Alai

Abstract

A reumatoid artritisz (RA) egy autoimmun betegség. A darázsméreg (WV), amelyet a kínai Yunnanban, a Jingpo nemzetségben hagyományos népi gyógyszerként tartanak számon, enyhíti a reumatoid artritiszt. A jelen tanulmány célja a darázsméreg reumatoid artritisz tüneteit javító hatásának vizsgálata volt kísérleti patkányokban. A II-es típusú kollagénnel (CII) kiváltott artritisz (CIA) modelljét állítottuk fel SD patkányokban, és vizsgáltuk a gyulladás és az autoimmun válasz gátlását. A WV artritiszellenes hatását a mancs duzzanatán keresztül értékeltük, valamint az érintett mancs szövettani pontszámát és szövettani változásait vizsgáltuk. A gyulladáscsökkentő hatásokat az IL-6, TNF-α, IL-1β szintjével és a gyulladásos sejtek számával vizsgáltuk a perifériás vérben. A T-sejt alcsoportok arányának változását a patkányok lépében áramlási citometriával detektáltuk, és ezzel egyidejűleg értékeltük a zsigeri indexet és az immunszérum globulin szintjét. Az eredmények arra utaltak, hogy a WV különböző dózisai (0,125, 0,25 és 0,5 mg/kg) jelentősen enyhítették a CIA-patkányok mancsduzzanatát és az artritisz pontszámát a kezeletlen kontrollhoz képest (). A WV (0,25 és 0,5 mg/kg) enyhítette a bokaízületek szinoviális szöveti elváltozásait és a szinoviocita hiperplázia és a gyulladásos sejtinfiltráció szövettani pontszámát a járműcsoporttal (). Ami az immunológiai szabályozást illeti, 0,5 mg/kg WV csökkentette az immunszérum globulin szintjét (), és megállapítottuk továbbá, hogy a WV (0,5 mg/kg) elnyomta a Th-sejtek immunválaszát, miközben jelentősen fokozta a Tc-sejtek és a Treg-sejtek funkcióját a lépsejtekben (). A WV mutatott immunszuppresszív hatása analóg volt a patkányszérum IL-1β, TNF-α, IL-8, IL-6, COX-2 és PGE2 szintjére gyakorolt gátló hatásával. Összefoglalva, ezek az eredmények azt mutatták, hogy a WV antiartritikus aktivitást mutat, ami összefügghet az immunregulációra gyakorolt gátló hatásával és gyulladáscsökkentő hatásával.

1. Bevezetés

A reumatoid artritisz (RA) egy krónikus autoimmun betegség, amely szisztémás szövődményekhez, fizikai fogyatékossághoz és akár korai halálhoz is vezethet . A szinoviális sejtek hiperpláziája, a szinoviális hártya krónikus gyulladása, valamint a porc és a csont pusztulása az RA fő jellemzői. Ezenkívül a T-sejtek, a B-sejtek és a proinflammatorikus citokinek szinergikus hatásai is kulcsszerepet játszanak a patofiziológiai folyamatban . Amikor a CD4+ T-sejtek aktiválódnak, proinflammatorikus citokineket termelnek, amelyek más mononukleáris sejtek, synovialis fibroblasztok, chondrociták és osteoclastok stimulálásával fokozzák az immunválaszt. Ezeknek a proinflammatorikus citokineknek, különösen a TNF-α, IL-6 és IL-1β felszabadulása hozzájárulhat a synovitishez.

Az RA kezelésére jelenleg alkalmazott klinikai kezelési gyógyszerek elsősorban a gyulladásos mediátorok csökkentésére összpontosítanak, mint például a nem-szteroid gyulladáscsökkentők (NSAID), a betegségmódosító antirheumatikus gyógyszerek (DMARD) és a biológiai szerek. Például a folsav-analóg metotrexátot (MTX), mint NSAID-ot, az FDA 1988-ban engedélyezte RA kezelésére . Ezenkívül immunszuppresszív aktivitása, gyulladáscsökkentő hatása és alacsony költsége miatt az RA kezelésében a legszélesebb körben alkalmazott gyógyszerré vált . Az MTX azonban nem ideális terápiás szer az idegrendszerre, a gyomor-bélrendszerre és az immunrendszerre gyakorolt nemkívánatos mellékhatásai miatt, ahogyan más gyógyszerek sem . Ezért egyre többen keresnek új alternatívákat e gyógyszerek hatástalanságának és biztonságosságának kezelésére. A hagyományos kínai orvoslás (TCM) elméletében az RA-t az arthralgia szindróma (“Bi Zheng” a TCM-ben) egyikének tekintik, amelyet valószínűleg az exogén szél, nedvesség és hő vagy hideg kórokozók okoznak . A TCM alkalmazása a betegségek megelőzésében és kezelésében több évszázados múltra tekint vissza, növekvő jelentősége az RA kezelésében figyelemre méltó hatékonyságának, de kevesebb mellékhatásnak és költségnek tulajdonítható .

Venom terápia, mint kiegészítő és alternatív gyógyászati megközelítés, több évszázada használják a fájdalom, gyulladás és ízületi gyulladás kezelésére a népi gyógyászatban . Már a Harcoló Államok korában, a Sárga Császár Belső Kánonjában (“Huangdi Neijing” kínaiul) található egy feljegyzés: “a méhcsípés a felmerülő mérgezési kockázat ellenére terápiás hatású”. A modern orvosi kutatások szerint a méhméreg (BV) ízületi gyulladáscsökkentő, gyulladáscsökkentő és fájdalomcsillapító hatást mutat, amely a központi gátló és az immunrendszer több mechanizmuson keresztül történő aktiválásának és modulációjának tulajdonítható . Több klinikai vizsgálat is kimutatta, hogy a BV javíthatja az ízületi gyulladással kapcsolatos tüneteket .

A méhméreg számos biológiailag aktív összetevőt tartalmaz, köztük biogén aminokat, nagy molekulatömegű anyagokat (például enzimeket, allergéneket és bioaktív peptideket) és poliamin-toxinokat. A darázsméreg különböző farmakológiai hatásokat mutatott a fájdalom, a gyulladásos betegségek és a neurodegeneratív betegségek kezelésében . A Vespa magnifica (Smith) egy szociális darázsfajta, amely a kínai Yunnanban található . Az elmúlt években számos véralvadásgátló, trombocitaellenes, gyulladáscsökkentő és immunszuppresszív hatású vegyületet különítettek el a mérgükből . A reumás ízületi gyulladásra gyakorolt figyelemre méltó hatása alapján a kínai nemzeti kisebbségben, a Jingpóban széles körben használt szokássá vált . Mindazonáltal, amennyire tudjuk, csak kevés jelentés született a darázsméreg reumaellenes hatásairól.

A jelenlegi munkában a kollagén-indukált artritisz (CIA) modellt fogadták el, hogy szorosan reprodukálják az RA patogenezisét. A mancs térfogatának változását klasszikusan az RA-ra gyakorolt gyulladáscsökkentő hatások értékelésére használták a szokásos módon . Ezenkívül a WV (Vespa magnifica darázsméreg) hatását is értékeltük ugyanebben a modellben. Végül a WV gyulladáscsökkentő és immunmodulációs hatékonyságát az ízületi szövetek H&E festésével, a lépben lévő T-sejt alcsoportok áramlási citometriájával, valamint a szérum IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-8, COX-2, PGE2 és reumafaktorok (IgG, IgA és IgM) ELISA vizsgálatával figyeltük meg.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Kísérleti állatok

Hím SD patkányokat (60 patkány, 180-220 g) a Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co., Ltd.-től szereztük be. Az állatokat szabványos polipropilén ketrecekben helyezték el, amelyek nyers héjjal voltak bélelve (48 óra után megújítva). Az állatházat 12 órás világos/sötét ciklusban tartották, körülbelül 22 ± 2°C-on és 60-70%-os relatív páratartalom mellett, az állatok szabadon hozzáférhettek vízhez és standard takarmányhoz. A patkányokat véletlenszerűen osztották be 8 kontroll és 52 modellcsoportba, majd minden kísérletben legalább 7 napot hagytak az alkalmazkodásra. Minden kísérleti eljárást a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutató (National Institutes of Health) szerint végeztünk, és a Dali Egyetem etikai bizottsága hagyta jóvá.

2.2. Az összes kísérleti eljárást a Dali Egyetem etikai bizottsága hagyta jóvá. A CIA állatmodellje és a kezelési protokoll

A macskákat alkohollal fertőtlenítettük, és az első immunizáláshoz 1 mg/ml CCII (csirke II. típusú kollagén) emulgeálószert adtunk be szubkután a jobb vola pedis, a hát és a farok területére, amely a CCII (C9301, Sigma) és a nem teljes Freund-adjuváns (F5506, Sigma) 1 : 1 arányú emulgeálásából áll. Az indukciós napot 0. napnak terveztük. Az emlékeztető adagot a 8. napon 1 ml CCII emulgeálószerrel együtt ismét beadtuk a hasba, a hátba és a farokba. Az injektált lábat gyulladásos lábnak, míg az injekció nélküli másik lábat másodlagos lábnak jegyeztük fel. Ezután a kollagén-indukált artritiszes (CIA) patkányokat a 14. napon kezelték, és a 28. napon fejezték be. A CIA kialakulása után a modellpatkányokat a klinikai pontszámok alapján véletlenszerűen öt csoportra osztották. I. csoport: modellcsoport, amely szubkután injekcióban (1 ml/kg) normál sóoldatot kapott vivőanyagként. II-IV. csoport: a CIA-patkányok 0,125, 0,25 és 0,5 mg/kg WV (darázsméreg, a Vespa magnifica (Smith) Yunnanból, Kínából származó, fagyasztva szárított por, amely a darázs farokmirigyek exudátumából készült, normál sóoldattal hígítva) hipodermikus injekcióját kapták, mint a kezelési csoportok. V. csoport: a pozitív kontrollcsoport 9 mg/kg TwHF-et (Tripterygium wilfordii Hook F, No. 20181001, Huangshi Feiyun Pharmaceutical Co., Ltd.) kapott ugyanilyen módon. Ezzel egyidejűleg a kontrollcsoportban lévő normál patkányoknak ugyanolyan mennyiségű normál sóoldatot adtak önmagában. A fenti patkányok mindegyike 14 napon keresztül napi beadagolásban részesült.

2.3. A kísérleti artritisz alapvető értékelése

A CIA súlyosságát rendszeresen értékeltük a mancsduzzanat és az artritisz pontszámai alapján. A patkányokat a vizsgálat 0-28. napján megmértük, és a bokák vastagságát és kerületét a gyulladásos lábon (a jobb lábon) és a másodlagos lábon (a bal lábon) külön-külön megmértük vernier-kaliberrel és szalaggal a 0., 14. és 28. napon. Az ízületi gyulladás pontszámát három tudós független megfigyelései alapján értékelték. Mindkét mancsot egy 0-4-ig terjedő skálán pontozták, ami azt jelenti, hogy a maximális összpontszám mindkét hátsó mancsízület esetében 8. Az értékelési kritériumok a következők voltak: 0 = nincs ödéma vagy bármilyen vizuális változás; 1 = enyhe ödéma és korlátozott erythema; 2 = enyhe ödéma és erythema; 3 = nyilvánvaló ödéma és jelentős erythema; és 4 = súlyos ödéma és kiterjedt erythema . A 28. napon az állatokat feláldozták, majd a szérumot és a másodlagos bokaízületeket összegyűjtötték és feldolgozták a további elemzéshez.

2.4. A bokaízületek hisztopatológiája

A bal hátsó végtagokat a szomszédos szövetek kivágása nélkül azonnal 2-3 alkalommal PBS-szel mostuk, 48 órán keresztül 10%-os formalinban fixáltuk, majd 24 órán keresztül 5%-os salétromsavval dekalcifikáltuk, amíg a csontkéreg könnyen átfutott egy tű hegyével. A mintákat paraffinmetszetekbe ágyaztuk és szeletekre (5 μm) vágtuk a rutinszerű hematoxilin-eozin (H&E) festéshez. Az ízületek patológiai elváltozásait fénymikroszkóppal (Olympus, Japán) detektáltuk és fényképeztük. A képeket 200x-os nagyítással készítettük. A synoviocyta hyperplasia és a gyulladásos sejtinfiltráció változásait is kimutatták. A szövettani változásokat a következő kritériumok alapján pontoztuk: 0 = nincs kimutatható változás; 1 = enyhe; 2 = közepes; 3 = súlyos .

2.5. A visszerindex elemzése

A macskákat feláldozták, és a teljes májat, a lépet és a tímuszt reszekálták, a környező zsírszövetet és fasciát gondosan elkülönítve. A máj, a lép és a thymus nedves tömegét elektronikus mérleggel megmértük, és a zsigeri indexet (beleértve a májindexet, a lépindexet és a thymus-indexet) a következő képlet szerint számoltuk ki. Viszcera-index = szervtömeg (mg)/testtömeg (g) × 100%.

2.6. A szérum biokémiai indexeinek ELISA-vizsgálata

A kísérleti patkányok szérumát gyűjtöttük, és a TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, COX-2 és PGE2 koncentrációját enzimhez kötött immunoszorbens assay (ELISA) készletekkel (Nanjing JianCheng, Kína) mutattuk ki a gyártó utasításait követve. Az IgA (ERC015), IgG (ERC016) és IgM (ERC017) expressziós szintjének kimutatására szolgáló ELISA-készleteket a NeoBioscience Co., Ltd. (Shenzhen, Kína) cégtől vásároltuk.

2.7. Az artritiszes lép áramlási citometriája

A T-sejt-alcsoportok számát áramlási citometriával detektáltuk. A limfocitákat patkány lépsejtekből gyűjtöttük, amelyeket 200 mesh-es nejlonszitán való áthaladással homogenizáltunk. A sejteket 10% magzati szarvasmarha szérumot tartalmazó PBS pufferbe szűrtük. A sejtkoncentrációt kb. 2 × 106/ml-re állítottuk be, majd 3 ml vörösvértest-lízis puffert (Solarbio, Kína) adtunk hozzá a vörösvértestek 5 percnél rövidebb ideig történő feloldásához. Ezután a sejteket 5 percig 1200 rpm-en centrifugáltuk, kétszer mostuk FBS-PBS pufferrel, amely 10% magzati szarvasmarha-szérumot tartalmazott, majd 5 percig 1200 rpm-en centrifugáltuk. Minden 100 μl sejtszuszpenziót centrifugacsövekbe helyeztünk. A limfocitákat anti-CD3-FITC (No. 557354; BD, USA), anti-CD4-APC (No. 565432; BD, USA), anti-CD8-PerCP (No. 558824; BD, USA) és anti-CD25-PE (No. 554866; BD, USA) festéssel követtük. A monoklonális antitesteket minden egyes csőbe hozzáadtuk, újrakevertük és 30 percig jégen hagytuk. FBS-PBS puffert (1 ml) adtunk minden mintacsőhöz, majd 5 percig 1200 rpm-en centrifugáltuk, és a felülúszót elhagytuk. Az előző lépést kétszer megismételtük, hogy a monoklonális antitestekhez nem kötődő sejteket teljesen eluáljuk ki. A kísérleti sejteket 500 μL FBS-PBS pufferrel kevertük össze. A CD25+/CD4+ és CD4+/CD8+ T-sejtek arányát FACS Canto Flow-cytometer (BD, USA) segítségével határoztuk meg .

2.8. Statisztikai elemzések

Az adatok statisztikai elemzése SPSS10.0 segítségével történt. Az adatokat átlag ± az átlag standard eltérése (S.D.M.) formában mutattuk be. Az egyes csoportok közötti különbségek szignifikanciáját egyutas ANOVA-val, majd Tukey-teszttel elemeztük. Különösen az artritisz pontszámot és a szövettani pontszámot elemeztük Wilcoxon rangsorösszeg-teszttel. Az értékeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

3. Eredmények

3.1. WV enyhítette az artritisz tüneteit CIA-patkányokban

Az artritisz tüneteit sikeresen idéztük elő patkányokban a II. típusú kollagén injektálásával az utasításoknak megfelelően, ami a CIA-patkányok másodlagos mancsában és bokaízületében a súlyos bőrpír és duzzanat jelentős makroszkópos jeleit testesítette meg a1(a) ábrán, ha az egészséges kontrollcsoporttal összehasonlítjuk. A bokaízület vastagsága és kerülete a 14. napon (1. ábra (b)) láthatóan megnövekedett a járművekben a kontrollcsoportéhoz képest; azonban a 28. napon a TwHF és az összes WV kezelt csoport után feltűnően csökkentek a modellcsoportéhoz képest (mind ) (1. ábra (b)). Amikor megmértük a bokaízületek vastagságát és kerületét mind a gyulladásos lábban, mind a másodlagos lábban, az adatok alapján nyilvánvaló duzzanatcsökkenés mutatkozott (1(b) ábra). A duzzanat mértékének eredményei azt jelezték, hogy a WV képes volt kontrollálni a mancsödémát és enyhíteni a másodlagos gyulladást a mancson és a bokaízületben a TwHF hatásnak megfelelően.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

1. ábra

A WV hatása az egyes csoportok ízületi tüneteire. (a) A mancsok duzzanatának mértéke minden csoportban. (b) A bokaízületek vastagsága és kerülete mind a gyulladásos lábban, mind a másodlagos lábban minden csoportban. (c) Az ízületi gyulladás pontszámának összehasonlítása az összes csoport között.

Az ízületi gyulladás pontszáma továbbá különböző mértékben csökkent a WV kezelés révén, a dózis mennyiségétől függően, amint azt az 1. ábra (c) ábrája mutatja. Az artritisz pontszáma a járműcsoportban 6,5 ± 1,0 volt a 14. napon (a 0. naphoz képest, ). Az index szignifikánsan csökkent a 28. napon a TwHF-fel kezelt csoportban, 2,8 ± 0,8 (a 14. naphoz képest, ). Hasonlóképpen, az indexek WV általi csökkenése jelentős és dózisfüggő volt (3,2 ± 0,6 0,5 mg/kg-nál, 4,3 ± 0,7 0,25 mg/kg-nál és 5,6 ± 0,7 0,125 mg/kg-nál) (súlyosan vs. 14 nap, ). Ez azt jelezte, hogy a WV hatékonysága 0,5 mg/kg-os adagban arányos volt a TwHF-fel kezelt csoportéval.

3.2. A WV enyhítette az ízületek kóros elváltozásait a CIA-patkányoknál

H&E festés (2. ábra a)) azt mutatta, hogy a kontrollpatkányok bokaízületeinek szinoviális membránja szabályos sejtes elrendeződésű volt, szinoviális hiperplázia, gyulladásos sejtinfiltráció és sima porcfelület nélkül. Ehhez képest a járműcsoportba tartozó patkányok ízületeinek szövettani felépítése kifejezetten kóros volt, immunsejtes infiltrációval, synoviocyta hyperplasiával, az erek számának növekedésével, valamint a porc és a csont eróziójával. A TwHF és a WV csoportok ízületei jelentősen elmaradtak a járműcsoportéitól, és a kontrollcsoportéi felé mozdultak el. A szövettani pontszámok (2. b) ábra) jelezték (járműcsoport) a kóros ízületi béléssejtek és a gyulladásos sejtek beszivárgását az ízületi gyulladásos ízületekben; a TwHF és WV kezelések jelentősen csökkentették az átlagos szövettani pontszámot és helyreállították a porcot a járműcsoporthoz képest ().

(a)

(b)

(a)
(b)

3.3. A WV hatása a zsigeri indexre és az immunszérum globulin szintjére CIA patkányokban

A kontrollcsoporttal összehasonlítva a járműcsoport májindexe jelentősen csökkent (), míg a WV (0,25 és 0,5 mg/kg) hatására jelentősen nőtt (). A kontrollcsoporttal összehasonlítva a járműcsoport lép- és tímuszindexe jelentősen megnőtt (); a TwHF és a WV gátló hatást gyakorolt rájuk, ami különösen a 0,5 mg/kg dózisú WV tímuszindexre gyakorolt hatásában tükröződött (3. ábra (a)).

(a)

(b)

(a)
(b)

3. ábra

A WV hatása a zsigeri indexre és az immunszérum globulin szintjére CIA patkányokban. (a) A lép, a thymus és a máj indexének változása minden csoportban. (b) Az IgG, IgA és IgM expressziós szintje a szérumban minden csoportban. , a kontrollcsoporttal összehasonlítva; , a járműcsoporttal összehasonlítva.

Az expressziós IgG, IgA és IgM szintek drámaian javultak a CIA-patkányokban () a kontrollhoz képest, míg a TwHF feldolgozás után alacsonyabbak lettek (). A szérum IgG szintje pedig csökkent a WV (0,5 mg/kg) csoportban a vivőanyag csoporthoz képest (). Ez a gátlás az IgA és IgM esetében is érvényesült a WV csoportokban (0,25 és 0,5 mg/kg) (3. ábra b)).

3.4. A WV hatása a CIA-patkányok lépének T-sejt-szubszettjeire

A CD4+ T-sejtek száma szignifikánsan nőtt a vivőanyag-csoportokban a kontrollcsoporthoz képest (), míg a TwHF és a WV (0,5 mg/kg) csoportokban szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a vivőanyag-csoportban (4. ábra(a)). A kontrollcsoporthoz képest a CD4+CD25+ T-sejtek száma a járműcsoportban szignifikánsan csökkent (), míg a TwHF és a WV (0,5 mg/kg) csoportban szignifikánsan nőtt (), de a többi csoportban nem volt nyilvánvaló (4(a) ábra). A kontrollcsoporttal összehasonlítva a CD8+ T-sejtek számának csökkenése a járműcsoportban figyelemre méltó volt, de csak a WV (0,125 és 0,25 mg/kg) hatására emelkedett a számuk (, ) (4(b) ábra).

(a)

(b)

(a)
(b)

3.5. A WV által szabályozott szérum citokinek és mediátorok CIA-patkányokban

ELISA-készletek (5. ábra) azt mutatták, hogy a kontrollcsoporthoz képest az IL-1β, TNF-α, IL-6, PGE2, COX-2 és IL-8 szérumszintje jelentősen megnőtt a járműcsoportban, és jelentősen helyreállt a TwHF (9 mg/kg) és a WV (0,5 mg/kg) hatására (). Eközben az IL-6 és a PGE2 expresszióját 0,125 és 0,25 mg/kg dózisú WV elnyomta (). A WV (0,125 és 0,25 mg/kg) hasonlóan csökkentette a COX-2 és az IL-8 expresszióját a vivőanyaghoz képest (, ). Ez azt jelezte, hogy a CCII által kiváltott gyulladás valószínűleg közvetítette az ízületi patkányoknál észlelt patológiai változásokat, és a WV enyhíteni tudta a gyulladásos választ.

5. ábra

A WV hatása az IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, PGE2 és COX-2 szintjére a CIA patkányszérumban. , a kontrollcsoporttal összehasonlítva; , a járműcsoporttal összehasonlítva.

4. Megbeszélés

Az ARA egy krónikus autoimmun betegség, amelyet fájdalom, duzzanat és az ízületek fokozatos pusztulása jellemez, ami funkcióvesztéshez vezet . cBár a metotrexát (MTX) tablettát gyakran tekintik a reumatoid artritisz kezelési gyógyszerének , általában mellékhatásokkal (ADR) jár . Ezért igyekeztünk felmérni, hogy a darázsméreg (WV) jelenthet-e potenciális alternatív gyógyszert az RA kezelésére.

A jelenlegi tanulmány volt az első, tudomásunk szerint, amely a WV (Vespa magnifica) terápiás szerepét vizsgálta SD patkányokban kiváltott kollagén-indukált artritiszben (CIA), és összehasonlította a TwHF klinikailag bizonyított hatásával. A Tripterygium wilfordii Hook F (TwHF), a TCM-ben Lei Gong Teng néven is ismert, Kínában évek óta használják az RA kezelésére, és a TwHF kivonatai gyulladáscsökkentő és immunszuppresszív hatást mutattak mind in vivo, mind in vitro vizsgálatokban . Létrehoztuk a CIA patkányok modelljét 14 napig, és 52 patkányból 12 nyilvánvaló inkompetenciát távolítottunk el, amelyek az injekciózás sikertelenségéből adódhattak, vagyis a CIA patkányok 77% -os artritisz arányt mutattak. A kontrollcsoport nem mutatta sem az ödéma, sem a gyulladás jeleit (1. és 5. ábra), és eredményeink összhangban vannak az RA és a CIA korábbi tanulmányaival, amelyek arról számoltak be, hogy a CCII emulgeálószer az ízületekben az ödéma és a gyulladásos károsodás súlyosságát idézte elő . Ezután a WV (0,5 mg/kg) csoportban a javuló tünetek hasonlóak voltak a TwHF pozitív gyógyszerhez, amelyről azt jelentették, hogy gátolja az RA gyulladásos válaszát , de az alacsony dózis hatása nem volt jelentős a duzzanat csökkenésére és az IL-1β és TNF-α gátlására (1. és 5. ábra). Ezenkívül észrevettük, hogy a járműcsoportban lévő patkányok szőrzete durvább és mentális állapota rosszabb volt, mint a kontrollcsoportban lévő patkányoké; ezek az állapotok a kezelési csoportban mind jobbra fordultak.

A WV terápiás hatékonyságának további értékeléséhez H&E festést végeztünk a bal hátsó bokaízületi szövetmintákban a patológiai jellemző elemzésére, és azt találtuk, hogy az ízületi sejtek gyulladást, proliferációt és a lokalizált porc és csont invázióját okozzák a járműcsoportban (2. ábra), és ezek a makroszkopikus változások összhangban vannak a korábbi jelentésekkel . Ezenkívül a TwHF és a WV 14 napig tartó kezelése jelentősen csökkentette a szinoviális sejtek hiperpláziáját és a gyulladásos sejtek beszivárgását a kezeletlen csoporthoz képest (2. ábra). A krónikus synovitis az RA patológiai alapja . A synovialis gyulladást a synoviociták és a veleszületett és adaptív immunrendszer infiltráló sejtjei közötti komplex kölcsönhatás irányítja . Ezért ebben a kísérletben az immunszervek, például a lép és a thymus zsigeri indexét számították ki. Érdemes megemlíteni, hogy nem találtunk szignifikáns súlykülönbséget a jármű és a kezelt csoport között; így a reprezentatív zsigeri indexet használtuk a patkányok általános egészségi állapotának tükrözésére. Azt találtuk, hogy a TwHF és a WV csökkenteni tudta a lép és a timusz zsigeri indexének emelkedését a CIA-patkányoknál (3. ábra a)); ez tükrözheti az RA által okozott immunerősödés enyhítésében játszott szerepüket. A májindex változását is észrevettük e folyamat során; eredményeink azt mutatták, hogy a TwHF nem élénkítette a májindexet, bár kezelése hatékony volt, ami emlékeztetett minket a májra gyakorolt toxicitására a korábbi jelentésben . Szerencsére a WV csoportban ezt nem találtuk (3. ábra a)). A csökkent májindex kivételével a vivőanyag és a TwHF csoportban nem észleltünk mellékhatásokat ezeknél a patkányoknál, ami az általunk alkalmazott alacsony dózisnak tudható be. Ezenkívül kimutattuk a reumatoid faktorokat (RF) is, mint az RA diagnosztikai markerét, amely főként IgG, IgA és IgM izotípusokat tartalmaz; az RA-ban szenvedő betegeknél magas a kimutatási aránya . Ez a vizsgálat megállapította, hogy a kezeletlen CIA patkányok szérumában szignifikánsan magasabb volt az IgG, IgA és IgM antitestek szintje, mint a TwHF és WV csoportokban (3. ábra (b)); ezek az eredmények jól egyeztek a közölt klinikai adatokkal. Így látható volt, hogy a TwHF és a WV (0,5 mg/kg) a CIA-patkányok túlzott autoimmun válaszát a normálishoz közeli szintre tudta szabályozni. Ezzel szemben a WV (0,125 és 0,25 mg/kg) hatása nem volt nyilvánvaló, miközben még nem derült ki, hogy a nagyobb dózis javítja-e a hatást, nem pedig méregként hat, ezért továbbra is erre a három dózisra összpontosítottunk, hogy feltárjuk a WV RA-ra gyakorolt hatását ebben a kísérletben.

A korábbi kutatások kimutatták, hogy az ízületi gyulladás mediátorok termelésével toborozza és aktiválja az immunsejteket, és a T-sejtek létfontosságú szerepet játszanak az RA szabályozásában . Ami a proinflammatorikus citokinek autoimmunitásban betöltött szerepét illeti, lényeges figyelembe venni a különböző T-sejt-alcsoportok közötti egyensúlyt, amelyek funkciójuk és fenotípusuk szerint főként két hipotípusra oszlanak: CD4+ segítő T (Th) sejtek és CD8+ citotoxikus T (Tc) sejtek. A Th-sejtek és a Tc-sejtek, amelyeket különböző specifikus citokinek termelése jellemez, elősegítik az adaptív immunválaszt . Ezzel szemben a CD4+CD25+ T (Treg) sejtek kulcsfontosságú szerepet játszanak az immuntolerancia fenntartásában a gyulladásos válaszok szabályozásával és a fent említett immunsejtek aktivitásának elfojtásával . Ebben a vizsgálatban a Th- és Tc-sejtek nagy koncentrációját találtuk a lépsejtekben, és a Treg-sejtek károsodott működését is észleltük a CIA-patkányokban. Szerencsére a T-sejt alcsoportok közötti egyensúlyt TwHF és WV kezeléssel sikerült megvédeni (4. ábra). Megjegyzendő, hogy az immunsejtek felhalmozódása a helyi ízületi gyulladás elősegítője, és az aktivált immunsejtek nagy mennyiségű proinflammatorikus citokint szabadítanak fel, amelyek aztán az ízületi sejtek aktiválódását és proliferációját indukálják, és tovább súlyosbítják az ízületi gyulladás progresszióját . Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az IL-6 a legdominánsabb citokin az RA patogenezisében , és az IL-1β, valamint a TNF-α és az IL-8 túlzott mennyiségét találták az RA betegek szinoviális folyadékában. A COX-2 és a PGE2 termelése az IL-1β stimulációt követően szintén megnövekedett, és ezek blokkolása jelentősen enyhítette az RA tüneteit . Hasonló eredményeket tapasztaltunk kísérleti eredményeinkben is, és megerősítettük, hogy a TwHF és a WV (0,5 mg/kg) hatékonyan csökkentette az IL-6, IL-8, PGE2 és COX-2 szintjét; továbbá az IL-1β és a TNF-α RA által indukált megnövekedett koncentrációját is elnyomta, kivéve a WV (0,125 és 0.25 mg/kg) csoportok kivételével (5. ábra).

Ezek az eredmények azt sugallták, hogy a WV funkciói az ízületi duzzanat enyhítése, a szinoviális gyulladás gátlása, a túlzott immunválasz elnyomása és az immunhomeosztázis védelme, ami javíthatja a tüneteket és hatékony gyógymód lehet az RA kezelésére. Arról számoltak be, hogy a darázsméreg számos bioaktív molekulát tartalmaz, beleértve aminokat, kis peptideket, sőt nagy molekulatömegű enzimeket, allergéneket és toxinokat is . A WV abban különbözik a BV-től, hogy a BV elsősorban gyulladáscsökkentő, antioxidatív és fájdalomcsillapító hatással van az RA-ra, és számos különböző peptidet tartalmaz, beleértve a melittint, a foszfolipáz A2-t, az apamint és így tovább . Az RA kezelésének mechanizmusai e két méreggel eltérőek lehetnek, és további vizsgálatot érdemelnek. Bár a 0,125-0,5 mg/kg WV-tartományban nem észleltek mellékhatásokat, a WV-kivonat hatóanyagainak és biztonságosságának további értékelése szükséges.

5. Következtetések

A kígyóméreg enyhítette a CIA által okozott synovialis hyperplasiát és porcpusztulást, valószínűleg a proinflammatorikus faktor csökkentésének és az immunregulációs hatásnak köszönhetően. Ez a vizsgálat bizonyította, hogy a darázsméreg potenciális terápiás alternatívát jelenthetett az RA kezelésére. Amellett, hogy a WV hosszú évek óta népi recept, további vizsgálatokat érdemel, hogy felfedezzék, feltárják és elismerjék.

Adatok elérhetősége

A tanulmány eredményeinek alátámasztására használt adatok a cikkben szerepelnek és szabadon hozzáférhetőek.

Etikai jóváhagyás

A vizsgálatot a Dali Egyetem intézményi állatgondozási és -használati bizottsága (IACUC) hagyta jóvá.

Érdekütközések

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek érdekellentétek a cikk publikálásával kapcsolatban.

A szerzők hozzájárulása

YG írta a kéziratot és asszisztált az állatmodellek felépítésében és csoportosításában. WXY és HL végezte a H&E festést és az áramlási citometriát. XMD és LLN volt felelős az ELISA-készletekért. ZBY, HRZ és HX jelentős mértékben hozzájárultak a kézirat megírásához. ZBY és CGZ adminisztrálta és felügyelte a projektet. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot.

Köszönet

A munka egy részét a Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics támogatta. A jelen tanulmányt a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (81360679 és 81703742 számú támogatás), a Yunnan Applied Basic Research for Young Scholars (2016FD074 számú támogatás), a Yunnan Province Natural Science Foundation of Yunnan (Grant no. 2017FA050), és a Dali University Innovation Team of Advanced Pharmaceutics of Entomological Bio-Pharmacy R&D (ZKLX2019101 számú támogatás).