenvaihduntatekniikan kehittämiseksi edellyttää tehokkaita menetelmiä, joilla organismeihin voidaan tehdä kohdennettuja geneettisiä muutoksia. Geenien kohdentamisen yleisesti alhainen tehokkuus on jo pitkään ollut suuri haaste kohtuullisen määrän transformanttien saamiseksi deleetio- tai ekspressiokasetin homologisella integroinnilla. Ongelma on ratkaistu pääasiassa inaktivoimalla DNA:n korjauksen non-homologous end joining (NHEJ) -reitin komponentteja, kuten tku70 tai tmus53 . Tku70:n poistamat kannat osoittavat parempaa geenin kohdentumista, vaikka homologisen integroitumisen tehokkuus näissä kannoissa voi edelleen vaihdella kohteena olevasta lokuksesta riippuen ja voi siten pudota 30 prosenttiin. Tämän parannuksen perusteella kehitettiin useita uusia lähestymistapoja ekspressiokasettien lisäämiseksi määritellylle genomialueelle, jolloin vältetään niiden satunnaisen integroinnin aiheuttamat pleiotrooppiset vaikutukset. Jorgensen ym. kehittivät tku70-taustaa käyttäen ekspressioalustan, jossa käytetään helposti seulottavaa ade2-lokusta ensisijaisena integrointikohtana. Kun ekspressiokasetti integroidaan tähän lokukseen, ade2 tuhoutuu, ja tuloksena syntyvät transformantit saavat selvän punaisen pigmentaation. Toisessa tutkimuksessa valittiin pyr4- ja asl1-lokukset, jotta saatiin kehitettyä kanta, jolla on uridiini- ja l-arginiiniauxotrofia ja joka mahdollistaa integroinnin näihin kohtiin. Ouaedraogo et al. noudattivat erilaista strategiaa ja ekspressoivat S. cerevisiaen I-SceI-meganukleaasia T. reeseissä. I-SceI synnyttää keinotekoisia kaksoissidekatkoksia I-SceI-tunnistuskohdassa, joka oli tuotu etukäteen ennalta määritellylle lokukselle, ja paransi sekä transformaation että homologisen integraation tehokkuutta. Jatkotutkimuksessa I-SceI:n välittämät kaksoissäiekatkot yhdistettiin tku70-deleetioon. Tässä tapauksessa kyvyttömyys korjata kaksoisjuostekatkoksia NHEJ:n avulla suosii kasetin integroitumista, mikä johtaa jopa 100 prosentin homologiseen rekombinaatiotehokkuuteen. Geenitekniikan tai genomin muokkauksen vallankumous otettiin käyttöön CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9-järjestelmällä . Järjestelmää testattiin ensimmäisen kerran filamenttisienillä T. reesei -kasvintuhoojalla, mikä korostaa sekä tällaisen tekniikan tarpeellisuutta että sen kasvavaa merkitystä entsyymien tuottajana. Se aiheuttaa spesifisiä DNA:n kaksoisjuostekatkoksia geenin kohdentamisen stimuloimiseksi ja on riippuvainen ainoastaan Cas9 (CRISPR-assosioituneesta) nukleaasista, joka käyttää kohdentamiseen yhtä kimeeristä opas-RNA:ta. Tämän RNA-ohjatun Cas9:n tarkka kohdentaminen tiettyyn DNA-sekvenssiin saavutetaan ohjaavan RNA:n protospacer-sekvenssin avulla yksinkertaisen emäsparin avulla. Käyttämällä 200 bp:n pituisia ylös- ja alaspäin suuntautuvia alueita geenin deleetio-konstruktiolle voitiin saavuttaa yli 90 %:n HR-taajuus. Kaksoisdeleetioita esiintyi 45 prosenttia ja kolmoisdeleetioita 4 prosenttia yhden transformaatiokierroksen jälkeen. Vaikka tässä tutkimuksessa in vitro transkriptoidut opas-RNA:t cotransformoitiin deletiointikasetin kanssa Cas9-entsyymiä ilmentävään T. reesei -bakteeriin, Nødvig et al. käyttivät kahta flankoivaa ribotsyymisekvenssiä vapauttaakseen opas-RNA:ita suuremmasta transkriptistä, joka koodaa myös Cas9-entsyymiä erilaisissa Aspergilloissa. Toinen olennainen työkalu, jota tarvitaan sekä yhdistelmäproteiinien ilmentämisessä että kannanmuokkauksessa, ovat promoottorit, jotka mahdollistavat geenien hallittavan ilmentymisen. Vaikka saatavilla on useita indusoituvia ja repressoituvia promoottoreita, joilla on erilaisia sellulaasin promoottorialueita, niillä on yleensä haittapuolia, koska niiden ilmentyminen on sidoksissa isännän aineenvaihduntaan ja aktivaattorit saattavat olla rajoittavia promoottorin titrausvaikutusten vuoksi. Hyödyllisiä vaihtoehtoja ovat esimerkiksi joukko l-metioniinilla repressoitavia T. reesei -geenejä, joilla on erilainen perusekspression voimakkuus . Osoitettiin, että yksi näistä promoottoreista voi ohjata eri reportterigeenien repressiivistä ilmentymistä useilla hiililähteillä, kuten vehnän oljilla. Samankaltaisessa tutkimuksessa T. reesei -organismin kuparipermeaasigeenin promoottoria käytettiin kontrolloimaan tärkeimmän sellulaasi- ja hemisellulaasiregulaattorin xyr1:n ilmentymistä ilman kuparia . Ottaen kuitenkin huomioon, että AA-perheen 9 kuparia sisältävät entsyymit ovat tärkeitä komponentteja T. reesei -sellulaasiseoksessa , on kuitenkin kyseenalaista, voidaanko tätä järjestelmää soveltaa sellulaasituotannon skenaariossa.

Näiden jännittävien molekulaaristen välineiden lisäksi on nyt käytettävissä myös joitakin vanhempia klassisen genetiikan temppuja. T. reesei -kannan kehittämistä haittasi pitkään se, että sienen ajateltiin olevan suvuton, mikä esti kantojen risteytymisen. Virstanpylväs tässä suhteessa oli havainto, että QM6a:lla on MAT1-2-pariutumistyyppilokus ja että se voidaan helposti risteyttää tiettyjen MAT1-1 T. reesei -villi-isolaattien kanssa. Mutta kun QM6a:n MAT1-2-lokus korvattiin sen MAT1-1-vastineella, alkuperäisen MAT1-2 QM6a-kannan ja alkuperäisen MAT1-2 QM6a-kannan välille ei muodostunut stroomia. Näin ollen QM6a:sta johdettujen erilaisten akateemisten ja teollisten T. reesei -kantojen parittelua ei voitu hyödyntää kantojen kehittämisessä. Systeemibiologisen lähestymistavan avulla tunnistettiin, että puuttuva geeni, joka on vastuussa naarassteriliteetistä, oli ham5 . N. crassassa ham-5 koodaa proteiinia, joka toimii MAP-kinaasitelineenä solufuusion aikana. Toimivan ham5:n palauttaminen palauttaa stromatan muodostumisen kannassa QM6a ja mahdollistaa naarashedelmällisyyden palauttamisen muissa QM6a-taustoista peräisin olevissa kannoissa . Tämä havainto on erityisen tärkeä, koska risteyttäminen edellä mainittujen H. jecorina -isolaattien kanssa voi johtaa segmentaalisesti aneuploidisiin jälkeläisiin . Tämän välineen avulla luodaan perusta merkityksellisten mutaatioiden tunnistamiselle, jotka johtavat esimerkiksi sellulaasin ylituotantoon. Tämä on tärkeää, koska perinteiset komplementointimenetelmät mutanttifenotyyppejä aiheuttavien geenien tunnistamiseksi eivät ole onnistuneet juurikaan T. reesei -lajin kaltaisissa lajeissa. Vaikka korkean läpimenon sekvensoinnilla ja vertailevalla genomianalyysillä voidaan helposti tunnistaa mutaatioita sellulaasin hyper- ja nollatuottajien QM6a-kantalinjassa, vain muutamissa tapauksissa tämä on jo johtanut mutaation yhdistämiseen tiettyyn fenotyyppiin. Mutta tapauksissa, joissa mutaatioita löydettiin suuri määrä tai mutaatiot vaikuttivat geeneihin, joiden funktio on tuntematon, vertaileva sekvenssianalyysi ei paljastanut haluttujen kohdegeenien luonnetta . Useat tutkijat ovatkin soveltaneet menestyksekkäästi massasegregaattianalyysiä yhdessä seuraavan sukupolven sekvensoinnin kanssa asiaankuuluvien mutaatioiden tunnistamiseksi. Tässä lähestymistavassa mutantti risteytetään referenssikannan kanssa ja haluttua fenotyyppiä osoittavien segregantien genominen DNA yhdistetään ja sekvensoidaan. Tämän sekvensoidun DNA-poolin genomivertailu vanhempien kantojen genomiin voi sitten paljastaa fenotyypin kannalta merkityksellisiä konservoituneita mutaatioita. Mutaatiot, jotka eivät liity fenotyyppiin, ovat aliedustettuina. Vaikka ei voida olettaa, että tämä lähestymistapa johtaa yksittäisen mutaation tunnistamiseen, koska merkityksellisen mutaation lähellä olevat mutaatiot ovat tavallisesti rinnakkaisia, jatkotutkimuskohteiden määrä vähenee huomattavasti.