Alai

Axiális kromatinmentes üregek olyan növényekben jelennek meg, amelyek átlagos 2C DNS-tartalma meghaladja a 0-t.8 pg per kromoszóma

A növények egy részének kromoszómái az axiális régiókban kromatinmentes üregeket tartalmaznak, amelyek megkülönböztetik ezeket a növényeket az eddig vizsgált növények és állatok többségétől (1a, b ábra). Tudomásunk szerint az ilyen kromoszómaszerveződést leíró beszámolók a nagy genommal rendelkező növényekre korlátozódnak, és feltételezhető, hogy ez a morfológiai szerveződés ezekre a növényekre jellemző sajátosság. Ennek a feltételezésnek a megbizonyosodása érdekében 12 fajból származó anafázis és telopházis kromatidákat is elemeztünk elektronmikroszkópiával (1. táblázat; 1a, b ábra; Additional file 1: S1 ábra). Az 1c. ábrán látható, hogy axiális kromatinmentes üregek csak a nagy genommal rendelkező és a nagy kromoszómákkal rendelkező növények kromoszómáin belül voltak egyértelműen láthatók, de úgy tűnt, hogy az átlagos kromoszómaméret jobban korrelált ezen üregek jelenlétével vagy hiányával. Az axiális üregekkel rendelkező növények közül a Hordeum vulgare rendelkezett a legkisebb genommal és a legkisebb átlagos 2C DNS-tartalommal kromoszómánként (0,79 pg). Ez a kromoszómaszerveződés tehát a növényi kromoszómák jellemzője, amelyek 2C DNS-tartalma nagyjából úgy becsülhető, hogy meghaladja a kromoszómánkénti 0,8 pg-ot.

A kromoszómák kondenzációja/dekondenzációja láthatóvá tehető félvékony N. damascena sejtek 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) festést követően

A növényi kromoszómák vizsgálatára legalkalmasabb objektum, a gyökér apikális merisztéma, a fókuszon kívüli fluoreszcencia miatt nem teszi lehetővé nagy felbontású képek készítését. Itt egy olyan módszert alkalmaztunk, amely az LR White táptalajba ágyazott gyökerek félvékony (200-250 nm) metszeteinek alkalmazásán alapul. E metszetek vastagsága még konfokális mikroszkóp használata esetén is jelentősen kisebb volt, mint az optikai metszeteké. A különböző mitotikus stádiumban lévő sejtek azonosítását lehetővé tevő morfológiai jellemzők megtalálásához a DAPI-val festett sejtek morfológiáját elemeztük.

A N. damascena kromoszómaszerveződésében több olyan átalakulás is megfigyelhető volt, amely fluoreszcens mikroszkóp alatt is jól látható volt. A korai profázisú sejtmagok belsejében vékony kromoszómák (kb. 0,6 μm átmérőjű) részei voltak láthatók (2a. ábra). A középső profázisban vastagabb profázis kromoszómák (kb. 1,2 μm) alakultak ki, amelyek belsejében vékonyabb szálak jelenlétét lehetett megkülönböztetni, amelyek valószínűleg a hajtogatott korai profázis kromoszómáknak feleltek meg (2b. ábra). A késői profázis (2c. ábra), metafázis (2d. ábra) és anafázis (2e. ábra) kromoszómák sűrűn kondenzáltak voltak, és belső szerveződés nem volt kimutatható. A delofázisban történő dekondenzáció során a kb. 0,4 μm átmérőjű kromatinrostok szétválása kromatinmentes üregek megjelenéséhez vezetett a kromatidák axiális régióiban (2f. ábra), amelyek mérete a delofázis során fokozatosan nőtt (2g. és h. ábra). A kromatinrostok átmérője a telopáziás kromoszómákban a korai profázis kromoszómák méretéhez volt hasonló. Így az N. damascena minden mitotikus fázisa könnyen kimutatható volt a DAPI-val festett félvékony metszeteken.

A mitózis alatti kromoszóma-kondenzáció/dekondenzáció 5-etinil-2′-deoxiuridin (EdU) beépülést követően elemezve

A profázis során a vékony korai profázis kromoszómák vastag késői profázis kromoszómákká alakultak át. A profázis kromoszómák megvastagodása vagy a korai profázis kromoszóma hajtogatásának, vagy fokozatos megvastagodásának eredménye lehet. E két lehetséges mechanizmus vizsgálatához szükséges volt a korai profázisú kromoszómák belsejében lineárisan elhelyezkedő diszkrét kromoszómafókuszok jelölése, majd ezek térbeli átrendeződésének elemzése a profáziskondenzáció során. Amint a 3a. ábrán látható, a korai profázisból a késői profázisba való átmenet során az ilyen fókuszok vagy elveszítik lineáris elrendeződésüket (összecsukódás), vagy megtartják lineáris elrendeződésüket, és vékony sávokká nyúlnak (megvastagodás). A kromoszómarégiók jelölésére a kromatinba a replikáció során a szintetikus nukleotidot, az EdU-t építettük be, amely click-kémiával kimutatható.

Az EdU-t 30 percig építettük be a N. damascena gyökerekbe, majd különböző üldözési időszakok (2 és 14 óra között) után elkészítettük a kromoszómaszórásokat. A kromoszómák jelölésének három mintázatát észleltük: a diszkrét régiók jelölését (1. minta), a kromoszómakarok jelölését, de a centromerekét nem (2. minta), valamint a kromoszómakarok és a centromerek jelölését egyaránt (3. minta) (3b. ábra). Az 1. minta gyakrabban volt megfigyelhető 4 órával az EdU beépítése után, ami azt jelzi, hogy ez a jelölés a késői S-fázisra jellemző (3c. ábra; Additional file 2: S2 ábra). Az 1. mintázat esetében a homológ kromoszómák jelölése hasonló volt (Additional file 3: S3 ábra), ami az EdU beépülés specifikus mintázatára utal. A kromoszóma karok az S-fázis fennmaradó részében jelölve voltak (2. és 3. minta), de a centromerikus régiók is jelölve voltak körülbelül a korai és késői S-fázis közötti határon (3. minta) (3c. ábra).

A korai és késői profázis közötti átmenetet olyan kromoszómák segítségével elemeztük, amelyekben a későn reprodukálódó kromatin jelölve volt (3. minta). A korai profázisú kromoszómákban a jelölt régiók lineárisan oszlottak el a vékony kromoszómák mentén (4a. ábra). A késő profázisú kromoszómákban, amelyek a korai profázisúakhoz képest nagyjából kétszer olyan vastagok voltak, a jelölt régiók elvesztették lineáris eloszlásukat (4b. ábra). Ez a megfigyelés nem volt teljesen érvényes, mivel a profázis és metafázis kromoszómák két kromatidából állnak, amelyek fokozatosan szegregálódnak , és ez a jelölt régiók lineáris eloszlásának elvesztéséhez vezethet. Ezért tovább elemeztük az anafázis kromatidákat (azaz a kromatidák szegregációja után teljesen tömörített kromoszómákat). A késői profázis kromoszómák átmérőjével nagyjából megegyező átmérőjű anafázis kromatidákban a jelölt kromatin régiók nem lineárisan helyezkedtek el, hanem eloszlottak a kromatidák térfogatában (4c. ábra). Telofázisban a kromatinmentes üregek jól láthatóak voltak a kromatidák axiális régióiban, lehetővé téve a kromatinrostok kimutatását, amelyeken belül a jelölt régiók lineárisan helyezkedtek el (4d. ábra). A korai profázisból a késői profázisba való átmenet során tehát a korai profázis kromoszómáinak hajtogatása megtörtént. Ez az eredmény összhangban van a DAPI-val festett középső profázisú kromoszómák megfigyeléseivel (2b. ábra), amelyek belsejében jól láthatóak voltak a hajtogatott vékony rostok.

A kromoszómák mitózis alatti kondenzációja/dekondenzációja elektronmikroszkópiával elemezve

A kromatinrostok belső szerveződésének kimutatására, amelyek hajtogatását fénymikroszkópiával írtuk le, elektronmikroszkópiát használtunk. A kromatin fibrilláris alstruktúrák kimutatásához és méréséhez kromatinmentes üregeket elemeztünk, amelyek feltételezésünk szerint elválasztották a kromatinrostokat (Additional file 4: Figure S4; 2. táblázat).

Az interfázisú sejtmagokat vastag, 234 ± 49 nm-es (átlag ± S.D.) rostok hálója töltötte ki (5a. ábra), amelyeket “interfázisú kromonémák”-nak nevezhetünk, amint azt máshol tárgyaltuk . Az elektronmikroszkópia lehetővé tette a profázis kromoszóma-kondenzáció három szakaszának kimutatását, amelyek közül a legkorábbiat fénymikroszkópiával nem lehetett kimutatni, és itt “preprofázisnak” nevezzük. A második és a harmadik szakasz a korai és a késői profázisnak felelt meg, a fent leírtak szerint (2a. és c. ábra).

(1) A prefázisban a kromoszómák rosszul elkülönültek egymástól, és nem tudtuk pontosan megmérni az átmérőjüket (5b ábra). A preprofázis kromoszómákat 148 ± 30 nm átmérőjű rostok alkották (2. táblázat), amelyek valószínűleg megfeleltek a 100-130 nm átmérőjű rostoknak (kromonéma), amelyek az állati sejtekben a profázis és a telefázis kromoszómáinak fő kromoszóma-szubstruktúrája . Az adatok nem tették lehetővé az interfázis és a mitotikus kromonémák azonosságának megállapítását, de korábban közölt adatok arra utalnak, hogy az interfázis kromonémák hajtogatott kromonémákból képződött komplexek .

(2) A korai profázisban a kromoszómák szétválása történt (5c ábra). A kromoszómák átmérője 527 ± 107 nm volt, és ezeket a kromoszómákat is 158 ± 46 nm átmérőjű kromonémák alkották.

(3) Végül a késői profázisú sejteket elemeztük, amelyek 809 ± 185 nm átmérőjű megvastagodott kromoszómákat tartalmaztak (5d. ábra). Néhány késői profázisú kromoszóma a tengelyes régiókban üregeket tartalmazott, amelyek lehetővé tették számunkra a 285 ± 102 nm átmérőjű rostok megkülönböztetését (“300 nm-es rost”). A jelölt kromoszómaszegmensek felhasználásával végzett elemzés azt mutatta, hogy a korai profázis kromoszómák összecsukódtak, hogy vastagabb késői profázis kromoszómákat alkossanak (4. ábra). Ezért feltételezhető, hogy a 285 ± 102 nm-es rostok és az 527 ± 107 nm-es korai profázis kromoszómák ugyanazok a rostok voltak. A rostok csökkent átmérője összefügghet a korai profázis kromoszómák kromatinjának tömörödésével, amit a látható kromonémák eltűnése is jelzett.

A metafázis kromoszómák (5e. ábra) és az anafázis kromatidák (6a. ábra) belsejében lévő kromatin erősen tömörödött volt, és bár ritka kromatinmentes üregek voltak láthatóak bennük, az esetleges fibrilláris szubstruktúrák pontos megkülönböztetése lehetetlen volt. A korai telopházi kromoszómákban kétféle üregtípus egyértelműen kimutatható volt (6b. ábra). A nagy üregek a kromatidák axiális régiójában helyezkedtek el, lehetővé téve a 422 ± 78 nm átmérőjű rostok azonosítását és mérését. E rostok központi régióiban kis üregeket detektáltunk, amelyek lehetővé tették egy második típusú, 182 ± 47 nm átmérőjű rost azonosítását. Az előbbi típusú rostok megfelelhetnek a késői profázisú kromoszómák belsejében található “300 nm-es rostoknak”, a második típus pedig a kromonémáknak.

A késői telopfázisban (6c. ábra) és a G1-fázisban (6c. ábra) a kromoszómák kromoszómafázisa és a G1-fázisban (6c. ábra). 6d), a kromoszómák dekondenzálódtak kromoszóma-doménekké a leánymagokban, ahol nem lehet őket könnyen megfigyelni. Ennek ellenére sikerült azonosítani a szétválasztott kromatidafragmentumokat. Ebben a szakaszban a kromatidák körülbelül 250 nm átmérőjű szálakból álltak, ami nagyjából megfelel az interfázisú kromoszómák átmérőjének. Ez a megfigyelés a kromonémaszálak eltűnése mellett azt jelezte, hogy a mitózisnak ebben a szakaszában a kromatinszálak újrahajtogatódtak, hogy kondenzált kromatinból álló interfázisú komplexeket képezzenek.