Alai

A vakuoláris ATPáz (V-ATPáz) egy több alegységből álló ATP-vezérelt protonpumpa, amely savasítja az intracelluláris vezikulákat és az extracelluláris miliőt, és ezáltal számos biológiai funkcióban vesz részt. Korábbi áttekintések elegánsan leírták a V-ATPáz szerkezetét és működését . Itt áttekintjük a V-ATPáz működésével és a normál fiziológiában a különböző sejtfolyamatokhoz való hozzájárulásával kapcsolatos legújabb irodalmat, különös tekintettel a rákra. Részletesen bemutatjuk a Notch és más jelátviteli utak V-ATPáz általi szabályozását is, feltárva a V-ATPáz egy eddig kevésbé ismert funkcióját a sejtek jelátvitelében.

Az alegység izoformái

Szerkezetileg a V-ATPáz egy forgó nanomotor, amely több alegységből áll, mindegyiknek több izoformája van . Az alegységek két doménben helyezkednek el: egy perifériás V1 doménben, amely az ATP-hidrolízisért felelős, és egy integrális membrándoménben VO, amely a protontranszlokációban működik. A V-ATPáz szerkezete nagymértékben konzerválódott az összes eukarióta sejt között, és fajonként különböző funkciókban vesz részt. Az emlősökben a V1 domén nyolc különböző alegységből áll (A, B, C, D, E, F, G és H), míg a VO domén hat különböző alegységből (a, c, c’, c”, d, e) . A V-ATPáz működését és szabályozását az intracelluláris vezikulák és az extracelluláris miliő savasodásának eltérő igénye irányítja. A szivattyú hatékonyságának csökkentése vagy növelése érdekében a V-ATPáz szabályozza az ATP-hidrolízis és a protonpumpálás közötti kapcsolást. Ezt a folyamatot a V-ATPáz “a” alegysége hozza létre. Hasonlóképpen a V-ATPáz sejt- és kompartment-specifikus célzása is az “a” alegység izoformáitól függ. A VOa egy 100 kDa-os integrális membránfehérje, N-terminális citoszolikus farokkal és 9 transzmembrán doménnel. Az “a” alegység négy izoformáját (a1, a2, a3 és a4) azonosították, amelyek eltérő vesikuláris és sejttípusú eloszlással rendelkeznek. A VOa1 a szinaptikus vezikulákon, a VOa2 pedig intracelluláris vezikulákon, például a golgi- és korai endoszómákon fejeződik ki. A VOa3 az oszteoklasztok plazmamembránján, míg a VOa4 a vese interkalációs sejtek plazmamembránján fejeződik ki. Továbbá, az “a” alegység N-terminálisa fontos motívum, amely a V1 domént a membránhoz köti, és a lizoszómákban egyedülálló pH-szenzornak is bizonyult. Az “a” alegység expressziója és izoforma-lokalizációja kritikus a V-ATPáz működése szempontjából .

A V-ATPáz fiziológiai funkciója

A V-ATPáz ubiquitikusan expresszálódik és a legtöbb szövet sejtjében változatos biológiai funkciókat lát el a vezikuláris, luminális és extracelluláris savasodás révén . Számos sejtfunkció elérése érdekében a V-ATPáz elősegíti a protonok lokalizált koncentrációját az endocitikus és exocitikus útvonalak savas vezikuláiban .

Vezikuláris savasodás

Endoszómák és lizoszómák

A V-ATPáz leginkább az intracelluláris vezikulák, mint az endoszómák és lizoszómák savasodásában betöltött szerepéről ismert. Az endoszómák felszínén a V-ATPáz savasítja és ezáltal modulálja az olyan fontos sejtfolyamatokat, mint a receptor-endocitózis és a vezikuláris kereskedelem . Az endoszómák V-ATPáz általi savasodása döntő fontosságú a receptor ligandum komplexek endocitikus internalizációjához. A jelátvitel megindulását követően az endoszómák alacsonyabb pH-ja felszabadítja a ligandumot, és visszavezeti azt a plazmamembránba . A lizoszómákban a V-ATPázok segítenek fenntartani az alacsony 4,5-es pH-t, és fontosak az újonnan szintetizált savas hidrolázok Golgiból a lizoszómákba történő szállításában is. Továbbá a makrofágokban és a tumorsejtekben lévő fagoszómák és autofagoszómák szintén a V-ATPáz által fenntartott savas pH-tól függenek az e kompartmentekben lévő lebontó enzimek aktivitása szempontjából .

Golgi

A golgi komplexben kezdődik az exocitikus és endocitikus gépezet rendezése. Fontos, hogy a legtöbb fehérje glikoziláción megy keresztül, ami egy döntő fontosságú poszttranszlációs módosítás a golgi apparátusban . A V-ATPáz a2 alegységének mutációi cutis laxát, egy autoszomális recesszív ráncos bőr szindrómát eredményeznek, amelyben az extra sejtmátrix fehérjék glikozilációjának károsodása figyelhető meg. Bár a V-ATPáz genetikailag korrelált a glikozilációs hibával, a golgi savasodás és a fehérjék érése közötti pontos kapcsolatot nem vizsgálták.

Specializált vezikulák

A V-ATPáz egy fontos fehérje, amely bizonyos sejttípusok specializált kompartmentumaiban fejeződik ki. A neurotranszmisszió során a V-ATPáz biztosítja a szinaptikus vezikulák kialakulásához és a neurotranszmitterek későbbi felhalmozódásához szükséges döntő proton-motiváló erőt . A hasnyálmirigy sejtjeiben a V-ATPáz függő savasodás fontos az inzulin exocitózisához . A V-ATPáz szabályozza a vezikuláris rendszer hasadás-fúzió egyensúlyát is a szolubilis NSF kötőfehérje receptorral (SNARE) és a GTPázzal való kölcsönhatás révén .

Luminalis savasodás

A V-ATPázokat kezdetben intracelluláris vezikulákon azonosították, de a plazmamembrán V-ATPázok jelentősége óriási mértékben nőtt . A vese proximális tubulusának hámsejtjeiben a V-ATPáz a4 izoformája tartja fenn a sav-bázis egyensúlyt és a vizelet savasodását (szisztémás acidózis) . Hasonlóképpen, a mellékhere tiszta sejtjeiben a plazmamembrán V-ATPáz savasítja a luminális kompartmentet és segíti a spermiumok érését és tárolását . A csontok oszteoklasztjaiban a lizoszomális V-ATPáz a csontreszorpció során a plazmamembránba transzlokálódik, hogy savasítsa a lacunákat . A plazmális V-ATPáz létfontosságú a fül interdentális sejtjeinek, az orr hámsejtjeinek és a látásnak a működéséhez . A V-ATPáz diszfunkciója olyan kóros állapotokhoz társul, mint a vese tubuláris acidózis, süketség, a szaglóérzékelés károsodása és csontritkulás A V-ATPáznak a vezikuláris és luminális savasodásban betöltött szerepét vázoló vázlatot az ábra mutatja. 1.

Szerep a rákban

A plazmamembrán V-ATPázát a közelmúltban kiterjedten tanulmányozták a rákban, ahol hozzájárulnak a növekedéshez kedvező lúgos intracelluláris környezet és az invázióhoz kedvező savas extracelluláris környezet fenntartásához . A daganatokban a V-ATPáz expressziója magasabbnak bizonyult az emlő-, prosztata-, tüdő-, petefészek-, máj-, hasnyálmirigy-, melanoma- és nyelőcsőrák proliferáló rákos sejtjeinek vezető széle felé . Különösen az emlőráksejtek expresszálják a V-ATPázt a plazmamembránon az extracelluláris tér savasítása érdekében, és a V-ATPáz mennyiségi expressziója korrelál a sejtvonal invazivitásával és metasztatikus potenciáljával . A V-ATPáz pontos hozzájárulása a növekvő tumorhoz az alább tárgyalt molekuláris mechanizmusokra/útvonalakra gyakorolt hatásán keresztül valósul meg.

Immunomoduláció

A vákuoláris ATPáz a2 izoformája (VOa2 vagy a2V) immunmoduláló szerepet játszik a terhességben és a rákban. Az a2V-t a reproduktív biológiában érintő vizsgálatok feltárták e molekula eddig ismeretlen szerepét a normál spermium érésben és termelésben az embrió beágyazódásán kívül . A tumoros mikrokörnyezetben az a2V N-terminális doménje a makrofágokat a tumor-asszociált makrofágok (M2 típus) felé polarizálja, és endocitózis útvonalon keresztül stimulálja a különböző monocita alcsoportokat . Ezeket az eredményeket követően kimutatták továbbá, hogy az a2V hiánya a tumorsejtekben megváltoztatja a rezidens makrofág populációt a tumor mikrokörnyezetében és befolyásolja az in vivo tumor növekedését . az a2V a neutrofilek primer granuláin expresszálódik és segít fenntartani a pH-t az exocitikus útvonalban a neutrofil aktiváció során . A humán neutrofilek kezelése az a2V rekombináns N-terminális peptidjével (a2NTD) elősegítette a neutrofilek migrációját és polarizációját . Ezek a vizsgálatok együttesen kiemelik a V-ATPáz immunmoduláló szerepét a hatásos immunválaszok kiváltásában.

Warburg-hatás

A rák egyik jellemzője a Warburg-hatás, amikor a sejtek az oxidatív foszforilációról az aerob glikolízisre térnek át . Számos tanulmány utal arra a hipotézisre, hogy a rákos sejtek a kedvező lúgos intracelluláris pH és a savas extracelluláris pH elérése érdekében jobban függenek a V-ATPáztól, mint bármely más pH szabályozótól, mint a Na+H+ cserélők, bikarbonát transzporterek és proton-laktát szimporterek . A citoszol lúgosítása aktiválja a glikolízist, miközben elnyomja az oxidatív foszforilációt . Továbbá, néhány glikolízissel kapcsolatos onkogén, mint a Hypoxia Induced Factor (HIF-1) a V-ATPáz által indukált pH-változás által szabályozott .

Savproteázok

A tumorok extracelluláris savasodásának következménye a savproteinázok aktiválása, amelyek olyan enzimek, amelyek a tumor inváziója során hasítják az extracelluláris mátrixot. Ezek az enzimek a savas proteinázok osztályába tartoznak, mint a kathepszinek , a mátrixmetalloproteinázok (MMP) és a zselatinázok, és savas pH-n aktívak. Továbbá a savas pH-n aktív intracelluláris enzimek, például a γ-szekretáz aktivitása is fokozódik a V-ATPáz fokozott aktivitásával a vezikulákban . Következésképpen ez az onkogén útvonalak, mint a Notch, diszregulációjához vezet.

A gyógyszerrezisztencia és a V-ATPáz gátlók

A tumor mikrokörnyezet megváltozott pH-ja befolyásolhatja a kemoterápiás gyógyszerekkel szembeni érzékenységet . Az antraciklinek és alkaloidok pKa értéke 7-8 és internalizálódnak az endoszomális kompartmentbe . A legújabb adatok azt sugallják, hogy a V-ATPáz gátlók alkalmazása nemcsak sejtpusztuláshoz vezető citoszolikus pH-változást okoz, hanem fokozza a gyógyszerfelvételt is, ezáltal a rák kombinatorikus kezelésének hatékony összetevőjévé válik. A petefészekrákban az a2V a rákos sejtek vezető peremén expresszálódik, és modulálja az MMP9 aktivitását. Továbbá az a2V hozzájárul a ciszplatin által közvetített gyógyszerrezisztenciához a petefészekrákban, és az a2V szelektív gátlása hatékony stratégiát jelenthet a kemoterápiára rezisztens petefészekrák kezelésére . A V-ATPáz-gátlók, a bafilomicin és a konkanamicin a pleomakrolidok azon osztályába tartoznak, amelyek a VO-szektort célozzák és hatékonyan gátolják a V-ATPáz aktivitását. A közelmúltban jelentették, hogy az Apicularen és az archazolidok a V-ATPáz hatásos és specifikus inhibitorai . Azonban az összes rendelkezésre álló kismolekulás inhibitor jelentős toxicitással rendelkezik, figyelembe véve a V-ATPáz részvételét a normál sejtfiziológiában . Ezért a sejtspecifikus expresszióval rendelkező “a” alegység izoformája elleni specifikus semlegesítő antitestek kifejlesztése hatékony alternatíva lehet a V-ATPáz közvetlen gátlására, miközben kombinatorikus alkalmazással közvetve a multirezisztencia ellen is felléphet.

Autofágia

Autofágia az autofágoszómák által a lizoszómákba szállított szállítmányok szelektív lebontásának vagy újrahasznosításának folyamata . A tumorsejtek változatos függőséget mutatnak az autofágiától, ahogyan az elsődleges tumortól az erősen metasztatikus szolid tumorig fejlődnek . A lebontásra megjelölt sejtes rakományt az autofágikus folyamatok szállítják a lizoszómákba. A V-ATPáz protonpumpáló aktivitása felelős a lizoszomális savas hidrolázok aktiválásáért, amelyek lebontják az autofágoszómákból felvett rakományt . Bár a vizsgálatok rámutatnak arra, hogy az autofágia megköveteli a funkcionális V-ATPáz működését, és a V-ATPáz inhibitort, a bafilomycint az autofágia klasszikus inhibitoraként használják , a V-ATPáz pontos szerepe az autofágikus fluxus membrándinamikájában nem ismert. Egy nemrégiben végzett vizsgálat arról számolt be, hogy a Bafilomycinnel való kezelés, amely gátolja mind a V-ATPáz, mind a Ca2+ pumpa SERCA pumpa aktivitását, az autofágikus fluxus blokkolásához vezetett, míg a V-ATPáz hiányos lizoszómák még mindig képesek voltak az autofágoszómákkal való fúzióra . Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a V_ATPáz inkább a lizoszómákban lévő autofágikus rakomány lebontásában vesz részt, mint az autofágikus fluxusban, és kiemelik a specifikus inhibitorok és génmanipulációs technikák kifejlesztésének szükségességét a V-ATPáz különböző fontos sejtfolyamatokban betöltött pontos szerepének tanulmányozásához.

Signaling

Az endoliszoszomális útvonal fontos a jelátviteli útvonalak pozitív és negatív szabályozásában egyaránt . Az első ismert jelentés a V-ATPáz jelátvitelben való részvételéről egy olyan vizsgálatból származik, amely kimutatta, hogy a V-ATPáz bafilomicinnel történő gátlása befolyásolta az EGFR internalizációját . Azóta a V-ATPázt kapcsolatba hozták az m-TOR (mammalian Target Of Rapamycin), Wnt, TGF-β és Notch jelátvitel szabályozásával kapcsolatos jelátvitellel.

Notch jelátvitel

A V-ATPáz által szabályozott jelátviteli utak közül talán a Notch a legjobban tanulmányozott. Ez annak tulajdonítható, hogy a Notch szignalizáció az endoliszoszomális útvonaltól függ a kulcsfontosságú útvonal mediátorainak aktiválása, fenntartása és degradációja szempontjából . A V-ATPáz fenntartja a sejtek pH-egyensúlyát, és fontos szerepet játszik az endocitózisban, a proteázok aktiválásában és a fehérjék lebontásában. Konkrétan az a2V (V-ATPáz alegység – VOa2) korábban a korai endoszómákhoz – a receptor-endocitózis helyéhez – lokalizálódott . A ligandumkötést követően a Notch-receptor az endocitikus utat választja, és proteázok hasítják az aktiváláshoz. Később a receptorok lebomlanak a lizoszómában . Drososphila-ban a Vps25 mutációi, amely a jelző receptorok endoszomális szortírozását szabályozó ESCRT gépezet egyik összetevője, a Notch receptor endoszómákban való felhalmozódását okozza, és fokozza a Notch jelátvitelt . A drosophila Hrs, az ESCRT egy másik komponensének mutációit elemző vizsgálatban a Notch felhalmozódik az endoszómákban, de nem okozza a Notch jelátvitel ektopikus aktiválódását . Az autofágia elvesztése a Notch jelátvitel aktiválódásához vezet a Drosophila petefészek tüszősejtjeiben a Notch degradáció megszakadása miatt. Ezekkel a jelentésekkel ellentétben egy független tanulmány megállapította, hogy a Rabconnection-3 mutációi megzavarják a V-ATPáz proton-pumpáló aktivitását és felhalmozzák a Notch-ot a késői endoszómákban az S2 hasítás után, ezáltal csökkentve a Notch szignálást Drosophila és emlős sejtekben . Ezeket az eredményeket Drosophilában további jelentések követték, amelyek azt mutatták, hogy az endoliszoszomális útvonal savasodásán keresztül a V-ATPáz szükséges a Notch aktiválásához az endoszómákban, valamint a Notch lebontásához a lizoszómákban . Az emlősök fejlődése során a V-ATPáz domináns negatív alegységének expressziója a neurális prekurzorokban csökkentette a Notch jelátvitelt és kimerítette a neurális őssejteket, ami neuronális differenciálódáshoz vezetett . A közelmúltban a Nuc1 mutáns patkányok retinájában lévő asztrocitákon végzett vizsgálatok kimutatták, hogy a Notch jelátvitel diszregulálódik. A Notch-szignalizáció csökkenése a mutálódott βA3/A1-krisztallin miatt következett be, amely szabályozza a V-ATPáz aktivitást, ami az endoszómális savasodás és a γ-szekretáz aktivitás károsodását eredményezi, ezáltal befolyásolva a Notch-receptor feldolgozásának sebességét . Ez egy érdekes megállapítás, figyelembe véve, hogy a V-ATPáz látásban betöltött szerepe mostanában merül fel . Ezek az eredmények együttesen azt jelzik, hogy a Notch jelátvitel V-ATPáz általi szabályozása pozitív és negatív kimenetelű lehet, attól függően, hogy a V-ATPáz aktivitás milyen celluláris lokalizációja érintett (endoszómák vs. lizoszómák) és a Notch receptor feldolgozásának függése az endoszomális útvonaltól . Bár a V-ATPáz és a Notch keresztkapcsolatát a Notch-szignalizációt befolyásoló V-ATPáz-függő endoliszoszómális savasodással összefüggésben vizsgálták, egy nemrégiben megjelent jelentés szerint a szabályozás fordítva is lehet. A szerzők konkrétan azt sugallják, hogy a Presinilin1 (PS1), a Notch-receptor és a β-amyloid peptid hasításáért felelős γ-szekretáz enzimkomplex egyik összetevője fizikailag kölcsönhatásba lép a V-ATPáz VOa1 izoformájával, és az endoplazmatikus retikulumból a lizoszómákba irányítja . Vizsgálataink során megállapítottuk, hogy a V-ATPáz szabályozza a Notch jelátvitelt az emlőrák és az emlőmirigy fejlődésében . a2V expresszálódik a proliferáló emlőhámsejtek és a tripla negatív emlőrák (TNBC) sejtek felszínén, ami a sejtproliferációban betöltött szerepére utal a normál fejlődés és a betegség során. TNBC-ben az a2V gátlása fokozza a Notch jelátvitelt a Notch receptor lizoszomális és autofágikus degradációjának blokkolásával . Az a2V elvesztése egér emlőmirigyben abnormális Notch-aktivációhoz vezet és károsítja a ductus morfogenezist, ami laktációs hibákat okoz . A Notch jelátvitel aktiválódik a PGN + poli(I:C) fertőzéssel kiváltott koraszülés során, ami a pro-inflammatorikus válaszok felszabályozását eredményezi, és gátlása javítja az élő magzatok méhen belüli túlélését. Továbbá az LPS injekcióra adott gyulladásos válasz által indukált koraszülésben megfigyelték a Notch-csal kapcsolatos gyulladás felszabályozását és az angiogenezis faktorok leszabályozását . Mind a fertőzéses, mind a gyulladásos koraszüléses modellekben képesek voltunk a fenotípust megmenteni γ-szekretáz gátlókkal (GSI) történő kezeléssel . Ez fontos jövőbeli irányokat nyit meg, különösen mivel a GSI hatékony gátlója a Notch jelátvitelnek, és jelenleg klinikai vizsgálatokban van számos rákos megbetegedés esetében. Ezzel a V-ATPáz és a Notch keresztbeszélgetés fontosnak bizonyul a normális fejlődés és az olyan betegségek során, mint az Alzheimer és a különböző rákos megbetegedések .

Wnt jelátvitel

A Wnt jelátviteli útvonal fontos szerepet játszik a sejtek és szövetek fenntartásában, polaritásában és differenciálódásában. Emberekben a Wnt jelátvitel diszregulációját rákos megbetegedésekkel hozták összefüggésbe . A diszregulált Wnt-szignalizáció klasszikus példája a vastagbélrák, ahol a Wnt-szignalizáció negatív szabályozójának, az Adenomatosus Polyposis Coli (APC) elvesztése tumorigenezist vált ki . A jelátvitel során a Wnt-ligandok a Frizzed, Fz és LRP (low density-lipoprotein,) egy sejtfelszíni receptorkomplexhez kötődve hatnak a célsejtekre, ami a glikogén-szintáz-kinák (GSK-3) szétszereléséhez, majd a β-katenin felszabadulásához vezet. A β-katenin a Wnt-útvonal fő downstream mediátora, amely aktiválja a Wnt célzott onkogén génjeit, mint a c myc és a cyclinD1 . A (P) RR, Pro Renin Receptor, más néven ATP6ap2 adaptor molekulaként működik a V-ATPáz és a Wnt receptor komplex LRP 5/6 között. Xenopusban és Drosophilában kimutatták, hogy a V-ATPáz kölcsönhatásba lép az LRP 5/6 receptor komplexszel, és mind a V-ATPáz genetikai kiütése, mind a farmakológiai gátlása zavarja a jelátvitelt és jelentősen csökkenti a Wnt jelátvitelre adott sejtválaszt . Továbbá a V-ATPáz közvetve szabályozza a Wnt jelátviteli mediátor β-katenint és a Notch mediátor NICD-t autofágián keresztül .

TGF-β jelátvitel

Az a2V gén mutációi autoszomális recesszív Cutis Laxa (ACL) szindrómát okoznak, ahol a betegeknél csökkent az extra sejtmátrix fehérjék, mint a kollagén mennyisége, ami ráncos bőr fenotípust eredményez . E megállapításokat alátámasztva, a cutis laxáért felelős mutációk mechanisztikus vizsgálata emberekben az a2P405L mutációt instabilnak és a vad típushoz képest hibás golgi-kereskedelmet mutatónak azonosította. Továbbá, a jelentések rámutatnak az ACL glikozilációs hibájára, ami emelkedett elősegíti a transzformáló növekedési faktor-béta (TGF-β) jelátvitelt ezeknél az a2V mutációval rendelkező betegeknél . A V-ATPáz elősegíti a patkány proximalis tubuláris epitélsejtek TGF-β indukálta epiteliális-mesenchymális átmenetét . Az a2V gátlása a Notch jelátvitelre gyakorolt hatásán kívül aktiválta a Wnt útvonalat TNBC-ben és a TGF-β útvonalat emlőhámsejtekben . Ez arra utal, hogy az a2V szerepe a jelátviteli mediátorok modulálásában nem kizárólag a Notch-ra korlátozódik. Továbbá ezek az egerek az összes kollagén csökkenését is mutatták a károsodott glikoziláció miatt .

mTOR jelátvitel

Az mTOR jelátvitelben a szerin-treonin kináz mTOR és az mTOR komplex 1 (mTORC1) más komponensei érzékelik az aminosav elérhetőséget a sejtek stresszét, és modulálják a növekedést .Aminosavstimuláció hatására a V-ATPáz aktiválja a Ragulator Guanin Exchange Factor (GEF) aktivitását a RagA felé, ami viszont elősegíti a RagC GTP-hidrolízisét . A GTP-hez kötött RagA és a GDP-vel terhelt RagC együttesen toborozzák az mTORC1-et a lizoszóma felszínére . Az aktivált mTORC1 a növekedési faktorok jelzéseire reagálva szabályozza a sejtpusztulásról a proliferációra történő szabályozási váltást . Egy nemrégiben készült jelentés szerint az oszteoklaszt protonpumpát szabályozó Atp6v1c1 az mTORC1 útvonal aktiválásával fokozza az emlőrák növekedését és a V-ATPáz aktivitás növelésével a csontmetasztázis kialakulását.