Alai

Abstract

Rheumatoid arthritis (RA) on autoimmuunisairaus. Ampiaismyrkky (WV), jota pidetään perinteisenä kansanlääkkeenä Jingpo-kansallisuudessa Yunnanissa, Kiinassa, lievittää nivelreumaa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia ampiaismyrkyn vaikutusta nivelreuman oireita lievittävään vaikutukseen kokeellisilla rotilla. Perustimme tyypin II kollageenin (CII) aiheuttaman niveltulehduksen (CIA) mallin SD-rotilla ja tutkimme tulehduksen ja autoimmuunivasteen estämistä. WV:n niveltulehdusta ehkäiseviä vaikutuksia arvioitiin tassun turvotuksen avulla, ja sairastuneen tassun histopatologinen pistemäärä ja histopatologiset muutokset arvioitiin. Tulehduksenvastaisia vaikutuksia arvioitiin IL-6-, TNF-α- ja IL-1β-tasoilla sekä tulehdussolujen määrällä perifeerisessä veressä. T-solujen alaryhmäsuhteen muutos rottien pernassa havaittiin virtaussytometrialla, ja samalla arvioitiin viskeraalinen indeksi ja immuuniseerumin globuliinitasot. Tulokset osoittivat, että WV:n eri annokset (0,125, 0,25 ja 0,5 mg/kg) lievittivät merkittävästi käpälän turvotusta ja niveltulehduspistemäärää CIA-rotilla hoitamattomaan kontrolliin verrattuna (). WV (0,25 ja 0,5 mg/kg) lievitti nilkkanivelten nivelkudosvaurioita ja histopatologisia pistemääriä synovioyyttihyperplasian ja tulehdussolujen infiltraation osalta ajoneuvoryhmään verrattuna (). Immunologisen säätelyn osalta 0,5 mg/kg WV alensi immunologisia seerumin globuliinipitoisuuksia (), ja lisäksi havaitsimme, että WV (0,5 mg/kg) tukahdutti Th-solujen immuunivastetta ja paransi samalla Tc-solujen ja Treg-solujen toimintaa pernan soluissa selvästi (). WV:n immunosuppressiivinen vaikutus oli analoginen sen IL-1β-, TNF-α-, IL-8-, IL-6-, COX-2- ja PGE2-tasoja rottien seerumissa estävän vaikutuksen kanssa. Yhteenvetona voidaan todeta, että nämä havainnot osoittivat, että WV:llä oli nivelrikkoa ehkäisevää vaikutusta, joka saattaa liittyä niiden immunoregulaatiota estäviin vaikutuksiin ja anti-inflammatoriseen vaikutukseen.

1. Johdanto

Nivelreuma (RA) on krooninen autoimmuunisairaus, joka voi edetä systeemisiin komplikaatioihin, fyysisiin vammoihin ja jopa varhaiseen kuolemaan . Nivelkalvosolujen liikakasvu, krooninen niveltulehdus sekä ruston ja luun tuhoutuminen ovat RA:n pääpiirteitä. Lisäksi T-solujen, B-solujen ja proinflammatoristen sytokiinien synergistiset vaikutukset ovat avainasemassa patofysiologisessa prosessissa . Kun CD4+ T-solut aktivoituvat, ne tuottavat proinflammatorisia sytokiineja, jotka tehostavat immuunivastetta stimuloimalla muita mononukleaarisia soluja, synoviaalisia fibroblasteja, kondrosyyttejä ja osteoklasteja. Näiden proinflammatoristen sytokiinien, erityisesti TNF-α:n, IL-6:n ja IL-1β:n, vapautuminen voi edistää synoviittia.

Tänään RA:n hoidossa käytettävät kliiniset hoitolääkkeet keskittyvät ensisijaisesti tulehduksen välittäjäaineiden vähentämiseen, kuten steroideihin kuulumattomiin tulehduskipulääkkeisiin (nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAID-lääkkeet), tautia muokkaaviin reumalääkkeisiin (disease-modifying antirheumatic drugs, DMARD-lääkkeet) ja biologisiin aineisiin. Esimerkiksi FDA hyväksyi vuonna 1988 folaattianalogisen metotreksaatin (MTX) NSAID-lääkkeenä RA:n hoitoon. Lisäksi siitä on tullut RA:n hoidossa yleisimmin käytetty lääke sen immunosuppressiivisen vaikutuksen, tulehdusta ehkäisevän vaikutuksen ja alhaisen hinnan vuoksi. MTX ei kuitenkaan ole ihanteellinen terapeuttinen aine sen hermostoon, ruoansulatuskanavaan ja immuunijärjestelmään kohdistuvien ei-toivottujen sivuvaikutusten vuoksi, kuten eivät muutkaan lääkkeet . Siksi yhä useammat ihmiset etsivät uusia vaihtoehtoja näiden lääkkeiden tehottomuuden ja turvallisuuden korjaamiseksi. Perinteisen kiinalaisen lääketieteen (TCM) teoriassa RA:ta pidetään yhtenä nivelkipu-oireyhtymänä (”Bi Zheng” TCM:ssä), jonka mahdollisesti aiheuttavat eksogeeninen tuuli, kosteus ja lämmön tai kylmän patogeenit . TCM: n soveltaminen sairauksien ennaltaehkäisyssä ja hoidossa on useiden vuosisatojen historia, kasvava merkitys RA-hoidossa, joka johtuu sen huomattavasta tehokkuudesta, mutta vähemmän sivuvaikutuksia ja kustannuksia .

Venom-hoito, joka on täydentävä ja vaihtoehtoinen lääketieteen lähestymistapa, on käytetty useiden vuosisatojen ajan kivun, tulehduksen ja niveltulehduksen hoitoon kansanlääketieteessä . Jo Sotaa käyvien valtioiden kaudella Keltaisen keisarin sisäisessä kaanonissa (”Huangdi Neijing” kiinaksi) on merkintä ”mehiläisen pisto on terapeuttinen huolimatta aiheutuneesta myrkyllisestä riskistä”. Nykyaikaisen lääketieteellisen tutkimuksen mukaan mehiläismyrkyllä (BV) on antiartriittisiä, anti-inflammatorisia ja analgeettisia vaikutuksia, jotka johtuvat keskeisen inhibitorisen ja moduloivan immuunijärjestelmän aktivoinnista useiden mekanismien kautta . Useat kliiniset tutkimukset ovat myös osoittaneet, että BV voisi parantaa niveltulehdukseen liittyviä oireita .

Mehiläismyrkky sisältää erilaisia biologisesti aktiivisia ainesosia, kuten biogeenisiä amiineja, suurimolekyylisiä aineita (kuten entsyymejä, allergeeneja ja bioaktiivisia peptidejä) ja polyamiinitoksiineja. Ampiaismyrkyllä on ollut erilaisia farmakologisia vaikutuksia kivun, tulehdussairauksien ja neurodegeneratiivisten sairauksien hoidossa . Vespa magnifica (Smith) on sosiaalinen ampiainen, jota tavataan Yunnanissa, Kiinassa . Sen myrkystä on viime vuosina erotettu monia yhdisteitä, joilla on antikoagulaatio-, verihiutale-, tulehdus- ja immunosuppressiivisia vaikutuksia . Sen huomattavan nivelreumaan kohdistuvan vaikutuksen perusteella siitä on tullut tapa, jota käytetään laajalti kiinalaisessa kansallisessa vähemmistössä Jingpossa . Tietojemme mukaan ampiaismyrkkyjen reumantorjuntatoimista on kuitenkin vain vähän raportteja.

Tässä työssä otettiin käyttöön kollageeni-indusoitu niveltulehdus (CIA) -malli, joka jäljittelee tarkasti RA:n patogeneesiä. Tassun tilavuuden muutoksia on klassisesti käytetty arvioitaessa anti-inflammatorisia vaikutuksia RA:ssa tavalliseen tapaan . Lisäksi arvioimme WV:n (Vespa magnifican ampiaismyrkky) vaikutusta samassa mallissa. Lopuksi WV:n tehoa anti-inflammatoriseen ja immunomodulaatioon havainnoitiin nivelkudoksen H&E-värjäyksellä, pernan T-solujen alaryhmien virtaussytometrialla sekä seerumin IL-1β:n, IL-6:n, TNF-α:n, IL-8:n, COX-2:n, PGE2:n ja reumafaktoreiden ELISA-analyysillä (IgG, IgA ja IgM).

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Tutkimusmenetelmät. Koe-eläimet

Isoiset SD-rotat (60 rottaa, 180-220 g) saatiin Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co., Ltd.:stä. Eläimet sijoitettiin tavallisiin polypropeenihäkkeihin, jotka oli vuorattu raakakuorella (uusittu 48 h kuluttua). Eläinsuojassa pidettiin 12 tunnin valo-/pimeäjakso noin 22 ± 2 °C:n lämpötilassa ja 60-70 %:n suhteellisessa kosteudessa, ja eläimillä oli vapaa pääsy veteen ja vakioruokaan. Rotat jaettiin satunnaisesti 8 kontrolliin ja 52 malliin, minkä jälkeen kunkin kokeen sopeutumiselle annettiin vähintään 7 d aikaa. Kaikki kokeelliset menettelyt suoritettiin laboratorioeläinten hoito- ja käyttöoppaan (National Institutes of Health) mukaisesti, ja Dalin yliopiston eettinen komitea hyväksyi ne.

2.2. CIA:n eläinmalli ja hoitoprotokolla

Kissat desinfioitiin alkoholilla ja injektoitiin ihonalaisesti oikeaan vola pedis, selkään ja häntään 1 mg/ml CCII (kanan tyypin II kollageeni) -emulgaattoria ensimmäistä immunisointia varten, joka koostuu CCII:stä (C9301, Sigma), joka on emulgoitu 1 : 1 epätäydellisellä Freundin adjuvantilla (F5506, Sigma). Induktiopäivä suunniteltiin päiväksi 0. Tehosteannos ruiskutettiin uudelleen vatsaan, selkään ja häntään yhdessä 1 ml:n CCII-emulgaattorin kanssa päivänä 8. Ruiskutettu jalka määriteltiin tulehdusjalaksi, kun taas toinen jalka ilman ruiskutusta merkittiin toissijaiseksi jalaksi. Tämän jälkeen kollageenin aiheuttamaa niveltulehdusta (CIA) sairastavia rottia hoidettiin 14. päivänä, ja hoito lopetettiin 28. päivänä. CIA:n puhkeamisen jälkeen mallirotat jaettiin satunnaisesti viiteen ryhmään kliinisten pisteiden perusteella. Ryhmä I: malliryhmä, joka sai injektiona (1 ml/kg) normaalia suolaliuosta. Ryhmät II-IV: CIA-rotat saivat hypodermisen injektion 0,125, 0,25 ja 0,5 mg/kg WV:tä (ampiaismyrkkyä, joka on peräisin Vespa magnifica (Smith) -kasvintuhoojasta Yunnanista, Kiinasta, ampiaisten pyrstörauhasten eksudaatista valmistettua kylmäkuivattua jauhetta, joka on laimennettu normaalilla keittosuolaliuoksella) hoitoryhmänä. Ryhmä V: positiivinen kontrolliryhmä sai TwHF (Tripterygium wilfordii Hook F, nro 20181001, Huangshi Feiyun Pharmaceutical Co., Ltd.) 9 mg/kg samalla tavalla. Samanaikaisesti kontrolliryhmän normaaleille rotille annettiin sama määrä pelkkää normaalia suolaliuosta. Kaikille edellä mainituille rotille annosteltiin päivittäin 14 päivän ajan.

2.3. Kokeellisen niveltulehduksen perusarviointi

CIA:n vakavuutta arvioitiin säännöllisesti tassun turvotuksen ja niveltulehduspisteiden perusteella. Rotat punnittiin tutkimuspäivinä 0-28, ja nilkkojen paksuus ja ympärysmitta tulehdusjalasta (oikea jalka) ja toissijaisesta jalasta (vasen jalka) mitattiin erikseen vernier-mittatikulla ja mittanauhalla päivinä 0, 14 ja 28. Niveltulehduspisteet arvioitiin kolmen tutkijan riippumattomien havaintojen perusteella. Kumpikin tassu pisteytettiin asteikolla 0-4, mikä tarkoittaa, että molempien takatassun nivelten suurin kokonaispistemäärä oli 8. Arviointikriteerit olivat seuraavat: 0 = ei turvotusta tai mitään visuaalisia muutoksia; 1 = lievä turvotus ja vähäinen eryteema; 2 = lievä turvotus ja eryteema; 3 = selvä turvotus ja merkittävä eryteema; ja 4 = vaikea turvotus ja laaja eryteema . Päivänä 28 eläimet teurastettiin, minkä jälkeen seerumi ja sekundaariset nilkkanivelet kerättiin ja käsiteltiin jatkoanalyysejä varten.

2.4. Nilkkanivelten histopatologia

Vasemmat takaraajat ilman viereisten kudosten karsimista pestiin välittömästi PBS:llä 2-3 kertaa, kiinnitettiin 10 % formaliinilla 48 h ja kalkinpoistettiin 5 %:n typpihapolla 24 h, kunnes luukuorta oli helppo ajaa läpi neulan kärjellä. Näytteet upotettiin parafiinileikkeisiin ja leikattiin viipaleiksi (5 μm) rutiininomaista hematoksyliini-eosiinivärjäystä (H&E) varten. Nivelten patologiset muutokset havaittiin valomikroskoopilla (Olympus, Japani) ja valokuvattiin. Kuvat otettiin 200-kertaisella suurennoksella. Muutokset havaittiin myös synoviosyyttien hyperplasiassa ja tulehdussolujen infiltraatiossa. Histopatologiset muutokset pisteytettiin seuraavilla kriteereillä: 0 = ei havaittavia muutoksia; 1 = lievä; 2 = kohtalainen; 3 = vakava .

2.5. Viskeraindeksin analyysi

Kissat uhrattiin ja täydellinen maksa, perna ja kateenkorva resekoitiin ja ympäröivä rasvakudos ja faskia erotettiin huolellisesti. Maksan, pernan ja kateenkorvan märkäpaino mitattiin elektronisella vaa’alla, ja sisäelinten indeksi (mukaan lukien maksaindeksi, pernaindeksi ja kateenkorvaindeksi) laskettiin seuraavan kaavan mukaisesti. Viskeraindeksi = elimen massa (mg) / kehon massa (g) × 100 %.

2.6. Seerumin biokemiallisten indeksien ELISA-analyysit

Koe-rottien seerumi kerättiin ja TNF-α:n, IL-1β:n, IL-6:n, IL-8:n, COX-2:n ja PGE2:n pitoisuudet havaittiin entsyymi-immunosorbenttimäärityssarjoilla (ELISA) (Nanjing JianCheng, Kiina) valmistajan ohjeiden mukaisesti. ELISA-pakkaukset IgA:n (ERC015), IgG:n (ERC016) ja IgM:n (ERC017) ilmentymistasojen havaitsemiseksi ostettiin NeoBioscience Co., Ltd., Shenzhen, Kiina.

2.7. Niveltulehduksen pernan virtaussytometria

T-solujen alaryhmien määrä havaittiin virtaussytometrialla. Lymfosyytit kerättiin rottien pernan soluista, jotka homogenisoitiin kuljettamalla ne 200 silmäisen nailonseulan läpi. Solut suodatettiin PBS-puskuriin, joka sisälsi 10 % naudan sikiöseerumia. Solupitoisuus säädettiin noin 2 × 106/ml:ksi ja lisättiin 3 ml punasolujen lyysipuskuria (Solarbio, Kiina) punasolujen liuottamiseksi alle 5 minuutiksi. Sitten soluja sentrifugoitiin 1200 rpm 5 minuutin ajan, pestiin kahdesti FBS-PBS-puskurilla, joka sisälsi 10 % naudan sikiöseerumia, ja sentrifugoitiin sitten 1200 rpm 5 minuutin ajan. Jokainen 100 μl solususpensiota sijoitettiin sentrifugiputkiin. Lymfosyytit värjättiin anti-CD3-FITC:llä (nro 557354; BD, USA), anti-CD4-APC:llä (nro 565432; BD, USA), anti-CD8-PerCP:llä (nro 558824; BD, USA) ja anti-CD25-PE:llä (nro 554866; BD, USA). Monoklonaaliset vasta-aineet lisättiin kuhunkin putkeen, sekoitettiin uudelleen ja jätettiin jäähän 30 minuutiksi. FBS-PBS-puskuria (1 ml) lisättiin kuhunkin näyteputkeen ja sentrifugoitiin 1200 rpm:n kierrosnopeudella 5 minuutin ajan, ja supernatantti hylättiin. Edellinen vaihe toistettiin kahdesti, jotta solut, jotka eivät sitoutuneet monoklonaalisiin vasta-aineisiin, eluoitiin kokonaan pois. Koesolut sekoitettiin 500 μl:aan FBS-PBS-puskuria. CD25+/CD4+- ja CD4+/CD8+-T-solujen suhteet määritettiin FACS Canto -virtaussytometrillä (BD, USA) .

2.8. Tilastolliset analyysit

Tiedot analysoitiin tilastollisesti SPSS10.0-ohjelmalla. Tiedot esitettiin keskiarvona ± keskiarvon keskihajonta (S.D.M). Kunkin ryhmän välisten erojen merkitsevyys analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA:lla, jota seurasi Tukey-testi. Erityisesti niveltulehduspisteet ja histopatologiset pisteet analysoitiin Wilcoxonin rank-summatestillä. Arvoja pidettiin tilastollisesti merkitsevinä.

3. Tulokset

3.1. TULOKSET

3. WV lievitti niveltulehduksen oireita CIA-rotilla

Niveltulehduksen oireet saatiin onnistuneesti aikaan rotilla injektoimalla tyypin II kollageenia ohjeiden mukaisesti, mikä ilmeni merkittävinä makroskooppisina merkkeinä vakavasta punoituksesta ja turvotuksesta CIA-rottien toissijaisessa käpälässä ja nilkkanivelessä kuvassa1(a), jos verrattiin terveeseen kontrolliryhmään. Nilkkanivelen paksuus ja ympärysmitta olivat ilmeisesti lisääntyneet ajoneuvoissa 14. päivänä (kuva 1(b)) verrattuna kontrolliryhmiin; ne kuitenkin pienenivät silmiinpistävästi TwHF:n ja kaikkien WV-käsiteltyjen ryhmien jälkeen 28. päivänä verrattuna malliryhmään (kaikki ) (kuva 1(b)). Kun mitattiin nilkkanivelten paksuus ja ympärysmitta sekä tulehdusjalassa että sekundaarijalassa, selvä turvotuksen lasku näkyi tietojen perusteella (kuva 1(b)). Turvotusasteen tulokset osoittivat, että WV pystyi hallitsemaan tassun turvotusta ja lievittämään tassun ja nilkkanivelen sekundaarista tulehdusta, mikä vastaa TwHF-vaikutusta.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Kuva 1

WV:n vaikutus kunkin ryhmän niveloireisiin. (a) Tassujen turvotusaste kaikissa ryhmissä. (b) Nilkkanivelten paksuus ja ympärysmitta sekä tulehdusjalassa että sekundaarisessa jalassa kaikissa ryhmissä. (c) Niveltulehdusarvojen vertailu kaikkien ryhmien välillä.

Niveltulehdusarvot pienenivät lisäksi eriasteisesti WV-hoidon avulla riippuen annoksen määrästä, kuten kuvassa 1(c) on esitetty. Vehikkeliryhmän niveltulehduspisteet olivat 6,5 ± 1,0 päivänä 14 (vs. päivä 0, ). Indeksi laski merkittävästi TwHF:llä hoidetussa ryhmässä päivänä 28, jolloin se oli 2,8 ± 0,8 (verrattuna päivään 14, ). Vastaavasti indeksien lasku WV:llä oli merkittävää ja annosriippuvaista (3,2 ± 0,6 0,5 mg/kg:lla, 4,3 ± 0,7 0,25 mg/kg:lla ja 5,6 ± 0,7 0,125 mg/kg:lla) (vakavasti vs. 14 päivää, ). Tämä osoitti, että WV:n teho 0,5 mg/kg annoksella oli verrannollinen TwHF:llä hoidetun ryhmän tehoon.

3.2. WV lievitti CIA-rottien nivelten patologisia muutoksia

H&E-värjäys (kuva 2(a)) osoitti, että kontrollirottien nilkkanivelten nivelkalvossa oli säännönmukainen solujärjestys, jossa ei ollut lainkaan synoviosyyttihyperplasiaa, tulehdussolujen infiltraatiota ja sileä ruston pinta. Vertailun vuoksi voidaan todeta, että ajoneuvoryhmän rottien nivelten histologinen arkkitehtuuri oli selvästi epänormaali, ja niissä esiintyi immuunisolujen infiltraatiota, synoviosyyttien liikakasvua, lisääntynyttä verisuonten määrää sekä ruston ja luun eroosiota. TwHF- ja WV-ryhmien nivelet olivat merkittävästi heikentyneet ajoneuvoryhmän nivelistä ja siirtyneet kohti kontrolliryhmän niveliä. Histopatologiset pisteet (kuva 2(b)) osoittivat (ajoneuvoryhmä) epänormaalia nivelkalvon limakalvosolukkoa ja tulehdussolujen infiltraatiota niveltulehdusnivelissä; TwHF- ja WV-hoidot alensivat merkittävästi keskimääräistä histopatologista pistemäärää ja palauttivat ruston verrattuna ajoneuvoryhmään ().

(a)

(b)

(a)
(b)

Kuva 2

WV:n vaikutukset niveltulehduksen etenemiseen ja nivelten histologiaan CIA-rotilla. (a) Eri WV- ja TwHF-annoksilla hoidettujen CIA-rottien ja normaalien rottien nivelkudosleikkeiden histopatologia H&E-värjäyksellä. Alkuperäinen suurennos ×200. a, luun tuhoutuminen; b, immuunisolujen infiltraatio; c, hypertrofinen nivelkalvo. (b) Histopatologiset pisteet synoviocyte hyperplasia ja tulehdussolujen infiltraatio kaikissa ryhmissä. , verrattuna kontrolliryhmään; , verrattuna ajoneuvoryhmään.

3.3. WV:n vaikutukset viskeraindeksiin ja immuuniseerumiglobuliinitasoihin CIA-rotilla

Kontrolliryhmään verrattuna ajoneuvoryhmän maksaindeksi laski merkittävästi () ja WV (0,25 ja 0,5 mg/kg) nosti sitä selvästi (). Kontrolliryhmään verrattuna ajoneuvoryhmän pernaindeksi ja kateenkorvaindeksi kasvoivat selvästi (); TwHF:llä ja WV:llä oli niihin estävä vaikutus, joka näkyi erityisesti WV:n 0,5 mg/kg:n annoksen vaikutuksessa kateenkorvaindeksiin (kuva 3(a)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Kuva 3

WV:n vaikutukset CIA-rottien sisäelinindeksiin ja immuuniseerumin globuliinitasoihin. (a) Pernan, kateenkorvan ja maksan indeksin muutokset kaikissa ryhmissä. (b) IgG-, IgA- ja IgM-pitoisuuksien ilmentyminen seerumissa kaikissa ryhmissä. , verrattuna kontrolliryhmään; , verrattuna ajoneuvoryhmään.

Ekspressiiviset IgG-, IgA- ja IgM-tasot paranivat dramaattisesti CIA-rotilla () kontrolliryhmään verrattuna, kun taas ne pienenivät TwHF-käsittelyn jälkeen (). Ja seerumin IgG-tasot laskivat WV (0,5 mg/kg) -ryhmässä verrattuna ajoneuvoryhmään (). Tämä inhibitio koski myös IgA:ta ja IgM:ää WV-ryhmissä (0,25 ja 0,5 mg/kg) (kuva 3(b)).

3.4. Tauti ja verenmyrkytys. WV:n vaikutukset T-solujen alaryhmiin CIA-rottien pernassa

CD4+ T-solujen määrä lisääntyi merkitsevästi ajoneuvoryhmissä verrattuna kontrolliryhmään (), kun taas TwHF- ja WV- (0,5 mg/kg) -ryhmissä CD4+ T-solujen määrä oli merkitsevästi pienempi kuin ajoneuvoryhmässä (Kuva 4(a)). Verrattuna kontrolliryhmään CD4+CD25+ T-solujen määrä väheni merkitsevästi ajoneuvoryhmässä (), kun taas ne lisääntyivät merkitsevästi TwHF- ja WV (0,5 mg/kg) -ryhmissä (), mutta eivät selvästi muissa ryhmissä (kuva 4(a)). Verrattuna kontrolliryhmään CD8+ T-solujen määrän väheneminen ajoneuvoryhmässä oli huomattavaa, mutta vain WV (0,125 ja 0,25 mg/kg) sai lukumäärät nousemaan (, ) (kuva 4(b)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Kuva 4

T-solujen alaryhmien määrä pernan soluissa virtaussytometrialla. (a) FCM:n tulokset Th-solujen ja Tc-solujen määrästä (vasemmalla); FCM:n tulokset Treg-solujen määrästä (oikealla). (b) Pylväsdiagrammi osoitti WV:n ja TwHF:n negatiivisen vaikutuksen Th-soluihin ja positiivisen vaikutuksen Tc- ja Treg-soluihin. , verrattuna kontrolliryhmään; , verrattuna ajoneuvoryhmään.

3.5. WV:n säätelemät seerumin sytokiinit ja välittäjäaineet CIA-rotilla

ELISA-sarjat (kuva 5) osoittivat, että kontrolliryhmään verrattuna IL-1β:n, TNF-α:n, IL-6:n, PGE2:n, COX-2:n ja IL-8:n seerumipitoisuudet kasvoivat merkitsevästi ajoneuvoryhmässä, ja ne palautuivat selvästi TwHF:llä (9 mg / kg) ja WV:llä (0,5 mg / kg) (). Samaan aikaan IL-6:n ja PGE2:n ilmentymät tukahdutettiin 0,125 ja 0,25 mg/kg WV-annoksilla (). WV (0,125 ja 0,25 mg/kg) vähensi samalla tavoin COX-2:n ja IL-8:n ilmentymistä verrattuna aineeseen (, ). Tämä osoitti, että CCII:n aiheuttama tulehdus todennäköisesti välitti nivelrikkoisten rottien patologisia muutoksia, ja WV saattoi lievittää tulehdusreaktiota.

Kuva 5

WV:n vaikutukset IL-1β-, TNF-α-, IL-6-, IL-8-, PGE2- ja COX-2-pitoisuuksiin CIA:n rottien seerumissa. , verrattuna kontrolliryhmään; , verrattuna ajoneuvoryhmään.

4. Pohdinta

RA on krooninen autoimmuunisairaus, jolle on ominaista kipu, turvotus ja nivelten asteittainen tuhoutuminen, mikä johtaa toimintakyvyn menettämiseen . cVaikka metotreksaattitabletteja (MTX) pidetäänkin yleisesti nivelreuman hoitavana lääkkeenä , niihin liittyy tavallisesti lääkeaineisiin kohdistuvia haittavaikutuksia . Näin ollen pyrimme arvioimaan, voisiko ampiaismyrkky (WV) olla mahdollinen vaihtoehtoinen lääke RA:n hoitoon.

Tämä tutkimus oli tietojemme mukaan ensimmäinen, jossa tutkittiin WV:n (Vespa magnifica) terapeuttista roolia kollageenin aiheuttamassa niveltulehduksessa (CIA) SD-rotilla, ja sitä verrattiin TwHF:n kliinisesti todistettuun vaikutukseen. Tripterygium wilfordii Hook F (TwHF), joka tunnetaan myös nimellä Lei Gong Teng TCM: ssä, on käytetty RA: n hoitoon Kiinassa jo vuosia, ja TwHF: n uutteet ovat osoittaneet anti-inflammatorisia ja immunosuppressiivisia vaikutuksia sekä in vivo että in vitro -tutkimuksissa . Perustimme CIA-rottien mallin 14 päivän ajaksi ja poistimme 12 ilmeistä epäpätevyyttä, jotka saattoivat johtua injektion epäonnistumisesta 52 rotasta, eli CIA-rotilla oli 77% niveltulehdusaste. Kontrolliryhmässä ei ollut merkkejä turvotuksesta tai tulehduksesta (kuvat 1 ja 5), ja havaintomme ovat sopusoinnussa aiempien RA- ja CIA-tutkimusten kanssa, joissa raportoitiin, että CCII-emulgaattori aiheutti turvotuksen ja tulehdusvaurioiden vakavuuden nivelissä . Sitten WV-ryhmässä (0,5 mg/kg) parantuneet oireet olivat samankaltaisia kuin positiivisella lääkkeellä TwHF, jonka on raportoitu estävän RA:n tulehdusreaktiota , mutta pienen annoksen vaikutus ei ollut merkittävä turvotuksen vähenemiseen ja IL-1β:n ja TNF-α:n estoon (kuvat 1 ja 5). Lisäksi huomasimme, että ajoneuvoryhmän rotilla oli karheampi turkki ja huonompi psyykkinen tila kuin kontrolliryhmän rotilla; nämä olosuhteet olivat muuttuneet sitäkin paremmiksi hoitoryhmässä.

WV:n terapeuttisen tehokkuuden arvioimiseksi tarkemmin H&E-värjäys suoritettiin vasemman takanivelen nilkkanivelen kudosnäytteissä patologisen ominaisuuden analysoimiseksi, ja havaitsimme, että synoviaalisolut aiheuttavat tulehdusta, proliferaatiota ja invasiota paikalliseen rustoon ja luuhun ajoneuvoryhmässä (kuva 2), ja nämä makroskooppiset muutokset ovat yhdenmukaisia aiempien raporttien kanssa . Lisäksi TwHF- ja WV-hoito 14 päivän ajan vähensi merkittävästi synoviaalisolujen hyperplasiaa ja tulehdussolujen infiltraatiota verrattuna käsittelemättömään ryhmään (kuva 2). Krooninen synoviitti on RA:n patologinen perusta . Niveltulehdusta ohjaa synoviosyyttien ja synnynnäisen ja adaptiivisen immuunijärjestelmän solujen välinen monimutkainen vuorovaikutus . Siksi tässä kokeessa laskettiin immuunielinten, kuten pernan ja kateenkorvan, viskeraalinen indeksi. On syytä mainita, että emme havainneet merkittävää eroa painossa ajoneuvo- ja hoitoryhmän välillä, joten käytimme edustavaa sisäelinten indeksiä rottien yleisen terveydentilan kuvaamiseen. Havaitsimme, että TwHF ja WV pystyivät vähentämään pernan ja kateenkorvan viskeraali-indeksin nousua CIA-rotilla (kuva 3(a)); tämä saattaa heijastaa niiden roolia RA:n aiheuttaman immuunijärjestelmän vahvistumisen lievittämisessä. Huomasimme myös maksan indeksin muutoksen tämän prosessin aikana; tuloksemme osoittivat, että TwHF ei elvyttänyt maksan indeksiä, vaikka sen hoito oli tehokasta, mikä muistutti meitä sen myrkyllisyydestä maksaan aiemmassa raportissa . Onneksi tätä ei havaittu WV-ryhmässä (kuva 3(a)). Lukuun ottamatta alentunutta maksaindeksiä ajoneuvo- ja TwHF-ryhmässä, näillä rotilla ei havaittu sivuvaikutuksia, mikä saattoi johtua käyttämistämme pienistä annoksista. Lisäksi havaitsimme myös reumatekijöitä (RF), jotka ovat RA:n diagnostinen merkkiaine ja joihin kuuluvat pääasiassa IgG-, IgA- ja IgM-isotyypit; niiden havaitsemisaste on korkea RA-potilailla. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että käsittelemättömien CIA-rottien seerumin IgG-, IgA- ja IgM-vasta-aineiden pitoisuudet olivat huomattavasti korkeammat kuin TwHF- ja WV-ryhmissä (kuva 3(b)); nämä tulokset sopivat hyvin yhteen raportoitujen kliinisten tietojen kanssa. Näin ollen voitiin todeta, että TwHF ja WV (0,5 mg/kg) pystyivät alentamaan CIA-rottien liiallisen autoimmuunivasteen lähelle normaalia tasoa. Sitä vastoin WV:n (0,125 ja 0,25 mg/kg) vaikutus ei ollut ilmeinen, kun taas jää nähtäväksi, parantavatko suuremmat annokset vaikutusta sen sijaan, että ne toimisivat myrkkyinä, joten keskityimme edelleen näihin kolmeen annokseen tutkiaksemme WV:n vaikutusta RA:han tässä kokeessa.

Varhaisemmat tutkimustulokset ovat osoittaneet, että synoviaalinen tulehdus rekrytoi ja aktivoi immuunijärjestelmän soluja tuottamalla välittäjäaineita ja että T- soluilla on elintärkeitä rooleja RA:n säätelyssä. Mitä tulee proinflammatoristen sytokiinien rooliin autoimmuniteetissa, on olennaista ottaa huomioon tasapaino eri T-solujen osajoukkojen välillä, jotka jaetaan pääasiassa kahteen hypotyyppiin niiden toiminnan ja fenotyyppien mukaan: CD4+ auttaja-T-solut (Th-solut) ja CD8+ sytotoksiset T-solut (Tc-solut). Th-solut ja Tc-solut, joille on ominaista erilaisten spesifisten sytokiinien tuotanto, helpottavat adaptiivista immuunivastetta . Sitä vastoin CD4+CD25+ T-soluilla (Treg-solut) on keskeinen tehtävä immuunitoleranssin ylläpitämisessä kontrolloimalla tulehdusreaktioita ja tukahduttamalla edellä mainittujen immuunisolujen toimintaa . Tässä tutkimuksessa havaittiin suuri Th- ja Tc-solujen pitoisuus pernan soluissa ja myös Treg-solujen heikentynyt toiminta CIA-rotilla. Onneksi T-solujen alaryhmien välinen tasapaino suojattiin TwHF- ja WV-hoidolla (kuva 4). Huomattakoon, että immuunisolujen kertyminen on paikallisen niveltulehduksen edistäjä, ja aktivoituneet immuunisolut vapauttavat suuren määrän proinflammatorisia sytokiineja, jotka sitten indusoivat nivelsolujen aktivoitumista ja lisääntymistä ja pahentavat entisestään niveltulehduksen etenemistä . Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että IL-6 on hallitsevin sytokiini RA:n patogeneesissä, ja RA-potilaiden nivelnesteestä on löydetty liiallisia määriä IL-1β:tä sekä TNF-α:ta ja IL-8:aa. Myös COX-2:n ja PGE2:n tuotanto on lisääntynyt IL-1β:n stimulaation jälkeen, ja niiden estäminen lievitti merkittävästi RA:n oireita . Kokeellisissa tuloksissamme havaittiin samankaltaisia havaintoja, ja vahvistimme, että TwHF ja WV (0,5 mg/kg) pystyivät tehokkaasti vähentämään IL-6:n, IL-8:n, PGE2:n ja COX-2:n pitoisuuksia; myös RA:n aiheuttamat kohonneet IL-1β:n ja TNF-α:n pitoisuudet tukahdutettiin lukuun ottamatta WV:tä (0,125 ja 0.25 mg/kg) ryhmiä (kuva 5).

Nämä tulokset viittasivat siihen, että WV:n tehtävänä on lievittää nivelturvotusta, estää niveltulehdusta, tukahduttaa liiallista immuunivastetta ja suojella immuunijärjestelmän homeostaasia, mikä voi parantaa oireita ja tulla tehokkaiksi lääkkeiksi RA:n hoitoon. On raportoitu, että ampiaismyrkky sisältää useita bioaktiivisia molekyylejä, kuten amiineja, pieniä peptidejä ja jopa entsyymejä, allergeeneja ja toksiineja, joilla on suuri molekyylimassa . WV eroaa BV: stä siinä, että BV: llä on pääasiassa anti-inflammatorisia, antioksidatiivisia ja analgeettisia vaikutuksia RA: han, ja se sisältää useita erilaisia peptidejä, mukaan lukien melittin, fosfolipaasi A2, apamiini ja niin edelleen . RA:n hoitomekanismit näillä kahdella myrkyllä voivat olla erilaisia, ja niitä kannattaa tutkia lisää. Vaikka haittavaikutuksia ei havaittu välillä 0,125-0,5 mg/kg WV:tä, WV-uutteen aktiivisten ainesosien ja turvallisuuden lisäarviointia tarvitaan.

5. Johtopäätökset

Waspin myrkky lievitti CIA:n aiheuttamaa synoviaalista hyperplasiaa ja rustotuhoa, mikä johtui mahdollisesti proinflammatorisen tekijän vähenemisestä ja immunoregulaatiovaikutuksesta. Tämä tutkimus osoitti, että ampiaismyrkky saattoi olla mahdollinen terapeuttinen vaihtoehto RA:n hoitoon. Sen lisäksi, että WV on ollut kansan resepti jo monen vuoden ajan, se ansaitsee lisätutkimuksia, jotta se löydettäisiin, tutkittaisiin ja tunnustettaisiin.

Tietojen saatavuus

Tämän tutkimuksen tulosten tukena käytetyt tiedot sisältyvät artikkeliin, ja ne voidaan asettaa vapaasti saataville.

Eettinen hyväksyntä

Tutkimus hyväksyttiin Dalin yliopiston laitoseläinten hoito- ja käyttökomiteassa (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC).

Interintäristiriidat

Tekijät ilmoittavat, ettei tämän artikkelin julkaisemiseen liittyen ole eturistiriitoja.

Tekijöiden panos

YG kirjoitti käsikirjoituksen ja avusti eläinmallien rakentamisessa ja ryhmittelyssä. WXY ja HL suorittivat H&E-värjäyksen ja virtaussytometrian. XMD ja LLN vastasivat ELISA-sarjoista. ZBY, HRZ ja HX osallistuivat merkittävästi käsikirjoituksen kirjoittamiseen. ZBY ja CGZ hallinnoivat ja valvoivat hanketta. Kaikki kirjoittajat lukivat ja hyväksyivät lopullisen käsikirjoituksen.

Kiitokset

Tämä työ sai osittain tukea Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics -ohjelmasta. Tätä tutkimusta rahoittivat Kiinan kansallinen luonnontieteellinen säätiö (apurahat nro 81360679 ja 81703742), Yunnan Applied Basic Research for Young Scholars (apuraha nro 2016FD074), Yunnanin maakunnan luonnontieteellinen säätiö (apuraha nro. 2017FA050), ja Dali University Innovation Team of Advanced Pharmaceutics of Entomological Bio-Pharmacy R&D (apuraha nro ZKLX2019101).