Alai

Koronavirukset ovat aiheuttaneet kahtena viime vuosikymmenenä kaksi laajamittaista pandemiaa, SARSin ja Lähi-idän hengitystieoireyhtymän (MERS)8,9. Yleisesti on ajateltu, että SARSr-CoV – jota esiintyy pääasiassa lepakoissa – voisi aiheuttaa tulevan taudinpurkauksen10,11. Tässä raportoimme sarjasta tapauksia, jotka aiheutuivat tuntemattomasta keuhkokuumeen taudinpurkauksesta Wuhanissa, Hubein maakunnassa, Keski-Kiinassa. Tämä taudinpurkaus, joka sai alkunsa paikallisilta äyriäismarkkinoilta, on kasvanut huomattavasti ja tartuttanut Kiinassa 2 761 ihmistä, siihen liittyy 80 kuolemantapausta ja se on johtanut 33 ihmisen tartuntaan 10 muussa maassa 26. tammikuuta 202012 mennessä. Näiden potilaiden tyypillisiä kliinisiä oireita ovat kuume, kuiva yskä, hengitysvaikeudet (hengenahdistus), päänsärky ja keuhkokuume. Taudin puhkeaminen voi johtaa etenevään hengitysvajaukseen keuhkorakkuloiden vaurioitumisen vuoksi (kuten rintakehän tietokonetomografiakuvissa havaitaan) ja jopa kuolemaan. Kliiniset lääkärit päättelivät taudin johtuvan viruksen aiheuttamasta keuhkokuumeesta kliinisten oireiden ja muiden kriteerien perusteella, joita olivat muun muassa ruumiinlämmön nousu, lymfosyyttien ja valkosolujen määrän väheneminen (vaikkakin jälkimmäisten pitoisuudet olivat toisinaan normaalit), uudet keuhkoinfiltraatit rintakehän röntgenkuvassa ja se, ettei tauti ollut selvästi parantunut antibioottihoidon jälkeen kolmen päivän ajan. Vaikuttaa siltä, että suurin osa ensimmäisistä tapauksista oli ollut kosketuksissa alkuperäisten äyriäismarkkinoiden kanssa; tauti on kuitenkin nyt edennyt siten, että se on tarttunut ihmisten välisestä kosketuksesta.

Näytteet seitsemästä vakavaa keuhkokuumetta sairastavasta potilaasta (joista kuusi oli myyjiä tai tavarantoimittajia äyriäismarkkinoilta), jotka otettiin Wuhan Jin Yin-Tan -sairaalan teho-osastolle taudinpurkauksen alussa, lähetettiin Wuhanin virologian instituutin (WIV) laboratorioon aiheuttavan taudinaiheuttajan diagnosoimiseksi (laajennettu taulukko 1). CoV:tä tutkivana laboratoriona käytimme ensin pan-CoV:n PCR-alkuaineita näiden näytteiden testaamiseen13 , koska taudinpurkaus tapahtui talvella ja torilla – samassa ympäristössä kuin SARS-infektiot. Löysimme viisi näytettä, jotka olivat PCR-positiivisia CoV:lle. Yksi näyte (WIV04), joka oli kerätty bronkoalveolaarisesta huuhtelunesteestä (BALF), analysoitiin metagenomiikan analyysillä seuraavan sukupolven sekvensoinnin avulla mahdollisten etiologisten tekijöiden tunnistamiseksi. Kokonaislukumäärästä 10 038 758, josta 1 582 kokonaislukumäärää jäi jäljelle sen jälkeen, kun ihmisen genomista peräisin olevat lukumäärät oli suodatettu, 1 378 (87,1 %) sekvenssiä vastasi SARSr-CoV:n sekvenssiä (kuva 1a). De-novo-kokoonpanon ja kohdennetun PCR:n avulla saatiin 29 891-vaasiparin CoV-genomi, joka oli 79,6-prosenttisesti identtinen SARS-CoV BJ01:n kanssa (GenBankin liittymisnumero AY278488.2). Korkea genomin kattavuus saavutettiin uudelleenkartoittamalla kokonaislukemat tähän genomiin (laajennetut tiedot, kuva 1). Tämä sekvenssi on toimitettu GISAIDiin (https://www.gisaid.org/) (liittymisnumero EPI_ISL_402124). Maailman terveysjärjestön (WHO) antaman nimen mukaisesti kutsumme sitä alustavasti nimellä novel coronavirus 2019 (2019-nCoV). Neljä muuta 2019-nCoV:n täyspitkää genomisekvenssiä (WIV02, WIV05, WIV06 ja WIV07) (GISAID-tunnistenumerot EPI_ISL_402127-402130), jotka olivat yli 99,9-prosenttisesti identtisiä keskenään, saatiin sittemmin neljältä muulta potilaalta seuraavan sukupolven sekvensoinnilla ja PCR:llä (Laajennettu datataulukko 2).

Viruksen genomi koostuu kuudesta tärkeimmästä avoimesta lukukehyksestä (ORF), jotka ovat yhteisiä koronaviruksille, ja useista muista liitännäisgeeneistä (kuva 1b). Tarkempi analyysi osoittaa, että joillakin 2019-nCoV:n geeneillä oli alle 80 prosentin nukleotidisekvenssi-identiteetti SARS-CoV:n kanssa. ORF1ab:n seitsemän konservoidun replikaasidomeenin aminohapposekvenssit, joita käytettiin CoV-lajien luokittelussa, olivat kuitenkin 94,4-prosenttisesti identtiset 2019-nCoV:n ja SARS-CoV:n välillä, mikä viittaa siihen, että nämä kaksi virusta kuuluvat samaan lajiin, SARSr-CoV:hen.

Havaitsimme sitten, että lepakon koronaviruksen (BatCoV RaTG13) RNA-riippuvaisen RNA-polymeraasin (RdRp) lyhyellä alueella – joka oli aiemmin havaittu Yunnanin maakunnasta peräisin olevassa Rhinolophus affinis -viruksessa – oli suuri sekvenssi-identiteetti 2019-nCoV:n kanssa. Suoritimme täyden pituuden sekvensoinnin tästä RNA-näytteestä (GISAID-tunnistenumero EPI_ISL_402131). Simplot-analyysi osoitti, että 2019-nCoV oli erittäin samankaltainen koko genomissa RaTG13:n kanssa (kuva 1c), ja genomin sekvenssin kokonaisidentiteetti oli 96,2 %. Kun käytettiin 2019-nCoV:n, RaTG13:n, SARS-CoV:n ja aiemmin raportoitujen lepakoiden SARSr-CoV:ien linjattuja genomisekvenssejä, 2019-nCoV:n genomissa ei havaittu merkkejä rekombinaatiotapahtumista. Täyspitkän genomin sekä RdRp:n ja piikin (S) geenisekvenssien fylogeneettinen analyysi osoitti, että – kaikkien sekvenssien osalta – RaTG13 on 2019-nCoV:n lähin sukulainen, ja ne muodostavat muista SARSr-CoV:ista erillisen sukulinjan (kuva 1d ja laajennettu data kuva 2). S-geenin koodaama reseptoria sitova piikkiproteiini poikkesi suuresti muista CoV:istä (laajennetut tiedot, kuva 2), ja sen nukleotidisekvenssi oli alle 75-prosenttisesti identtinen kaikkien aiemmin kuvattujen SARSr-CoV:ien kanssa lukuun ottamatta 93,1-prosenttista nukleotidisekvenssi-identtisyyttä RaTG13:n kanssa (laajennetut tiedot, taulukko 3). 2019-nCoV:n ja RaTG13:n S-geenit ovat pidempiä kuin muiden SARSr-CoV:ien. Suurimmat erot 2019-nCoV:n S-geenin sekvenssissä ovat kolme lyhyttä insertiontia N-terminaalisessa domeenissa sekä muutokset neljässä viidestä reseptoria sitovan motiivin avainjäännöksestä verrattuna SARS-CoV:n sekvenssiin (laajennetut tiedot, kuva 3). On tutkittava tarkemmin, antavatko 2019-nCoV:n S-proteiinin N-terminaalisen domeenin insertiot sialiinihappoa sitovan aktiivisuuden, kuten MERS-CoV:ssä. Läheinen fylogeneettinen sukulaisuus RaTG13:een antaa viitteitä siitä, että 2019-nCoV on saattanut olla peräisin lepakoista.

Kehitimme nopeasti qPCR-pohjaisen osoitusmenetelmän S-geenin reseptoria sitovan domeenin sekvenssin perusteella, joka oli genomin vaihtelevin alue (kuva 1c). Tietomme osoittavat, että alukkeet pystyivät erottamaan 2019-nCoV:n kaikista muista ihmisen koronaviruksista, mukaan lukien lepakon SARSr-CoV WIV1, joka on 95-prosenttisesti identtinen SARS-CoV:n kanssa (laajennetut tiedot Kuva 4a, b). Seitsemältä potilaalta saaduista näytteistä havaitsimme, että kuusi BALF-näytettä ja viisi suun pyyhkäisynäytettä olivat positiivisia 2019-nCoV:lle ensimmäisen näytteenoton aikana qPCR:llä ja perinteisellä PCR:llä arvioituna. Emme kuitenkaan enää pystyneet havaitsemaan viruspositiivisia näytteitä näiltä potilailta toisen näytteenoton aikana otetuissa suunäytteissä, peräaukonäytteissä ja verinäytteissä (kuva 2a). Suosittelemme kuitenkin, että vuoden 2019-nCoV:n rutiininomaisessa havaitsemisessa käytetään muita qPCR-kohteita, kuten RdRp- tai kuorigeenejä (E). Näiden löydösten perusteella ehdotamme, että tauti voisi tarttua ilmateitse, vaikkakaan emme voi sulkea pois muita mahdollisia tartuntareittejä, sillä lisätutkimukset, mukaan lukien useammat potilaat, ovat tarpeen.

2019-nCoV:n serologiseen havaitsemiseen käytimme aiemmin kehitettyä lepakon SARSr-CoV Rp3:sta peräisin olevaa nukleokapsidiproteiinia (N-proteiinia) IgG- ja IgM-entsyymi-immunosorbenttimäärityksissä (ELISA) käytettävänä antigeeninä, koska tällä proteiinilla oli 92 %:n aminohappoidentiteetti 2019-nCoV:n N-proteiiniin nähden (laajennettu data Fig. 5) eikä osoittanut ristireaktiivisuutta muita ihmisen koronaviruksia vastaan SARSr-CoV7:ää lukuun ottamatta. Pystyimme saamaan vain viisi seeruminäytettä niistä seitsemästä potilaasta, joilla oli virusinfektio. Seurasimme yhden potilaan (ICU-06) virusvasta-ainepitoisuuksia 7, 8, 9 ja 18 päivää taudin puhkeamisen jälkeen (laajennetut tiedot, taulukko 2). IgG- ja IgM-tiittereissä havaittiin selkeä suuntaus, joka kasvoi ajan myötä, paitsi että IgM-tiitteri laski viimeisessä näytteessä (kuva 2b). Toisena analyysinä testasimme viidestä seitsemästä viruspositiivisesta potilaasta otetut näytteet noin 20 päivää taudin puhkeamisen jälkeen virusvasta-aineiden esiintymisen varalta (laajennetut tietotaulukot 1, 2). Kaikki potilasnäytteet – mutta eivät terveiden henkilöiden näytteet – olivat vahvasti positiivisia viruksen IgG:n suhteen (kuva 2b). Lisäksi oli kolme IgM-positiivista näytettä, mikä viittaa akuuttiin infektioon.

Seuraavaksi eristimme viruksen (nimeltään 2019-nCoV BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019) onnistuneesti sekä Vero E6- että Huh7-soluista käyttäen potilaan ICU-06 BALF-näytettä. Soluissa havaittiin selkeitä sytopatogeenisia vaikutuksia kolmen päivän inkuboinnin jälkeen (laajennetut tiedot Kuva 6a, b). WIV04-kannan identiteetti varmistettiin Vero E6 -soluissa immunofluoresenssimikroskopialla käyttäen ristireaktiivista viruksen N-vasta-ainetta (laajennetut tiedot, kuvat 6c, d) ja metagenomiikan sekvensoinnilla, jonka lukemista suurin osa karttui 2019-nCoV:lle, ja qPCR-analyysi osoitti, että viruskuorma kasvoi päivästä 1 päivään 3 (laajennetut tiedot, kuvat 6e, f). Virushiukkaset infektoituneiden solujen ultrasäteisleikkeissä osoittivat tyypillistä koronaviruksen morfologiaa, kuten elektronimikroskopialla visualisoitiin (laajennetut tiedot, kuva 6g). Vahvistaaksemme edelleen viruksen IgG-positiivisten näytteiden neutralointiaktiivisuuden suoritimme seerumin neutralointimäärityksiä Vero E6 -soluissa käyttäen viittä IgG-positiivista potilasseerumia. Osoitamme, että kaikki näytteet pystyivät neutraloimaan 100 TCID50 (50 % kudosviljelyssä infektiivinen annos) 2019-nCoV:tä laimennoksella 1:40-1:80. Osoitamme myös, että tämä virus voitiin neutraloida ristiin hevosen anti-SARS-CoV-seerumilla (lahja L.-F. Wangilta) laimennoksilla 1:40; mahdollinen ristireaktiivisuus SARS-CoV-vasta-aineiden kanssa on kuitenkin vahvistettava ihmisten anti-SARS-CoV-seerumilla (laajennettu datataulukko 4).

ACE2:n tiedetään olevan SARS-CoV14:n solureseptori. Määrittääksemme, käyttääkö 2019-nCoV myös ACE2:ta soluun pääsyn reseptorina, teimme viruksen infektiivisyystutkimuksia käyttäen HeLa-soluja, jotka ekspressoivat tai eivät ekspressoineet ACE2-proteiineja ihmisistä, kiinanhevoslepakoista, civeteistä, sioista ja hiiristä. Osoitamme, että 2019-nCoV pystyy käyttämään kaikkia ACE2-proteiineja, hiiren ACE2:ta lukuun ottamatta, sisääntuloreseptorina päästäkseen ACE2:ta ilmentäviin soluihin, mutta ei soluihin, jotka eivät ilmentäneet ACE2:ta, mikä osoittaa, että ACE2 on luultavasti solureseptori, jonka kautta 2019-nCoV pääsee soluihin (kuva 3). Osoitamme myös, että 2019-nCoV ei käytä muita koronaviruksen reseptoreita, kuten aminopeptidaasi N:ää (APN) ja dipeptidyylipeptidaasi 4:ää (DPP4) (Laajennettu data Kuva 7).

Tutkimuksessa esitetään yksityiskohtainen raportti 2019-nCoV:stä, joka on todennäköinen etiologinen aiheuttaja Kiinassa ja muissa maissa meneillään olevasta akuutin hengitystieoireyhtymän epidemiasta. Kaikilla testatuilla potilailla havaittiin virusspesifinen nukleotidipositiivinen ja virusproteiinien serokonversio, ja se antaa näyttöä taudin ja tämän viruksen esiintymisen välisestä yhteydestä. On kuitenkin vielä monia kiireellisiä kysymyksiä, joihin ei ole vielä saatu vastausta. Yhteyttä 2019-nCoV:n ja taudin välillä ei ole varmistettu eläinkokeilla, jotta Kochin postulaatit täyttyisivät mikro-organismin ja taudin välisen syy-yhteyden määrittämiseksi. Emme vielä tiedä tämän viruksen siirtymisrutiinia isäntien välillä. Näyttää siltä, että viruksen tarttuvuus ihmisten välillä on lisääntymässä. Meidän olisi seurattava tarkasti, kehittyykö virus edelleen virulentimmaksi. Koska erityishoitoja ei ole riittävästi ja koska 2019-nCoV on sukua SARS-CoV:lle, joitakin SARS-CoV:n vastaisia lääkkeitä ja esikliinisiä rokotteita voitaisiin todennäköisesti käyttää tämän viruksen hoitoon. Kun otetaan huomioon SARSr-CoV:n laaja leviäminen niiden luonnollisissa varastoissa, tulevassa tutkimuksessa olisi keskityttävä näiden virusten aktiiviseen seurantaan laajemmilla maantieteellisillä alueilla. Pitkällä aikavälillä olisi valmistettava laajakirjoisia viruslääkkeitä ja rokotteita tämän virusryhmän aiheuttamia uusia tartuntatauteja varten tulevaisuudessa. Kaikkein tärkeintä on, että luonnonvaraisten eläinten kesyttämistä ja kuluttamista koskevia tiukkoja säännöksiä olisi pantava täytäntöön.

Huomautus lisätty oikovedoksessa: Tämän artikkelin hyväksymisen jälkeen ICTV on nimennyt viruksen SARS-CoV-215:ksi; lisäksi WHO on julkaissut virallisen nimen tämän viruksen aiheuttamalle taudille, joka on COVID-1916.