Alai

A hőmérsékleti tartomány meghatározása

A Macrostomum lignano kultúrák esetében a következő általános laboratóriumi körülmények uralkodnak: 20 °C hőmérséklet, 60% páratartalom és 14 óra/10 óra világos/sötét ciklus. Ezeket a feltételeket elsősorban azért választottuk, mert ezek optimálisak a Nitzschia curvilineata nevű diatóma növekedéséhez, amely a férgek fő táplálékforrása . A kísérletben alkalmazható hőmérsékleti feltételek felméréséhez először megállapítottuk azt a hőmérsékleti tartományt, amelyben a férgek túlélnek. Míg a férgek fagyasztása halálosnak bizonyult, 4 °C-on tartva legalább két hétig életben tudtak maradni. Mivel azonban a diatóma nem nő ilyen körülmények között, úgy döntöttünk, hogy a 4 °C-ot kizárjuk a további kísérletekből. A 20 °C alatti egyéb hőmérsékleteket szintén kizártuk a kísérletből, mivel a vizsgálat elsődleges célja a növekedést és fejlődést felgyorsító körülmények megtalálása volt. A hőmérsékleti spektrum másik oldalán a férgek feloldódtak, ha 42 °C-on tartottuk őket két órán keresztül, és elpusztultak, miután egy hétig 37 °C-on tenyésztettük őket. Ezért úgy döntöttünk, hogy 20 °C, 25 °C, 30 °C és 35 °C kísérleti körülményeket használunk a M. lignano hosszú távú hőmérsékleti hatásainak vizsgálatához (1. ábra).

Hősokkválasz

Azért, hogy megvizsgáljuk, melyik hőmérséklet indukál stresszválaszt a férgekben, a hősokk 20 promóter (Mlig-hsp20) aktivitását figyeltük. Először kvantitatív RT-PCR-t végeztünk az Mlig-hsp20 expressziós szintjének mérésére 20 °C, 25 °C, 30 °C, 33 °C, 34 °C és 35 °C hőmérsékleten. Nem volt jelentős különbség a Hsp20 expressziós szintjében 20 °C és 25 °C között (2a. ábra). Ugyanakkor 30 °C-on a 20 °C-hoz képest kis mértékű (2-szeres), de szignifikáns (P = 0,027, t-próba) expressziónövekedés volt megfigyelhető (2a. ábra). Az expressziós szint több mint tízszeres növekedését figyeltük meg 33 °C-on, ami a legmagasabb vizsgált hőmérsékleten, 35 °C-on több mint 100-szorosra nőtt (2a. ábra). A második vizsgálatban az mScarlet-I fehérjét az Mlig-hsp20 promóter kontrollja alatt expresszáló transzgenikus vonalat hoztunk létre (2b. ábra), és mértük a fluoreszcencia szintjét 24 órával a 20 °C-tól 37 °C-ig terjedő különböző hőmérsékleteken végzett 2 órás inkubáció után (2c., d. ábra). A fluoreszcencia több mint kétszeres és tízszeres növekedését figyeltük meg 34 °C-on, illetve 37 °C-on (2c. ábra).

Az embrionális fejlődés sebessége

Morris és munkatársai szerint a Macrostomum peték teljes kifejlődése körülbelül 120 óráig (öt napig) tart, ha a petéket 20 °C-on tartják. Annak vizsgálatára, hogy a hőmérséklet hogyan befolyásolja az embriófejlődés és a kelés sebességét, frissen lerakott embriókat vettünk ki, és különböző hőmérsékleteken követtük a fejlődésüket a kelésig. A genetikai háttérből adódó esetleges különbségek vizsgálatához két olyan M. lignano vonalat használtunk, amelyeket jelenleg a M. lignano tanulmányok többségében használnak, a DV1 és az NL10 vonalakat. Ezek a vonalak egymástól függetlenül ugyanarról a földrajzi helyről származó vad típusú populációkból származnak, és egy teljes kromoszóma duplikációban különböznek, de egyébként laboratóriumi körülmények között nagyon hasonlóan viselkednek. Először az alacsony hőmérséklet hatását vizsgáltuk. 4 °C-on a peték fejlődése leáll, és legalább egy hónapig tárolhatók, majd magasabb hőmérsékletre visszatérve újraindul a fejlődésük. Ezután azt vizsgáltuk, hogy 20 °C és 35 °C közötti hőmérsékleten milyen gyorsan fejlődnek a tojások. Amint a 3. ábrán látható, standard körülmények között (20 °C) tartva a tojások hat nap után kezdtek kikelni. A hőmérséklet emelése arányosan gyorsabb embrionális fejlődést és korábbi kikelést eredményezett, ami 35 °C-on kétszer gyorsabb volt, mint 20 °C-on, és csak három napig tartott. Megjegyzendő, hogy 20 °C-on a tojások mintegy 10%-a nem kelt ki nyolc napos inkubáció után, szemben a magasabb hőmérsékleten mért kevesebb mint 5%-kal, ami arra utal, hogy még a legmagasabb vizsgált 35 °C-os hőmérsékletnek sincs káros hatása az embriók túlélésére.

Szaporodás

A szaporodási sebesség nagyon fontos tényező egy modellorganizmus esetében, mivel a rövidebb generációs idővel rendelkező állatok gyorsabb adatgenerálást tesznek lehetővé a genetikai kísérletek során. Emellett, ha az állatok nagyszámú utódot hoznak létre, a generált adatok a legtöbb esetben nagyobb statisztikai erővel rendelkeznek.

A hőmérsékletnek a M. lignano szaporodási sebességére gyakorolt hatásának felmérésére összehasonlítottuk a különböző hőmérsékleti körülmények között tartott férgek által öt hét alatt létrehozott utódok számát. A kísérletet kikelésekkel kezdtük, hogy a posztembrionális fejlődést is bevonjuk a vizsgálatba, és mind a DV1, mind az NL10 vonalat használtuk. Mindkét vonal keltetőinek három hétre volt szükségük ahhoz, hogy 20 °C-on növekedjenek és létrehozzák az első utódokat, míg 25 °C-on az NL10 vonal esetében két hét alatt keltek ki, a DV1 esetében azonban nem. 30 °C-on és 35 °C-on mindkét vonal már két hét után utódokat hozott létre (4. ábra). Három héttől kezdve a hetente előállított keltető egyedek száma a 20 °C-os hőmérsékleten 200 alatti értékről több mint 300-ra nőtt 20 °C feletti hőmérsékleten; a keltető egyedek száma a 30 °C-on tartott férgek esetében volt a legmagasabb. Ez mindkét genetikai háttérre igaz volt, és a DV1 és NL10 vonalak között nem tapasztaltunk jelentős különbségeket (4. ábra).

A 30 °C-os és magasabb hőmérséklet ugyan több keltetést eredményezett, de egyúttal hősokkválaszt is aktivál (2. ábra). A megemelt hőmérséklet hosszú távú hatásának és az általa a férgekre gyakorolt esetleges stresszhatásoknak a vizsgálatára a férgeket a kiválasztott hőmérsékleten tartottuk, és három, illetve hat hónapos tenyésztés után morfológiai eltéréseket figyeltünk meg. A 25 °C-on tartott férgek mindkét vizsgálati időpontban nem mutattak morfológiai elváltozást a 20 °C-on tartott férgekhez képest (5. ábra). Azonban mind a 30 °C-os, mind a 35 °C-os hőmérsékleti körülmények között az általános morfológiában különböző eltéréseket figyeltek meg. Három hónap elteltével mind a DV1, mind az NL10 vonalaknál általában megnövekedett ciszták száma, sérült szövetek és megnagyobbodott herék voltak jelen (5. ábra). A 35 °C-on tartott férgek egyike sem maradt életben a hat hónapos ellenőrzési pontig, és a 30 °C-on túlélő férgek mindegyike mutatott morfológiai eltéréseket (5. ábra). Ezért a 30 °C feletti hőmérsékletnek való tartós kitettség káros az M. lignano számára.

Regenerációs idő

Mivel a M. lignano mint modellorganizmus fő vonzereje a regenerációs képessége, a következőkben azt vizsgáltuk, hogyan befolyásolja a hőmérséklet a regenerációt. Általánosan elfogadott, hogy a magasabb hőmérséklet az általános metabolikus aktivitás növekedéséhez vezet . Annak értékeléséhez, hogy a hőmérséklet milyen hatással van a féreg testének teljes regenerációjához szükséges időre a herék régió feletti amputáció után, nyomon követtük a herék regenerációját és a spermiumok megjelenését a vesicularis seminalisban egy korábban létrehozott NL22 transzgenikus vonal segítségével, amely GFP-t expresszál a here- és spermaspecifikus ELAV promóter ellenőrzése alatt . Egy ilyen transzgenikus marker használata nagyobb pontosságot, következetességet és hatékonyságot biztosít a regeneráció mértékének vizsgálatában. Valóban nem észleltünk jelentős eltérést, amikor a GFP jel megjelenésének idejét vizsgáltuk az amputációt követően valamennyi vizsgált hőmérsékleten (1. táblázat).

Amint az várható volt, a regeneráció sebessége nőtt a hőmérséklettel (1. táblázat). Ha a 20 °C-os regenerációs időt tekintjük standard sebességnek, akkor a herék regenerációjára a számított hőmérsékleti együtthatók 25 °C-on Q10 = 4, 30 °C-on és 35 °C-on pedig Q10 = 3. A hőmérsékleti együttható a következő. Ez azt mutatja, hogy a legnagyobb hatást a hőmérséklet 25 °C-ra történő emelésével érjük el, és a leggyorsabb regeneráció 30 °C-on történik, anélkül, hogy a megnövelt hőmérséklet további előnyökkel járna a regenerációs időre. Ezért a M. lignano regenerációs kísérletek során a 25 °C és a 30 °C hőmérsékletet kell figyelembe venni, mivel ez két-háromszorosára rövidíti a kísérlet időtartamát (1. táblázat).

RNS interferencia

A génexpresszió RNS interferenciával (RNAi) történő leállítása jelenleg az elsődleges megközelítés a M. lignano funkcióvesztéses vizsgálataiban. Ebben a megközelítésben az állatokat a célgénnel szemben kettős szálú RNS-sel áztatják, és gyakran több héten át tartó, hosszan tartó kezelésre van szükség a fenotípus megfigyeléséhez . Megvizsgáltuk, hogy a hőmérséklet hogyan befolyásolja a fenotípus kialakulásának sebességét az RNSi kezelés hatására. Ehhez leütöttük az Mlig-ddx39-et, egy olyan gént, amely a sejtproliferációban betöltött funkciójáról ismert az M. lignano-ban, és robusztus letális knockdown fenotípust mutatott . A szaporodási teszthez hasonlóan ehhez a kísérlethez is a DV1 és NL10 vonalakat használtuk (2. táblázat). 20 °C-on az Mlig-ddx39 knockdown után körülbelül 20 nap kellett ahhoz, hogy az összes állat elpusztuljon. Ha a férgeket magasabb hőmérsékleten tartottuk, az elpusztulás gyorsabban következett be: 25 °C-on tartott férgek esetében 11, 30 °C-on tartott férgek esetében pedig 8 nap alatt. A kísérlethez használt két törzs között nem volt látható különbség (2. táblázat). Ezután megvizsgáltuk, hogy a ddx39 RNSi fenotípus megnyilvánulásának megfigyelt gyorsulása magasabb hőmérsékleten az RNSi általi génkiütés nagyobb hatékonyságának vagy más tényezőknek tudható-e be. Ehhez qRT-PCR segítségével megmértük az Mlig-ddx39 transzkriptek abundanciáját az RNAi kísérlet megkezdése utáni különböző időpontokban, különböző hőmérsékleteken (6. ábra). Referencia kontrollként a gfp elleni dsRNS-sel kezelt állatokat használtuk. Az Mlig-ddx39 expressziós szintjében valamennyi vizsgált hőmérsékleten nem észleltünk szignifikáns eltérést a kontrollminták között a kísérlet során (6. ábra). Ugyanakkor az Mlig-ddxx39 dsRNS-sel kezelt állatok esetében a ddx39 transzkriptumok szintjének ~ 80%-os csökkenése volt megfigyelhető már egy nap kezelés után 20 °C-on vagy 25 °C-on, és még nagyobb, ~ 90%-os csökkenés 30 °C-on. A következő napokban azonban a knockdown szintje minden hőmérsékleten 95% körül stabilizálódott. Ebből arra következtetünk, hogy magát az RNSi kinetikáját nem befolyásolja jelentősen a hőmérséklet. Ehelyett az Mlig-ddx39 RNAi fenotípus megnyilvánulásának megfigyelt lerövidülése magasabb hőmérsékleten a sejtek megnövekedett fluktuációjával magyarázható.

Az RNAi fenotípusok fokozott hőmérsékleten történő kialakulásának felgyorsulása általánosítható-e más génekre, ezért megvizsgáltuk az Mlig-sperm1 gént, amelynek knockdownja rendellenes spermiummorfológiához és megnagyobbodott herékhez vezet . Ez egy lassú RNAi fenotípus, amelynek kialakulása 20 °C-on 2-3 hétig tart . A fenotípus mértékének számszerűsítése érdekében a különböző hőmérsékleteken az RNSi kezelés 4. napján megszámoltuk azon állatok hányadát, amelyek heréi olyan mértékben megnagyobbodtak, hogy egymáshoz értek. (7. ábra). Az Mlig-ddx39 RNSi esetében kapott eredményekhez hasonlóan a magasabb hőmérséklet a fenotípus gyorsabb kifejlődését eredményezte, és míg 20 °C-on négy napos dsRNS-kezelés után 20 °C-on nem volt megfigyelhető kellően megnagyobbodott here, addig 25 °C-on az állatok 25, 30 °C-on pedig 85%-ánál alakultak ki megnagyobbodott herék (2. táblázat). Ezért a regenerációhoz hasonlóan az RNSi fenotípusok a M. lignano esetében is gyorsíthatók a hőmérséklettel, és a magasabb hőmérséklettel lerövidíthető a kísérletek időtartama.