Alai

Von Willebrand faktor, ADAMTS13 és trombotikus trombocitopéniás purpura

A VWF egy nagy génből szintetizálódik a 12p13.31 kromoszómán, amely 178 kb kiterjedésű és 52 exont tartalmaz.49 A gén által termelt hírvivő RNS (mRNS) egy 2813 aminosavból álló polipeptidet specifikál, amely tartalmaz egy 22 aminosavból álló jelző peptidet, egy 742 aminosavból álló propeptidet és egy 2050 aminosavból álló szekvenciát, amely a plazmában található VWF monomer építőelemét alkotja. A szignálpeptidnek az endoplazmatikus retikulumban történő hasítása után a propeptidtartalmú monomerek a molekula C-terminusához közeli Cys-maradékokat érintő láncközi diszulfidkötések révén dimerekké kapcsolódnak. Ezek a dimerek ezután a Golgi-apparátusba kerülnek, ahol a propeptid katalizálja a D3-domén maradékai közötti dimerek közötti diszulfidkötéseket, így hosszú multimerek jönnek létre, amelyek fej-fej mellett összekapcsolt dimerekből állnak, és mindkét végén N-terminálisokat tartalmaznak. A propeptidet ezután egy furinszerű enzim hasítja, és a keletkező ULVWF nagy része tároló granulumokba csomagolódik a későbbi szabályozott szekrécióhoz.

A VWF szintéziséről csak két sejttípus ismert: az endotélsejtek és a megakariociták. Az endotélsejtekben a VWF a Weibel-Palade-testeknek nevezett granulákban, a vérlemezkékben pedig α-granulákban tárolódik. A vérben lévő VWF nagy része endotél eredetű. Számos inger indukálhatja az endoteliális VWF felszabadulását, beleértve az adrenalin, a desamino-vasopresszin (DDAVP), a hisztamin, a trombin, a Shiga-toxinok és a proinflammatorikus citokinek, köztük a tumor nekrózis faktor (TNF)-α, az interleukin (IL)-8 és az IL-6 (az IL-6 receptorral komplexben).50 Más anyagok is indukálhatják a VWF endoteliális felszabadulását, ami a TTP néhány kiváltó tényezőjére utal. Ezek közé tartoznak a vírusok, mint például az adenovírus51 és az oxidánsok, mint például a szuperoxid.52 Az oxidánsok nemcsak az ULVWF szekréciót képesek kiváltani; oxidálhatják a VWF-et is, hogy az ADAMTS1353 által ne legyen megtisztítható és adhéziósabbá váljon.54 Továbbá az oxidánsok, különösen a gyulladás során a neutrofilek és monociták által termeltek, oxidálhatják az ADAMTS13 katalitikus doménjében lévő egyik kulcsfontosságú metionin maradékot és inaktiválhatják az enzimet.55

Az endotélsejtek és a vérlemezkék egyaránt olyan VWF multimereket szabadítanak fel, amelyek nagyobbak, mint a normál plazmában lévő multimerek.56 Ezek az ULVWF multimerek nemcsak sokkal nagyobbak, mint a normális plazmában találhatóak; sokkal adhéziósabbak is, és képesek spontán és nagyobb kötéserővel kötődni a trombocita VWF receptor glikoprotein Ib-hez (GPIbα; a GPIb-IX-V komplex legnagyobb polipeptidje), mint amit a plazma VWF GPIbα-hoz való kötődése során a modulátorok, a ristocetin vagy a botrocetin jelenlétében érnek el.57 In vivo ez azt jelenti, hogy az ULVWF képes trombocitákat kötni nyírófeszültség nélkül vagy alacsony nyírófeszültség mellett, míg a feldolgozott plazma VWF-nek nagy nyírófeszültség által kiváltott kibomlásra van szüksége a trombociták megkötéséhez.58

A frissen felszabadult ULVWF egy része közvetlenül a keringő vérbe kerül, míg egy másik része az endotélhez kötődve marad, ahol az ULVWF multimerek önasszociálódhatnak, és több száz mikrométertől néhány milliméteres hosszúságú szálakat alkothatnak, amelyek az endotél felszínéhez rögzítve maradnak.59 A felszínhez kötött ULVWF szálak hiperadhézívek, és spontán módon kötnek vérlemezkéket, hogy az endotél felszínén “gyöngyök a szálakon” megjelenésű, vérlemezkékkel díszített szálakat képezzenek. Fiziológiás nyírófeszültség hatására a vérlemezkékkel díszített ULVWF-stringeket az ADAMTS13 hasítja és eltávolítja az endotél felszínéről. A további, még nem teljesen jellemzett feldolgozás következtében a VWF képtelenné válik a vérlemezkék spontán megkötésére. A vérlemezkékkel díszített ULVWF-stringek felhalmozódása az endotélfelszínen az ADAMTS13 csökkent szintje vagy hiánya következtében a keringésben mikrovaszkuláris trombózist indít el, ami vérlemezkékben gazdag hialin trombusok kialakulásához és lerakódásához vezet a mikrovaszkulaturában – a TTP meghatározó jellemzője.

Az ULVWF-stringek VWF-multimerek kötegeiből állnak, és minden egyes string több horgonyzóhelyen kötődik az endotélfelszínhez. Ca2+ és Mg2+ hiányában (vagy alacsony koncentrációban) az ULVWF szálak a P-szelektinhez való kötődés révén kapcsolódnak az endotél felszínéhez.60 A kétértékű kationok fiziológiás koncentrációinak jelenlétében az ULVWF szálak az integrin αvβ3-mal való kölcsönhatáson keresztül rögzülnek az endotél felszínéhez.61 A VWF szálak ilyen rögzítésében kétségtelenül más molekulák is részt vesznek, de ezek egyelőre nem azonosítottak.

A VWF vagy az ULVWF multimerek azon képessége, hogy vastagabb szálakká és kábelekké önasszociálódjanak, a VWF adhéziós tulajdonságainak szabályozásának fontos mechanizmusává válik. Savage és munkatársai kimutatták, hogy nyírófeszültség alatt és vérlemezkék jelenlétében a folyékony fázisban lévő VWF multimerek homotipikusan és reverzibilisen társulnak a kollagén felületre immobilizált VWF multimerekkel; az önasszociált VWF multimerek nyírófeszültség alatt támogatják a vérlemezkék adhézióját.62 A folyadékfázisú VWF-multimerek az endotélfelületre rögzített ULVWF-szálakkal is társulhatnak,63 és az önasszociációt elősegíti a VWF-molekulák részleges kibomlása, amelyet a nyíróstressz64,65 vagy a ristocetin kötődése indukál.66 Az önasszociált VWF-multimerek keresztkötésű szálak hálózatát alkotják kollagénfelszíneken64 vagy oldatban.66 Nyírófeszültség hatására a folyadékfázisú VWF-multimerek a vérlemezkékhez kötött VWF-multimerekkel is társulhatnak a vérlemezkék felületén lévő GPIbα-val való kölcsönhatás révén.67 A VWF önasszociációja a vérlemezkék felszínén kiválthatja a vérlemezkék aktiválódását, elősegítheti a vérlemezkék aggregációját és fokozhatja a trombus növekedését.

A VWF önasszociációs képessége lehetővé teszi, hogy olyan szálakat hozzon létre, amelyek vetekednek a fibrin polimerizációja által létrehozott szálak hosszával és vastagságával, vagy meghaladják azokat. Az agonista stimulációval VWF szekrécióra késztetett szintetikus mikroerekben az érfalból szekretált VWF olyan szálakká tudott összeállni, amelyek képesek voltak átfogni az ér lumenét, különösen a bifurkációkban és a kanyarulatokban.68 A VWF azon képessége, hogy ilyen hatalmas méretű szálakat és kábeleket képezzen, és ezeket a kábeleket felfűzze az áramlás útvonalán, nemcsak annak az esélyét növeli, hogy a szálak trombocitákat ragadjanak meg, hanem azt a képességüket is fokozza, hogy az eritrocitákat skisztocitákká aprítsák.

Magát a VWF önasszociációját nemcsak a nyírófeszültség, hanem a plazma faktorok is szabályozzák, ami valószínűleg megváltoztathatja a TTP epizódok lefolyását és súlyosságát. A VWF önasszociációját a nagy sűrűségű lipoprotein (HDL) és a HDL fő fehérjekomponense, az apoliprotein (Apo) A-I csillapítja. Mindkettő jelentősen csökkenti az endotél felszínén immobilizált VWF-szálak hosszát és vastagságát. A vérlemezkék adhéziója ezekhez a hiperadhéziós struktúrákhoz szintén csökken az önasszociált VWF csökkenésével arányosan. Az ADAMTS13 knockout egerek TMA modelljében a HDL jelentősen mérsékelte a nagy dózisú humán VWF infúziója által kiváltott trombocitopéniát is.69 Az ApoA-I-nek a VWF önasszociációját moduláló képességével összhangban, plazmakoncentrációja fordítottan korrelál a hiperadhezív VWF szintjével TTP-ben és szepszisben szenvedő betegeknél. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a VWF önasszociációjának befolyásolása új megközelítést jelenthet a hiperadhezív VWF-fel társuló trombotikus rendellenességek, köztük a TTP kezelésében.

A VWF-hasító metalloproteáz a 13. tagja az eddig azonosított 18 különböző ADAMTS-típusú enzimcsaládnak, amelyek szerkezeti hasonlóságokat mutatnak.16,17 Az ADAMTS13 egy N-terminális reproliszin típusú metalloproteáz doménből (M) áll, amelyet egy dezintegrin domén (D), egy tromboszpondin-1-szerű domén (T), egy ciszteinben gazdag domén (C) követ, amely arginin-glicin-aszpartát szekvenciát tartalmaz, egy távtartó domén (S), hét további tromboszpondin-1-szerű domén (T2-8) és két nem azonos CUB-típusú domén (CUB1-2) a molekula C-terminális végén (ábra. 24.2). A CUB-domének a C1r/C1s komplement alkomponensekhez, az embrionális tengeri sün fehérjéhez, az egf-hez és a csontmorfogén protein-1-hez hasonló peptidszekvenciákat tartalmaznak.70 Az ADAMTS13 egy Zn2+- és Ca2+-igényes 190 000 daltonos glikoprotein, amelynek génje a 9q34 kromoszómán található, és túlnyomórészt a máj sztellatussejtjeiben termelődik.71,72,72 Az ADAMTS13-at az EDTA gátolja, ezért az enzim funkcionális vizsgálatát legjobban citrátolt plazmán lehet elvégezni.12,14-17,73-77 Heparinnal, klórmetilketonnal (pl. fenilalanin-prolin-aszpartát klórmetilketon ), hirudinnal és más direkt trombin-inhibitorokkal (DTI-k) antikoagulált plazma is kielégítő lenne a vizsgálathoz. A proteáz inhibitorokkal megfelelően kezelt szérum szintén alkalmas a vizsgálatra.78

A VWF ADAMTS13 általi hasítása a VWF konformációs változásaitól függ, amelyet a nyírófeszültség okoz, egy olyan erő, amely a VWF multimerek konformációját globulárisból nyitottá változtatja.79 Ezt a konformációs változást egy vagy több A2 domén kibomlása követi a VWF multimerben, ami kiteszi a Tyr1605-Met1606 peptidkötést az ADAMTS1379 általi hasításnak vagy a Met1606 hipoklorit általi oxidációjának.54 . A nyíróerőn kívül az elérhető konformációba való átmenetet az A2 domén szerkezetének szénhidrátkötés okozta változásai,80 a 2A típusú VWD-ben bekövetkező aminosavcserék, amelyek destabilizálják az A2 domén hajtogatását,81 és a 2B típusú VWD-ben bekövetkező mutációk,82 valamint a ristocetin kötődése,83 amelyek egyidejűleg exponálják az A1 domént a vérlemezkék kötődése és az ADAMTS13 hasítási helye számára.

A VWF ADAMTS13 általi felismerését és hasítását széles körben tanulmányozták. A legújabb bizonyítékok azt mutatják, hogy a natív ADAMTS13 molekulában a C-terminális T8-CUB domének érintkeznek az N-terminális MDTCS doménekkel, és ez az intramolekuláris kölcsönhatás részben gátolja az MDTCS domének VWF-78 peptidszubsztrát kötő és hasító képességét. Ebben a natív konformációban az ADAMTS13 részben autoinhibált.84,85 Az ADAMTS13 azon képességét, hogy ebbe a konformációba hajtódjon, nyilvánvalóan a T1 és T2, T2 és T3, T4 és T5, valamint T8 és CUB1 domének között elhelyezkedő négy feltételezett linker szekvencia által biztosított rugalmasság segíti elő.86 Az autoinhibíció megszűnik, ha a C-terminális domének csonkolódnak, vagy antitestek vagy multimer VWF kötődnek hozzájuk, lehetővé téve az MDTCS domének és a szubsztrát kapcsolatát.

Mutációs elemzések, kötődési vizsgálatok, kinetikai elemzések és szintetikus peptidszubsztrátok használata alapján több kölcsönhatási helyet azonosítottak a konformációsan aktív ADAMTS13 és a kibontott VWF A2 domén között, amelyeket egy molekuláris cipzár modellben foglaltak össze,87 ahogy azt a 24.3. ábra vázlatosan ábrázolja. A multimer VWF kritikus szintű nyírófeszültségnek való kitettségével először az A2 doménben lévő exozit exponálódik. Ez az exozit a Glu1660-Arg1668 helikális régiót foglalja magában, amely 65 aminosavval C-terminálisan helyezkedik el a hasítási helytől, és nagy affinitással (KD ~ 10 nM) kötődik az ADAMTS13 spacer doménjéhez.88-90 A nyírófeszültség egy második, alacsony affinitású exozitot is feltár az A2 doménben az Asp1614-nél vagy annak közelében (P9′ hely), amely az ADAMTS13 dezintegrin doménjének Arg349-ével lép kölcsönhatásba.91 E két exozit interakciója az ADAMTS13 komplementer régióival pozícionálja a VWF Tyr1605-Met1606 hasadási helyét az ADAMTS13 metalloproteáz doménjének aktív központjával. Ez magában foglalja a VWF-ben lévő Leu1603 (P3 hely) kölcsönhatását az ADAMTS13-ban lévő komplementer Leu198, Leu232 és L272 (S3 hely), a VWF-ben lévő Tyr1605 (P1 hely) az ADAMTS13-ban lévő Leu151 és Val195 (S1 hely), valamint a VWF-ben lévő Met1606 (P1′ hely) az ADAMTS13-ban lévő Asp252-Pro256 (S1′ hely).92 Fage display és random mutációs analízis megerősítette és kimutatta, hogy a P3-P2′ és P11′ (Ile1616) régióban lévő aminosavak szintén fontosak a hasítás szempontjából.93 Így a két multidomén fehérje e komplementer régióinak szekvenciális kölcsönhatása elősegíti a szkizil kötés specifikus hasítását.

Az ULVWF multimerek lebontásának kudarca régóta gyaníthatóan a TTP familiáris és szerzett idiopátiás típusait okozza, vagy hajlamosít az egyénre ezekre a rendellenességekre (24.4. ábra).11,94 Az elképzelés igazolására végzett kritikus kísérletekről 1997-ben és 1998-ban számoltak be. Négy krónikus relapszusos TTP-ben szenvedő betegnél kimutatták, hogy a plazma ADAMTS13 aktivitása hiányos.12 Mivel nem mutatták ki az enzim inhibitorát, ezt a hiányt a proteáz termelésének, túlélésének vagy működésének rendellenességének tulajdonították. A következő évben sikerült tisztázni a TTP gyakoribb, szerzett idiopátiás típusának patogenezisét.13-15 A szerzett idiopátiás TTP-ben szenvedő betegeknél az akut epizódok alatt a plazma ADAMTS13-aktivitása alacsony volt, vagy egyáltalán nem volt, de ez az aktivitás a gyógyulás során a normális szint felé emelkedett. Bár az ezekben a vizsgálatokban alkalmazott plazmavizsgálatok nem voltak fiziológiásak, mégis innovatívak és informatívak voltak. Az enzim elleni immunglobulin (Ig) G autoantitestek valószínűleg a legtöbb szerzett idiopátiás TTP-ben szenvedő betegnél a proteáz aktivitás hiányát okozták.13-15 Ennek az átmeneti immunrendszeri diszregulációnak, valamint a VWF-hasító proteáz szelektív antigén célzásának okai még nem ismertek.

A familiáris, krónikus, relapszusos TTP-ben szenvedő betegek plazmájában gyakran találhatók ULVWF multimerek.11,94 Az ULVWF multimereket érzékeny agaróz gélelektroforézis módszerrel kimutatták néhány beteg plazmamintájában a szerzett idiopátiás TTP akut epizódjai során, de a gyógyulás után nem.94 Ezeket az eredményeket azok a kutatók magyarázták, akik familiáris, krónikus, relapszusos TTP-ben az ADAMTS13 krónikus hiányát fedezték fel a plazmából, valamint az enzim átmeneti gátlását a szerzett idiopátiás TTP akut epizódjai során.12-15

A legtöbb familiáris TTP-s beteg plazmájában a normális ADAMTS13 aktivitás kevesebb mint 5%-a található, függetlenül attól, hogy a plazmát akut epizódok alatt vagy után nyerték (feltéve, hogy nem kaptak nemrég plazmainfúziót). A legtöbb szerzett idiopátiás TTP-ben szenvedő beteg plazmájában az ADAMTS13 aktivitása csak az akut TTP-epizódok során kevesebb, mint 5%-a a normálisnak.12-15,24,95 A TTP-ben szenvedő betegek plazmájában az ADAMTS13 aktivitásának súlyos hiánya összefügg azzal, hogy az endotélsejtek felszínéről kilépő ULVWWF multimereket nem sikerül hasítani (lásd a 24.4. ábrát).59 Ennek következtében az endotélsejtek által szekretált ULVWF multimerek ezekhez a sejtekhez rögzülve maradnak, és hosszú szálakba59 rendeződnek, és a GPIbα trombocita kötődésével képesek befogni az áthaladó vérlemezkéket (24.4. ábra). (A vérlemezkék spontán nem kötődnek a kisebb VWF-formákhoz, amelyek az ULVWF multimerek hasadása után keringenek).56 További vérlemezkék csatlakoznak a növekvő trombocita-aggregátumhoz (amelyek az aktivált αIIbβ3 révén toborzódnak az aggregátumhoz), amely az ér elzáródásáig növekedhet (lásd a 24.4. ábrát).59,96 Bár az idiopátiás TTP legtöbb esete súlyos ADAMTS13-hiányt mutat, egy részüknél a jelenleg rendelkezésre álló tesztekkel mérhető enzimaktivitás nem mutat súlyos hiányt.97 Még nem világos, hogy ennek oka az enzimaktivitásnak a rendelkezésre álló tesztekkel nem kimutatható antitestek által okozott interferenciája, a VWF hasítással szembeni ellenállása (pl. oxidatív módosítás miatt),53 vagy más okok. Mindazonáltal valószínű, hogy az ebbe a kategóriába tartozó betegek közül még sokan részesülnek a plazmacsere-terápiából.98 Azt is hangsúlyozni kell, hogy az ADAMTS13 hiánya nem érzékeny és nem specifikus (az ADAMTS13 aktivitása számos más betegségben csökkent)99 a szerzett TTP diagnózisának felállításához.

Az ULVWF szálak ADAMTS13 aktivitás hiányában is képesek leválni az endotélsejtekről, mechanikusan leválva a folyadék nyírófeszültsége által generált növekvő feszültséggel, ahogy a vérlemezkék tapadnak és aggregálódnak.59 A levált ULVWF-trombocita szálak elzárhatják a downstream mikrovesszőket, hozzájárulva a szervi iszkémiához.

A plazma ADAMTS13 aktivitása szinte mindig hiányzik vagy súlyosan csökkent a familiáris TTP-ben szenvedő betegeknél,12,100,101 az ADAMTS13 gén homozigóta vagy összetett heterozigóta mutációinak következményeként.18,24,95,102,103 A familiáris TTP-ben mutációkat az egész génben kimutattak a különböző doméneket kódoló régiókban (lásd a 24.2. ábrát). Az ADAMTS13 aktivitásának súlyos veleszületett hiánya esetén a TTP epizódjai általában csecsemő- vagy gyermekkorban kezdődnek. Egyes betegeknél azonban a nyílt TTP-epizódok csak évek múlva (pl. az első terhesség alatt),102 ha egyáltalán kialakulnak. Ez utóbbi megfigyelés arra utal, hogy egyes betegeknél az ADAMTS13 maradék aktivitása megmarad, és a TTP akut epizódjai akkor válnak ki, amikor az ULVWF felszabadulása az endothelsejtekből meghaladja az ADAMTS13 korlátozott feldolgozó képességét. Az egyik eset, amikor ez rendszeresen előfordulhat, a terhesség alatt történik: A VWF-szintek köztudottan emelkednek a terhesség alatt.104-106 Ezzel az elképzeléssel összhangban a veleszületett TTP-ben szenvedő nőknél gyakran az első terhességük alatt diagnosztizálják a betegséget.29 A veleszületett TTP neonatális kezdetű, 5%-nál kisebb ADAMTS13-aktivitású csecsemőknél az átmeneti vagy progresszív veseelégtelenség gyakran a betegség kiemelkedő összetevője.107 Ezek a betegek klinikailag hasonlítanak a Schulman és munkatársai által 1960-ban108 és Upshaw által 1978-ban109 leírt két betegre; következésképpen ezt a gyermekkori alcsoportot néha “Upshaw-Schulman-szindrómásként” emlegetik.”

A szerzett TTP-ben szenvedő sok betegnél a plazma ADAMTS13 aktivitása vagy hiányzik, vagy súlyosan csökkent az akut epizódok alatt, és a felépülés során növekszik, akár egyszeri, akár visszatérő epizódokról van szó.13-15 A plazma ADAMTS13 aktivitását gátló IgG autoantitestek kimutathatók e betegek 44%-94%-ában.13-15,102,110,111 Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az immunszabályozás átmeneti vagy időszakosan visszatérő hibája jelen van sok betegnél, akiknek szerzett idiopátiás TTP-je ADAMTS13-hiánnyal társul. Néhány ticlopidin- vagy clopidogrel-asszociált TTP-ben szenvedő betegnél a plazma ADAMTS13-at gátló antitesteket is azonosítottak.34,112 Még nem ismert, hogy az ADAMTS13 termelésének vagy túlélésének átmeneti súlyos hibája előfordul-e olyan szerzett TTP-ben szenvedő betegeknél, akiknél nem mutathatóak ki autoantitestek az enzim ellen. Alternatív megoldásként az is lehet, hogy a gátló autoantitestek kimutatásának elmaradása egyes betegeknél a jelenleg használatos tesztrendszerek korlátozott érzékenységét tükrözi. A nem gátló autoantitesteket, amelyek megköthetnék és potenciálisan közvetíthetnék az ADAMTS13 immunürítését, a jelenlegi tesztrendszerek nem detektálják.

Egy tanulmány 25 szerzett TTP-ben szenvedő betegnél vizsgálta a poliklonális autoantitestek által felismert ADAMTS13 epitópokat,113 és megállapította, hogy az antitestek célpontjai változatlanul a ciszteinben gazdag/spacer domén (CS) szekvencia; 3 betegnél ez volt az egyetlen régió, amelyet az antitestek megcéloztak. A másik 22 autoantitest a CS-domén szekvenciával és a CUB-doménnel (64%), a metalloproteáz/disintegrinszerű/első thrombospondin-1-szerű domén (MDT) szekvenciával (56%) vagy a második-nyolcadik thrombospondin-1-szerű ismétlődést tartalmazó régióval (T2-8, 28%) reagált (lásd a 24.2. ábrát). A propeptid régiót az autoantitestek 20%-a is azonosította,113 ami arra utal, hogy a propeptid eltávolítása nem szükséges az aktív enzim kiválasztásához.114 Az autoantitestek gátolják az ADAMTS13 aktivitását vagy csökkentik a túlélését. Egy másik, hét betegen végzett vizsgálatban Luken és munkatársai115 hat betegnél azonosítottak ADAMTS13 autoantitesteket, amelyek kizárólag a spacer domén (S) területén kötődtek; a hetedik betegnél az antitestek az S doménhez és a T2-8 ismétlődésekhez is kötődtek. Mutagenezissel ezek a kutatók megállapították, hogy az ADAMTS13 spacer doménjében a Thr572-Asn579 és a Val657-Gly666 régiók az autoantitestek kötődésének közös epitópjai.116 . Amikor az Arg660, Tyr661 vagy Tyr665-t alaninnal helyettesítették, a hat TTP-s betegből származó autoantitestek kötődése megszűnt.117

A szerzett TTP-s betegek ADAMTS13 elleni autoantitestjei túlnyomórészt az IgG osztályba tartoznak,118 bár IgM és IgA osztályú antitesteket is kimutattak.119 A szerzett TTP-ben szenvedő betegek monoklonális antitestjeinek klónozása és szekvenálása azt mutatja, hogy a VH1-69 nehézlánc génszakasza preferenciálisan beépül az immunglobulinok változó régiójába.120,121 Ez a preferencia arra utal, hogy a VH1-69 CDR2 vagy CDR3 régiója hozzájárulhat az ADAMTS13 spacer doménjének egy epitópjára való specifitáshoz. Az antitest altípusok eloszlásának elemzése során 58 akut szerzett TTP-ben szenvedő betegnél az összes IgG altípushoz tartozó antitestet kimutatták.118 Az IgG4 volt a legelterjedtebb altípus, amely a betegek 90%-ánál volt jelen, akár önmagában, akár más IgG altípusokkal kombinálva.

Az ADAMTS13 autoantitestek termelődése szinte biztosan genetikailag befolyásolt. Ezt a tényt hangsúlyozza, hogy ikertestvéreknél felfedezték az ADAMTS13 autoantitestek által okozott szerzett TTP-t.122 A szerzett TTP-ben szenvedő betegek 23-44%-ánál fordulnak elő visszaesések,102,110,123,124 gyakran a kezdeti epizódot követő első évben.102 A visszaesés a legalacsonyabb ADAMTS13 aktivitású betegeknél a leggyakoribb (<10%).

A terhesség és a szülés utáni időszak különleges kihívást jelent a TTP szempontjából. Először is, a preeclampsia és a HELLP-szindróma (hemolízis, emelkedett májenzimek, alacsony vérlemezkeszám) számos klinikai jellemzője átfedésben van a TTP-vel, és bizonyos patofiziológiai jellemzőik, például a szisztémás endotheldiszfunkció és a proteinuria közösek lehetnek (lásd a 32. fejezetet).125 A HELLP-szindrómát különösen nehéz lehet megkülönböztetni a TTP-től, mivel mikroangiopátiás hemolitikus anaemia, emelkedett LDH-szint és trombocitopénia is jelentkezik (bár általában nem olyan súlyos, mint a TTP-ben).126 A terhességi TTP az ADAMTS13 elleni autoantitestekkel társulhat, és a betegség általában a szülés közelében vagy a szülés után jelentkezik.127 A következő terhességek során a kiújulás kockázatára vonatkozó becslések széles skálán mozognak, terhességenként 26% és 73% között.102

A plazma ADAMTS13 aktivitása egészséges felnőttekben a jelenleg rendelkezésre álló statikus vizsgálatokkal a normál összevont plazma kb. 50% és 178% között mozog. Csökkent ADAMTS13 aktivitást találtak májbetegségben, disszeminált malignus daganatokban,128 szisztémás gyulladásos szindrómákban, például endotoxin által okozott szindrómákban,129 akut pancreatitisben,130 súlyos szepszisben és szeptikus sokkban,131 szepszis okozta DIC-ben,132 és szepszis okozta szervi diszfunkcióban is.133-135 Emellett alacsony ADAMTS13 szinteket találhatunk terhességben és újszülöttekben.136 Azoknak a peripartumos nőknek a kivételével, akiknél nyílt TTP alakul ki,102,110 az ilyen állapotú betegeknél megfigyelt ADAMTS13-aktivitás nem csökken olyan rendkívül alacsony értékekre (<5%-a a normálisnak), mint a legtöbb familiáris vagy szerzett TTP-ben szenvedő betegnél.

ADAMTS13 vizsgálatok

Az ADAMTS13 vizsgálatokkal meghatározható a proteolitikus aktivitás, az antigénszint és az anti-ADAMTS13 autoantitestek szintje. A korai ADAMTS13-aktivitásvizsgálatok a tisztított VWF-multimerek denaturáló szerek jelenlétében történő lebontásán és a hasadási termékek immunoblottinggal történő mennyiségi meghatározásán,74,75 maradék kollagénkötésen,137 vagy csökkent risztocetin-indukált trombocitaaggregáción alapultak.138 Bár ezek a vizsgálatok érzékenyek, elvégzésük nehézkes és időigényes, és denaturáló szerek használatát igénylik. Ezeket a vizsgálatokat kiszorították, miután a rekombináns VWF-fragmentumok vizsgálatai feltárták az aktivitásméréshez szükséges minimális szekvenciákat. Kokame és munkatársai a VWF A2 domén részleges delécióját végezték el, és azonosítottak egy 73 aminosavból álló minimális peptidet (VWF73, Asp1596-Arg1668), amelyet az ADAMTS13 denaturálószerek hiányában statikus körülmények között hatékonyan hasított.88 Ezt követően számos, a VWF73-at felölelő peptidek hasításán alapuló vizsgálatot fejlesztettek ki, mint például a fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET),97 egy HRP-hez kötött VWF78,139 ELISA,140 immunoblotting,141 és tömegspektrometria142.

2008-ban egy második nemzetközi kollaboratív vizsgálatot végeztek nyolc funkcionális és három antigénvizsgálat teljesítményének összehasonlítására az ADAMTS13 esetében.143 E módszerek összehasonlítása azt mutatta, hogy a módosított VWF-peptideken mint szubsztrátokon alapuló hasítóvizsgálatok nagy pontosságot és reprodukálhatóságot, valamint alacsony szórást és a módszerek közötti variabilitást biztosítottak. A FRET-VWF73-tesztet azóta széles körben használják az ADAMTS13 aktivitásának számszerűsítésére betegmintákban. Bár könnyen elvégezhető, a FRET-alapú vizsgálatnak számos korlátja van. Először is, a FRET-VWF73 hasítást citrátos plazmával, mint ADAMTS13-forrással 33°C alatt kell végezni, mivel 37°C-on az ADAMTS13 jelentős irreverzibilis inaktiválása történik a citrát által közvetített kalcium-kelátumok révén. Másodszor, az optimális fluoreszcens jel detektálása megköveteli, hogy a FRET-VWF73 szubsztrát hasítását pH 6,1-nél végezzük, ami csökkenti a hasítás sebességét. Harmadszor, ennél a szuboptimális pH-nál egyes gátló autoantitestek nem képeznek stabil komplexeket az ADAMTS13-mal, és ezek az antitestek a gátlási vizsgálatokban kimutatatlanok maradnak. Negyedszer, a spektrális átfedés miatt a hemoglobin és a bilirubin jelentős interferenciát okoz a fluoreszcenciajelben. Kifejlesztettek egy továbbfejlesztett FRET-alapú peptidszubsztrátot, a FRETS-rVWF71-et. Az ADAMTS13 aktivitása szérumban és citrátos vagy heparinizált plazmában mérhető ezzel a továbbfejlesztett szubsztráttal fiziológiás pH-n, ionerősségen és kalciumkoncentrációban, az endogén VWF-multimerek, illetve a plazmában lévő bilirubin vagy hemoglobin interferenciája nélkül.78 E peptidalapú aktivitásvizsgálatok másik korlátja, hogy nem értékelik az ADAMTS13 azon képességét, hogy nyírófeszültség alatt hasítsa a multimer VWF-et. Bár az állandó vortexeléssel létrehozott nyírófeszültség bizonyítottan elősegíti a VWF multimerek hasítását,144 a hasítási termékek immunoblottinggal történő számszerűsítése továbbra is időigényes. Legalább négy kereskedelmi készlet áll rendelkezésre az ADAMTS13 aktivitás mérésére a bejelentett módszerek alapján. Ezeket a kiteket azonban nem értékelték közvetlen összehasonlító és standardizációs vizsgálatokban.

Az ADAMTS13 antigénszintjét monoklonális és poliklonális antitestekkel számszerűsítették.145,146 A csonkolás, a mutációk és az autoantitestek hatása e tesztek pontosságára és érzékenységére nem egyértelmű. Öt kereskedelmi tesztkészlet áll rendelkezésre az ADAMTS13 antigénszint mérésére, de nem végeztek validálást és összehasonlítást más tesztekkel.

2015-ben létrehozták az ADAMTS13 első nemzetközi standardját, és 14 ország 32 laboratóriumában tesztelték az ADAMTS13 aktivitását és antigénszintjét a helyi standardokkal szemben.147 Ezt a WHO IS (12/252) néven jelölt plazma standardot 38 normál, egészséges donor összevont plazmájából nyerték. Ez a vizsgálat az ADAMTS13 aktivitás konszenzusos átlagértékét 0,91 egység/ml-ben mutatta ki erre a plazmára, 12,4%-os laboratóriumok közötti eltéréssel, és 0,92 egység/ml ADAMTS13 antigén értéket, 16,3%-os laboratóriumok közötti eltéréssel. A nagy laboratóriumok közötti eltérés elsősorban nem az eltérő helyi standardok használatának, hanem a laboratóriumok közötti módszertani különbségeknek volt köszönhető.

Az ADAMTS13-ellenes autoantitestek vizsgálatát általában úgy végzik, hogy a hő inaktivált betegplazmát ismert mennyiségű összevont normál plazmával keverik össze, és mérik a maradék ADAMTS13-aktivitást. A nem semlegesítő antitesteket immunoblottinggal mutatják ki.148

Bár eddig nem azonosítottak nem antitest ADAMTS13-specifikus inhibitort, számos fehérje és peptid képes gátolni a VWF ADAMTS13 hasítását speciális körülmények között. Ezek közé tartozik a hemoglobin, az IL-6, a tromboszpondin-1 és a neutrofil α-defenzinek. Az inhibitorok minden esetben nyilvánvalóan megkötik a szubsztrátot, a VWF-et, és megakadályozzák, hogy a VWF-et az ADAMTS13 hasítsa. Kimutatták, hogy a hemoglobin ilyen módon hat, áramlás alatt megköti a VWF szálakat az endotél felszínén, és kompetitíven blokkolja az ADAMTS13 általi hasítást.149 Ez a mechanizmus hozzájárulhat a jelentős hemolízissel rendelkező sarlósejtes betegek vaso-occlusiv szövődményeihez, és tovább bonyolíthatja a TTP-t, ha a hemolitikus arány magas. Az IL-6 magas koncentrációi (50 és 100 ng/ml) szintén gátolják az endothelialis ULVWF szálak ADAMTS13 által közvetített hasítását áramlás alatt in vitro,50 ami arra utal, hogy ez a mechanizmus hozzájárulhat a trombózishoz a citokinvihar150 vagy a citokinfelszabadulási szindróma során.151. A tromboszpondin-1, a vérlemezkék α-granuláiban bőségesen jelenlévő fehérje, amely vérlemezkeaktivációkor a keringésbe kerül, megköti a VWF A2-A3 régióit, kompetitíven blokkolva és gátolva az ADAMTS13 általi hasítást in vitro.152 A tromboszpondin-1 e prothrombotikus tulajdonsága összhangban van a tromboszpondin-1 knockout egerekben megfigyelt, aktivált vagy sérült endotélhez való hibás trombocita rekrutációval és a trombocita trombusok fokozott embolizációjával.153 Az aktivált neutrofilekből felszabaduló, α-defenzinek néven ismert humán neutrofil peptidek képesek megkötni a VWF A2 doménjét és kompetitívan blokkolni az ADAMTS13 által közvetített hasítást.154 Az α-defenzinek koncentrációja akár hétszeresére is megnő a szerzett TTP-ben szenvedő betegek plazmájában.

Az α-defenzinek koncentrációja akár hétszeresére is megnőhet.