Vírustörzsek
HCoV-229E (VR-740) és a HCoV-OC43 (VR-1558) törzseket emberi diploid tüdő MRC-5 fibroblasztokban (CCL-171) és WI-38 (CCL-75) szaporítottuk, (mindegyiket ATCC, Manassas, VA). Mindkét humán sejtvonalat 10% magzati szarvasmarha szérummal (FBS), 2 mM L-alanyl-L-glutaminnal, 100 U/ml penicillinnel és 100 μg/ml streptomicinnel (Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA) kiegészített MEM-ben tenyésztettük. A vírusfertőzési közeg MEM vagy RPMI-1640 és 2% hő inaktivált FBS volt a HCoV-229E és a HCoV-OC43 esetében. A vírustörzseket 80-90%-ban konfluens, 24 órás gazdasejteket tartalmazó lombikok beoltásával szaporítottuk. Egyórás inkubáció után a sejtmonoréteget mostuk és friss fertőzési tápfolyadékban inkubáltuk három vagy négy napig 35 °C-on a HCoV-229E és 33 °C-on a HCoV-OC43 esetében. A működő vírusállományt tartalmazó felülúszót ezután centrifugálással (300 g 15 percig) gyűjtöttük össze. A vírus titerét 50%-os szövettenyésztési fertőző dózis TCID50 alapján határoztuk meg a citopátiás hatások (CPE) értékelésével, amelyeket fényes térmikroszkóppal (10×) a citoplazma vakuolizációjaként, a sejtek gömbölyödéseként és leválásaként pontoztunk.
Padi aeroszol besugárzókamra
Az aeroszol minták előállítására, expozíciójára és gyűjtésére egy egymenetes, dinamikus aeroszol/vírus besugárzókamrát használtunk a korábban leírtak szerint23. A vírusos aeroszolokat vírusoldat hozzáadásával állítottuk elő egy nagy teljesítményű, kiterjesztett aeroszolos légzésterápiás porlasztóban (Westmed, Tucson, AZ), amelyet 11 L/perc bemeneti áramlási sebességű légszivattyúval működtettünk. A vírus a kamrába áramlott, és száraz és párásított levegővel kevertük, hogy a páratartalmat körülbelül 50-70% között tartsuk. A relatív páratartalmat, a hőmérsékletet és az aeroszol részecskeméret-eloszlást a működés során végig figyelemmel kísérték. Az aeroszolt távoli UV-fénynek tettük ki, és végül BioSampler (SKC Inc., Eighty Four, PA) segítségével gyűjtöttük össze.
A távoli UV-lámpát az UV-expozíciós kamrától kb. 22 cm távolságra helyeztük el, és a 26 cm × 25,6 cm × 254 μm-es UV-sugárzó műanyag ablakra irányítottuk (TOPAS 8007 × 10, TOPAS Advanced Polymers Inc., Florence, KY). Az ezzel a kamrával23 végzett korábbi kísérleteinkkel összhangban az áramlási sebesség a rendszeren keresztül 12,5 L/perc volt. Az UV-expozíciós terület térfogata 4,2 l volt, így minden egyes aeroszol körülbelül 20 másodpercig volt exponálva, miközben áthaladt az ablakon. A teljes besugárzókamra egy 2-es biológiai biztonsági szintű szekrényben volt elhelyezve, és minden levegő be- és kimeneti nyílást HEPA-szűrőkkel (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA) láttak el, hogy megakadályozzák a nem kívánt szennyeződés be- és kilépését a rendszerből.
Sugárzókamra teljesítménye
A testre szabott besugárzókamra az emberi köhögés és légzés útján keletkező aeroszolos vírusok átvitelét szimulálta. A kamra átlagosan 66%-os relatív páratartalom és 24 °C-os átlaghőmérséklet mellett működött minden futtatás során. Az átlagos részecskeméret-eloszlás 83%-ban 0,3 μm és 0,5 μm között, 12%-ban 0,5 μm és 0,7 μm között és 5%-ban >0,7 μm között volt (3. táblázat). Az aeroszolizált vírusok hatékonyan terjedtek át a rendszeren, amint azt a kontroll (nulla expozíció) is bizonyítja, amely egyértelmű vírusintegrációt mutatott (2. és 3. ábra, bal felső panel).
Távoli UVK-lámpa és dozimetria
Az ebben a vizsgálatban használt távoli UVK-forrás egy 12 W-os, 222 nm-es KrCl-excimer lámpa modul volt, amelyet a USHIO America gyártott (cikkszám: 9101711, Cypress, CA). A lámpa saját fejlesztésű optikai szűrőablakkal van ellátva, amely csökkenti a 222 nm-es KrCl emissziós csúcson kívüli lámpaemissziót. A lámpát az expozíciós kamra ablakától 22 cm-re helyeztük el, és az ablak közepére irányítottuk. Az optikai teljesítményméréseket egy 818-UV/DB kis teljesítményű, UV-erősített szilícium fotodetektorral és egy 843-R optikai teljesítménymérővel (Newport, Irvine, CA) végeztük. A kísérlet megkezdése előtt dozimetriát végeztünk, hogy megmérjük a kamrán belüli fluenciát az aeroszol helyén.
A lámpa és a besugárzókamra közötti távolság lehetővé tette, hogy egyetlen lámpa egyenletesen besugározza a teljes expozíciós ablak területét. A szilícium-fotodetektorral végzett mérések körülbelül 90 μW/cm2 -es expozíciós intenzitást jeleztek az expozíciós területen. A kamra az expozíciós ablakkal szemben fényvisszaverő alumínium felülettel van ellátva. Az ezzel a kamrával végzett korábbi munkáinkhoz23 hasonlóan ennek a felületnek a visszaverő képessége körülbelül 15% volt. Ezért az intenzitást a teljes expozíciós területen óvatosan 100 μW/cm2 -re becsültük. Az ablaktól 22 cm-re elhelyezett lámpával és az aeroszol részecskének az expozíciós ablakon való áthaladásához szükséges 20 másodpercet figyelembe véve, a részecske teljes expozíciós dózisát 2 mJ/cm2 -nek számítottuk. A különböző expozíciós körülmények megteremtése érdekében további, UV-sugárzást áteresztő műanyag ablakokat használtunk az intenzitás egyenletes csökkentésére az expozíciós tartományban. Míg korábbi munkáink során ezekkel a lapokkal 65%-hoz közelebbi áteresztőképességet mértünk23 , e vizsgálatok során az egyes lapok 222 nm-es áteresztőképességét körülbelül 50%-osnak mértük. Az áteresztőképesség csökkenése valószínűleg a műanyag idővel bekövetkező fotodegradációjának köszönhető4. Az expozíciós ablakot fedő egy vagy két műanyaglap hozzáadása az expozíciós dózist 1, illetve 0,5 mJ/cm2 -re csökkenti.
Kísérleti protokoll
A korábban leírtak szerint23 a vírusoldat a porlasztóban 1 ml 107-108 TCID50 koronavírust tartalmazó módosított Eagle’s Medium (MEM, Life Technologies, Grand Island, NY), 20 ml deionizált víz és 0,05 ml Hank’s Balanced Salt Solution with calcium and magnnesium (HBSS++) volt. A besugárzókamrát úgy működtettük, hogy minden egyes mintavétel előtt 5 percig aeroszolizált vírusrészecskék áramlottak a kamrán és a bypass csatornán keresztül a kívánt RH-érték beállítása érdekében. A mintavételt a levegő áramlásának a bypass-csatornából a BioSamplerbe történő megváltoztatásával kezdeményezték a háromutas szelepek segítségével. A BioSamplerbe kezdetben 20 ml HBSS++-t töltöttünk az aeroszol felfogásához. Minden egyes mintavételi idő alatt, amely 30 percig tartott, a besugárzókamra belsejét a műanyag ablakon keresztül bejutó 222 nm-es távoli UVC fénynek tettük ki. Az aeroszol részecskékre jutó távoli UV-UVC-dózis variálása a fent leírtak szerint további UV-transzparens műanyag fóliák behelyezésével történt, így a három vizsgálati dózis 0,5, 1,0 és 2,0 mJ/cm2 volt. A nulla dózisú kontrollvizsgálatokat kikapcsolt excimerlámpával végezték. A mintavételi időszak befejezése után a BioSamplerből származó oldatot a vírusfertőzőképesség-vizsgálatokhoz használtuk.
Vírusfertőzőképesség-vizsgálatok
TCID50
A vírusfertőzőképesség meghatározásához az 50%-os szövettenyésztési fertőződózis-vizsgálatot használtuk28. Röviden, a kísérletet megelőző napon 105 gazdasejtet telepítettünk 96 lyukú lemezek minden egyes lyukába. A sejteket kétszer mostuk HBSS++-ban, majd a BioSamplerből származó exponált vírus 1:10 arányú sorozatos hígításait fertőzési tápfolyadékban két órán keresztül a sejtekre helyeztük. Ezután a sejteket kétszer mostuk HBSS++-ban, friss fertőzési tápfolyadékkal fedtük le, és 34 °C-on három vagy négy napig inkubáltuk. A citopátiás hatásokat (CPE) fényes térmikroszkóppal (10×) a citoplazma vakuolizációjaként, a sejtek gömbölyödéseként és leválásaként értékeltük. A TCID50-et a Reed és Muench módszerrel28,38 számoltuk ki. A CPE-pontszámok megerősítéséhez a mintákat öt percig 100%-os metanolban fixáltuk, majd 0,1%-os kristályviolettel festettük. Az eredményeket a plakkképző egységek (PFU)/ml becsült értékeként adtuk meg a PFU/ml = 0,7 TCID50 átváltás segítségével, a Poisson-eloszlás29 alkalmazásával.
Immunfluoreszcencia
Annak felmérésére, hogy a 222 nm-es fény növekvő dózisai csökkentik-e a fertőzött sejtek számát, standard fluoreszcens immunfestési protokollt végeztünk a vírus antigénjének kimutatására a gazdaszervezet humán sejtjeiben23. Röviden, a kísérletet megelőző napon 2 × 105 gazdasejtet (MRC-5 sejteket a HCoV-229E és WI-38 sejteket a HCoV-OC43 esetében) ültettünk 48 lyukú lemezek minden egyes lyukába. Miután 30 percig átfutottunk a besugárzókamrán, 150 μl BioSamplerből gyűjtött vírusszuszpenziót helyeztünk a gazdasejtek monorétegére. A sejteket egy órán át inkubáltuk a vírussal, majd háromszor mostuk HBSS++-mal, majd egy éjszakán át inkubáltuk friss fertőzési tápfolyadékban. A fertőzött sejteket ezután 100%-os jéghideg metanolban 4 °C-on 5 percig fixáltuk, majd az anti-humán koronavírus spike glikoproteinnel (40021-MM07, Sino Biologicals US Inc., Chesterbrook, PA) 1:200 HBSS++-ban, amely 1% szarvasmarha szérumalbumin (BSA; Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA) 1%-os szarvasmarha szérumalbumin-tartalmú HBSS++-t tartalmazott, szobahőmérsékleten egy órán keresztül, enyhe rázogatás mellett jelöltük. A sejteket háromszor mostuk HBSS++-ban, majd 1% BSA-t tartalmazó HBSS++-ban 1:800 arányban kecske anti-egér Alexa Fluor-488-zal (Life Technologies, Grand Island, NY) jelöltük, szobahőmérsékleten, 30 percig sötétben, enyhe rázogatás mellett. Három HBSS++-ban történő mosást követően a sejteket DAPI-t (4′,6-diamidino-2-fenilindol) tartalmazó Vectashielddel (Vector Laboratories, Burlingame, CA) festettük meg, és egy Photometrics PVCAM nagy felbontású, nagy hatékonyságú digitális kamerával és Image-Pro Plus 6.0 szoftverrel (Media Cybernetics, Bethesda, MD) felszerelt Olympus IX70 fluoreszcens mikroszkóp 10× objektívjével figyeltük meg. Minden egyes 222 nm-es dózis és vírusfaj esetében a reprezentatív eredményeket kétszer megismételtük. Minden egyes minta esetében legfeljebb tíz látómezőt rögzítettünk az egyesített DAPI és Alexa Fluor-488 képekből.
Adatelemzés
A vírus túlélő frakcióját (S) úgy számoltuk ki, hogy a PFU/ml frakciót minden egyes UV-dózisnál (PFUUV) elosztottuk a nulla dózisnál (PFUcontrols) mért frakcióval: S = PFUUV/PFUcontrols. A túlélési értékeket minden egyes megismételt kísérletre kiszámítottuk és természetes log (ln) transzformáltuk, hogy a hibaeloszlást a normálishoz közelítsük39. Az R 3.6.2 szoftverben robusztus lineáris regressziót végeztünk az IWLS (iterated re-weighted least squares)40,41 segítségével, ezeket a normalizált ln értékeket függő változóként, az UV-dózist (D, mJ/cm2 ) pedig független változóként használva. Ezzel a megközelítéssel a vírus túlélését elsőrendű kinetikával írták le az egyenlet4 szerint:
ahol k az UV-inaktivációs sebességállandó vagy érzékenységi tényező (cm2/mJ). A regressziót úgy végeztük el, hogy a metszőtermet nullára állítottuk, ami a 100%-os relatív túlélés definícióját jelenti nulla UV-dózis mellett, külön-külön minden vizsgált vírustörzsre. A nulla dózisú adatokat, amelyek definíció szerint ln = 0-t jelentenek, nem vettük figyelembe a regresszióban. Az egyes vírustörzsek k paraméterére vonatkozó bizonytalanságokat (95%-os konfidenciaintervallum, CI) bootstrappinggel becsültük meg minden egyes regressziós módszer esetében, mivel a bootstrapping az aszimptotikus normalitáson alapuló szokásos analitikus közelítéshez képest reálisabb bizonytalansági becsléseket eredményezhet az olyan kis adathalmazok esetében, mint amilyeneket itt használtunk (n = 3 HCoV-229E és n = 4 a HCoV-OC43 esetében). Az illeszkedés jóságát a determinációs együtthatóval (R2) értékeltük. A reziduumok elemzését autokorreláció és heteroszkedaszticitás szempontjából a Durbin-Watson teszt42 és a Breusch-Pagan teszt (amelyet az lmtest R csomag valósított meg)43 segítségével végeztük el. Az egyes vírustörzsekre vonatkozó paraméterbecsléseket (k) a 95%-os CI-k alapján és közvetlenül t-próbával hasonlítottuk össze egymással, a mintanagyságok, k-értékek és standard hibáik felhasználásával. A vírus inaktiválási keresztmetszetét, D90, amely az az UV-dózis, amely a kitett vírus 90%-át inaktiválja, a D90 = – ln/k értéken számoltuk ki. A többi D értéket hasonlóan számították ki.