Discussion
Un paramètre important dans HELM est l’angle α du faisceau par rapport à l’axe optique, qui détermine la fréquence spatiale d’excitation u. Dans la figure 4, on peut voir que le choix de u nécessite de négocier la fréquence de coupure maximale le long de l’axe kx et ky vs. L’anisotropie de la bande passante résultante.
La valeur choisie (55°) est un bon compromis et, en outre, permet l’observation directe de la figure d’interférence avec des objectifs à immersion.
En raison de la bande passante non isotrope, les images des perles présentent une certaine anisotropie et un dépassement près des bords des perles ; les zones sombres dans les directions diagonales de la figure 2A sont les plus visibles. Cet effet pourrait être évité en grande partie en utilisant six ou huit faisceaux laser orientés en multiples de 60° ou 45°, respectivement.‡
Par rapport à la CFM, le rapport signal/bruit de l’image HELM est supérieur, même si la puissance laser intégrée dans le temps était plus de 100 fois supérieure pour l’image CFM de la figure 2C. Une des raisons fondamentales de cette amélioration réside dans le fait que l’amélioration de la résolution de la CFM par rapport à la microscopie à fluorescence standard ne peut être obtenue qu’en utilisant un petit trou d’épingle dans le trajet de la lumière d’émission (5, 13, 14). Cette disposition nécessite un compromis entre le niveau de bruit et la résolution. A l’inverse, dans HELM, tous les photons entrant dans les lentilles peuvent être collectés par la caméra.
Pour les études d’objets dynamiques, la vitesse d’imagerie est d’une importance majeure. La limitation fondamentale de la vitesse d’imagerie en microscopie à fluorescence est donnée par le taux d’émission maximum des fluorophores causé par la durée de vie finie de l’état excité ( » saturation du colorant » ; réf. 15). Dans HELM, environ la moitié des fluorophores sont éclairés par le motif d’interférence à un moment donné, alors que dans la MFC courante à point unique, seule une infime fraction des fluorophores est éclairée à un moment donné (≈1 par million pour une image de 1 024 × 1 024 pixels). Par conséquent, le flux total de photons provenant du spécimen est limité à des valeurs inférieures de plusieurs ordres de grandeur pour l’opération séquentielle de CFM que pour celle parallèle de HELM. Étant donné qu’un nombre minimal de photons par image est requis pour un certain niveau de signal-bruit, HELM a le potentiel d’acquérir des données d’image beaucoup plus rapidement que CFM. En plus de cette considération fondamentale, HELM réduit les problèmes de vitesse liés aux mécanismes de balayage mécanique, car seulement cinq balayages par image sont effectués contrairement à la CFM, où un balayage par ligne est nécessaire. Le problème de saturation du colorant et les difficultés de balayage mécanique de la CFM peuvent toutefois être réduits par les nouveaux scanners multipoints.
Les avantages dans le domaine de la vitesse d’imagerie sont également visibles dans nos données expérimentales. Le temps d’acquisition total pour les cinq images requises pour HELM (Fig. 2A) était de 1,6 s, contre 6,5 s pour l’image confocale (Fig. 2C). En tenant compte du rapport signal/bruit plus élevé de l’image HELM qui est obtenu avec une caméra CCD non refroidie de qualité industrielle, la différence est claire.
Un point d’intérêt pratique est la stabilité requise du motif d’interférence pendant la mesure. Nous avons constaté que des erreurs de décalage de phase de 1/10 de l’espacement nodal (20 nm) sont juste tolérables, mais que des erreurs plus importantes entraînent des détériorations importantes de l’image. La dérive thermique de notre installation (typiquement 20 nm/min dans une pièce non contrôlée en température) limite le temps d’acquisition à quelques dizaines de secondes. Cette limitation, cependant, pourrait être facilement surmontée en recalibrant les décalages de phase pendant une mesure à long terme. L’hétérogénéité de l’indice de réfraction de l’échantillon entraîne également des erreurs de phase indésirables de la figure d’interférence, qui dépendent de l’espace dans ce cas. Comme précédemment, pour limiter ces erreurs à des valeurs tolérables, les distorsions du front d’onde introduites par l’hétérogénéité de l’indice de réfraction ne devraient pas dépasser quelques dizaines de nanomètres. Nous pensons que les exigences applicables à HELM ne diffèrent pas beaucoup de celles qui garantissent une imagerie à haute résolution avec des objectifs à haut NA bien corrigés en microscopie standard. D’autres données expérimentales seront nécessaires pour étudier la sensibilité de HELM contre l’hétérogénéité de l’indice de réfraction dans la pratique.
Pour de nombreuses applications, l’étude de la structure tridimensionnelle de l’échantillon présente un intérêt majeur. Des données d’images tridimensionnelles peuvent être acquises en faisant avancer le foyer à travers l’échantillon marqué (16) ou non marqué (17, 18). Malheureusement, la résolution axiale de la microscopie à fluorescence standard est fortement limitée à environ 0,9 μm pour les objets ponctuels et, pire encore, peut s’effondrer complètement pour les objets arbitraires (19). Ce problème correspond au fait que l’OTF tridimensionnel présente un cône manquant autour de l’axe kz à l’origine, et par conséquent, l’image tridimensionnelle résultante présente des artefacts potentiels. La CFM, en revanche, ne présente pas de cône manquant et permet l’acquisition d’images tridimensionnelles avec une résolution axiale d’environ 0,8 μm (20), qui reste toutefois inférieure à la résolution latérale.
Différentes méthodes ont été décrites pour améliorer encore la résolution axiale. Le microscope dit 4π (21) est un dérivé du CFM avec un second objectif pour collecter également les photons se propageant vers l’arrière de la chambre à spécimen. La résolution axiale peut théoriquement atteindre 100 nm, tandis que le pouvoir de résolution latérale est égal à celui du CFM. Le microscope 4π est également un microscope à balayage.
Une approche sans balayage est décrite dans les réf. 22 et 23. Une capacité de séparation axiale fortement accrue est obtenue au moyen d’un champ d’interférence dont les plans nodal et antinodal sont parallèles au plan image. Cette méthode est bien adaptée aux objets dont l’épaisseur est inférieure à une période du motif d’excitation. L’imagerie de spécimens plus épais peut entraîner des artefacts, car la bande passante résultante a toujours un cône manquant à l’origine (9).
Un autre développement qui partage des aspects de cette dernière méthode et de la microscopie 4π a été démontré récemment (microscopie I5M ; réf. 24). La microscopie I5M utilise un champ d’interférence plus compliqué généré par une source de lumière non cohérente pour éclairer sélectivement le plan de l’objet et est une méthode sans balayage. La résolution axiale est égale à celle de la microscopie 4π (100 nm), mais la résolution latérale n’est pas du tout augmentée.
Une résolution axiale améliorée peut également être obtenue en illuminant l’échantillon avec un motif de franges produit, par exemple, par l’imagerie d’un réseau sur l’objet (25) ou par l’interférence de deux faisceaux laser (26). Pour ces méthodes, l’algorithme de reconstruction appliqué diffère sensiblement du nôtre, car le cercle de transmission central de la figure 4 est omis et parce que l’information sur l’objet n’est transférée que dans deux bandes latérales (27). On peut montrer, dans ce cas, que le flou hors foyer est réduit.
Souhaitable est un microscope avec une résolution uniformément élevée de 100 nm dans toutes les directions de l’espace sans avoir besoin d’une méthode de balayage. HELM, tel qu’établi dans notre configuration actuelle, n’augmente pas la résolution axiale par rapport à la microscopie à fluorescence standard. Cependant, l’idée principale est que l’excitation harmonique, associée à un algorithme de reconstruction similaire à celui décrit ici, fonctionne également dans les directions spatiales non parallèles au plan de l’objet. En utilisant des modèles d’intensité harmoniques dont les plans nodaux et antinodaux se trouvent dans des directions spatiales appropriées, on obtient des copies supplémentaires de la FTO tridimensionnelle dans toute direction souhaitée. Ces régions de bande passante supplémentaires pourraient être superposées à une bande passante étendue avec une fréquence de coupure élevée dans tout l’espace réciproque.
Notre idée pour une future configuration est d’utiliser des unités de déviation de faisceau continu (comme des galvanomètres ou des dispositifs acousto-optiques) pour produire facilement des motifs d’interférence dans des orientations sélectionnées dans l’espace et avec différents espacements nodaux. Une telle configuration permettrait d’obtenir des images tridimensionnelles et, simultanément, de résoudre les problèmes d’anisotropie causés par la FTO bidimensionnelle en forme de trèfle.