Alai

A T. reesei rövid története

A sör, bor és sajt előállítására használt gombák legősibb biotechnológiai gyakorlatai több évezredes múltra, azaz az írástudó civilizáció kezdetére nyúlhatnak vissza. Ezzel szemben a filamentózus mezofil aszkomycéta Trichoderma reesei (majd Trichoderma viride) felfedezése az extracelluláris cellulázok előállítására való elképesztő képessége miatt alig több mint 70 évvel ezelőtt történt. Kezdetben a II. világháború alatt a Salamon-szigeteken az amerikai hadsereg rothadó felszereléséből izolált eredeti Trichoderma sp. pusztító potenciálját meglehetősen problematikusnak tartották. Ennek ellenére nem telt el sok idő, mire a Natick Army Research Laboratories kutatói Mary Mandels és Elwyn T. Reese, a névadó kutató, arra törekedtek, hogy ezt a problémás potenciált célzott termékké alakítsák. Egy 14 000 penészgomba szűrése során a Quartermaster Collection Trichoderma sp. QM6a kiemelkedő képességet mutatott a natív kristályos cellulóz lebontására. A “QM6a” megjelölés az utolsó megmaradt eredeti Trichoderma izolátumra, amely a Natickban található Quartermaster Collectionben tárolt hat gomba kultúra közül a hatodikként azonosította, megmaradt. Ezt a törzset nemcsak a T. reesei referenciatörzsének tekintik, hanem ez az a törzs, amelyből az iparban ma használt összes mutáns származik.

A T. reesei kutatását akkor és most is az a gondolat hajtotta előre, hogy a T. reesei szekretált cellulázai megváltoztathatják a megújuló, lignocellulóz biomasszából történő gazdaságos üzemanyag-előállításért folytatott 200 éves küzdelmet. A T. reesei kutatás azóta úttörő szerepet játszott a cellulóz különböző celluláz-aktivitások szinergikus kombinációjával történő enzimatikus szacharizálásának koncepciójában, és megalapozta az érintett enzimek szabályozásának jelenlegi megértését. A fő cellobiohidroláz CBH1 (CEL7a) volt az első eukarióta celluláz, amelyet klónoztak, és az első celluláz, amelynek szerkezetét megoldották . A T. reesei cellulázok ipari alkalmazása felé tett fontos lépés volt a hatékony törzsmutagenezis és szűrési eljárások kifejlesztése az 1970-es években. A következő két évtizedben az eredeti QM6a törzs által termelt extracelluláris fehérje titerét a Natick és a Rutgers Egyetem mutagenezis programjai révén akár 20-szorosára is növelni lehetett. Ez utóbbi a RUT-C30 törzs izolálásában csúcsosodott ki (ahol a “RUT” a Rutgers rövidítése). Bár az iparban a celluláztermelés arany standardja a jelentések szerint 100 g/l-nél magasabb volt, ez a törzs még mindig a nyilvánosság számára elérhető celluláz-hipertermelő prototípusa, amelynek extracelluláris fehérje-titerei a cellulázindukáló szubsztrát laktózon elérik a 30 g/l-t.

A cellulázok más kereskedelmi alkalmazásait is kifejlesztették, mivel világossá vált, hogy a lignocellulóz biomassza hatékony és teljes szacharizálása fermentálható cukorrá sokkal több enzimaktivitást igényel, mint azt kezdetben gondolták. A T. reesei bevonásával végzett kutatások továbbra is új utakat nyitottak a cellulóz és a hemicellulóz lebontásának enzimológiájában, és ez még ma is így van. A nagysebességű atomi erőmikroszkópia most már a cellulóz lebontását is láthatóvá tette, bemutatva, hogy a fő cellobiohidroláz CBH1/CEL7A hogyan csúszik egyirányúan a cellulóz felszínén . Az 1990-es évek elejére elérhetővé váltak a T. reesei géntechnológiáját megkönnyítő transzformációs technikák . Az elkövetkező évtizedben ezek a technológiák jelentős szerepet játszottak abban, hogy új betekintést nyerjünk a gomba enzimeinek szabályozásába és a gomba által szekretált enzimprofil megváltoztatásába . Abban az időben a T. reesei az emlős fehérjék expressziójának első gazdaszervezetei közé tartozott, mint például a borjúchimozin expressziója a cbh1 (cel7a) expressziós jelek alatt .

Az 1990-es évek végére Kuhls és munkatársai felfedezték, hogy a Hypocrea jecorina valójában a T. reesei ivaros formája, ami az oka annak, hogy számos későbbi publikáció a T. reesei helyett a H. jecorina fajnevet használta. Az ivaros fejlődés részletesebb tanulmányozása vezetett ahhoz a hipotézishez, hogy a QM6a törzs valójában nőstény steril, ami később a ham5 MAP-kináz-állványzatot kódoló gén mutációjához köthető .

Az ezredfordulón, amely a genetika számára az izolált gének és útvonalak tanulmányozásától a teljes genomok tanulmányozása felé való elfordulást jelentette, a T. reesei megérkezett az úgynevezett genomikus korszakba. A T. reesei génexpresszió tanulmányozásának első globális megközelítése 2003-ban a Foreman és munkatársai által végzett transzkriptomikai vizsgálat volt, akik a T. reesei genom több mint 5000 különböző transzkriptumának megfelelő cDNS-eken alapuló DNS-mikrotáblákat készítettek. Öt évvel később az eredeti T. reesei QM6a izolátum genomszekvenálása és elemzése megalapozta a genomszéles vizsgálatok széles körű alkalmazását. A következő években számos celluláz hiper- és nulltermelő törzs összehasonlító genomikai elemzése vezetett a celluláz hipertermelésben szerepet játszó potenciális új tényezők, például a nukleocitoplazmatikus transzport, a vakuoláris fehérjeforgalom és az mRNS-forgalom felfedezéséhez. Ezeknek az összehasonlító elemzéseknek jót tett az a tény, hogy az összes tudományos és ipari felhasználású T. reesei törzs a QM6a törzsből származik. Hatvanöt évvel azután, hogy Elwyn Reesei először vizsgálta a cellulóz T. reesei által történő lebontását, a világon a cellulózalapú bioüzemanyag-előállítási kapacitás jelenleg 480,5 millió liter/év (MMLY) etanol, amelyből 380,5 MMLY-t (vagy nagyjából 80 %-ot) állítanak elő T. reesei enzimkészítmények, például az Accellerase és a Cellic segítségével (1a. ábra). Ez az erőfeszítés kétségtelenül megkövetelte az alapul szolgáló technológia több szintű érlelését, beleértve a folyamattechnikát és a szubsztrát-előkezelést. Az enzimkészítmények előállítása és optimalizálása a biomassza cukrosítási lépéshez azonban a cellulózalapú etanolfolyamatok költségteljesítményét meghatározó egyik kulcstényező volt és marad. Ezenkívül a T. reesei felhasználásával történő enzimtermelés korántsem korlátozódik a biofinomító enzimek előállítására. Valójában az Association of Manufacturers and Formulators of Enzyme Products által regisztrált összes technikai enzimkészítmény mintegy 11 %-át T. reesei mint expressziós gazdaszervezet felhasználásával állítják elő (1b., c. ábra). Végül, de nem utolsósorban a T. reesei továbbra is fontos szerepet tölt be a kutatásban, amit jól példáz, hogy évente több mint 100, a gombával vagy annak enzimjeivel foglalkozó kutatási cikk jelenik meg (1d. ábra).

The T. reesei biomass enzyme mix: new insights and limitations

A természetben a lignocellulóz lebontását ritkán végzi egyetlen szervezet. Inkább több olyan organizmus egymást követő sorrendben és közös erőfeszítésével valósul meg, amely több szénhidrát-aktív enzimet (CAZimeket) termel a különböző polimerek lebontására. Ezért nem meglepő, hogy a T. reesei szekretált cellulázkeverékét jelentősen át kellett alakítani ahhoz, hogy a teljes lignocellulóz-szacharifikációhoz költséghatékony enzimkészítményt szolgáltasson. A kutatók már korán felismerték, hogy a T. reesei formulák nem rendelkeznek elegendő β-glükozidáz aktivitással, mivel az aktivitás nagy része a gomba sejtfalához kötődik. Következésképpen a megnövelt β-glükozidáz aktivitás javította a cellulóz lebontását, mivel ellensúlyozza a termék gátlását a cellobiózon keresztül, amely viszont az endoglükanázok és a cellobiohidrolázok kooperatív hatása révén szabadul fel . Ez a visszacsatolási mechanizmus egyébként súlyosan lelassítja a cellulóz szacharifikációját. Hasonlóképpen, a hemicellulózból származó xilo- és mannooligoszacharidok gátolják a T. reesei cellobiohidrolázait, ami erősen jelzi, hogy elegendő β-xilozidáz és β-mannozidáz aktivitás szükséges a lignocellulóz hatékony lebontásához. 2003-ban Foreman és munkatársai két olyan fehérjét írtak le, amelyek a fő cellulázokkal együtt indukálódnak, és cellulóz indukált fehérje 1 és 2 (CIP1 és CIP2) néven nevezték el őket. Azóta kimutatták, hogy fontosak a lignocellulóz hatékony lebontásában. A legújabb eredmények azt mutatják, hogy a CIP1 szerkezeti hasonlóságot mutat a liázokkal, bár a liázaktivitást nem sikerült kimutatni , és hogy a CIP2 a CE15 családba tartozó glükuronoilészteráz . Egy másik fontos szekretált fehérje a swollenin SWO1 , amely egy szénhidrátkötő modult (CBM) tartalmaz, amely egy expansinszerű doménhez kapcsolódik . A cellulózbontó aktivitás ellenére az SWO1 szinergikusan fokozza az endoxilanáz, nem pedig az endoglükanáz vagy a cellobiohidroláz aktivitását az előkezelt kukoricaszár enzimatikus hidrolízise során. Az egyik javasolt hatásmód az, hogy a lignocellulóz xilánrészét hozzáférhetőbbé teszi a xilanázok általi lebontás számára, és ezáltal közvetve elősegíti a cellulázok hatását. A cellulóz lebontása terén az elmúlt évek legnagyobb forradalmát vitathatatlanul a lítikus poliszacharid-monooxigenázok (LPMO) felfedezése jelentette. Ezek az enzimek új, oxidatív mechanizmust vezettek be a poliszacharidok lebontásában. A cellulóz lebontása során feltételezik, hogy az LPMO-k a kristályos cellulózfibrillumok felületén hatnak, ezáltal hozzáférhetőbbé téve azokat a cellulázok számára. Érdekes módon ezek az enzimek az ehhez a folyamathoz szükséges elektronokat a növényi sejtfal ligninjéből nyerhetik hosszú távú elektronátvitel útján, ezáltal a növény védelmi mechanizmusait ellene fordítva . Alternatívaként a GMC oxidoreduktázok vagy cellobióz-dehidrogenázok is működhetnek elektrondonorként . Ez a megállapítás jól megmagyarázhatja, hogyan táplálja a T. reesei az LPMO-it, mivel korábban kimutatták, hogy számos ilyen GMC oxidoreduktázt valóban indukál a búzaszalma . Ez az oxidatív mechanizmus azonban korántsem korlátozódik a cellulóz depolimerizációra. Az eredetileg a kitin esetében kimutatott LPMO-k a xiloglükán és az amilóz lebontásában is szerepet játszanak . A CAZy adatbázisban az e csoportba tartozó enzimeket a korábbi glikozid-hidrolázok (pl. GH61) besorolásukkal szemben “segédtevékenységek” (AA) kategóriába sorolták át, és a 9-11. és 13. AA családban találhatók . Amint azt korábban vázoltuk, a hemicellulolitikus tevékenységek fontosak a lignocellulóz teljes szacharizálódásához (áttekintette Harris et al. ). Az egyes aktivitások különböző mennyiségére van szükség a szubsztrátban jelen lévő hemicellulóz típusoktól függően. Ezért figyelemre méltó, hogy a T. reesei enzimrepertoárja bizonyos típusú hemicellulóz-specifikus kötések esetében egyértelmű korlátokkal rendelkezik. Az egyik ilyen hiányzó aktivitás az α-xilozidáz. Az α-xilozidáz hozzáadása egy kereskedelmi forgalomban kapható T. reesei enzimkészítményhez fokozta a xilóz és a glükóz felszabadulását az előkezelt kukoricaszárból. Hasonlóképpen, a glükomannánnal és xilánnal szembeni aktivitással rendelkező GH család 5 celluláz hozzáadása jelentősen javította a szintetikus T. reesei enzimkészítményt . A T. reesei cellulázkeverékből hiányzó vagy erősen korlátozó egyéb tevékenységek közé tartozik az endo-arabináz és számos pektináz aktivitás . A kereskedelmi cellulázkeverékek kiegészítése ezekkel az enzimaktivitásokkal következésképpen javította a különböző szubsztrátok cukrosítását . Egy másik, még megválaszolandó kérdés a T. reesei genomban kódolt szekretált laccáz-szerű multikopperoxidázok in vivo funkciója .

A T. reesei mint fehérjetermelő gazdaszervezet fejlesztése

Mivel a cellulázok és a többi lignocellulózt lebontó enzim többsége koordináltan és feltételesen expresszálódik , a transzkripciós szabályozásuk logikus mérnöki célpontot jelent a gomba celluláztermelésének javítására. Az egyik fő szabályozó a szén-katabolit repressziót közvetítő C2H2 típusú CRE1 transzkripciós faktor. A CRE1 leállítja célgénjeinek transzkripcióját, ha kedvezőbb szénforrások, például glükóz van jelen. Ennek csonkítása az egyik fő oka a T. reesei QM6a törzs RUT-C30 törzshöz vezető random mutagenezis programokkal elért jobb celluláztermelésnek, amely a celluláztermelés magasabb alapszintjét és indukált szintjét is mutatja. Hasonlóképpen, a fő cellobiohidroláz cel7a promóter régiójában a CRE1 kötő motívumok cseréje egy ismert cellulázaktivátor motívumaira csökkenti a szénkatabolit repressziót, és növeli a cel7a transzkripciót aktiváló és represszáló körülmények között . Ezenkívül a celluláz, a xilanáz és számos más, a lignocellulóz lebontásában részt vevő enzimeket kódoló gén transzkripciója szigorúan függ a Zn(II)2Cys6 típusú XYR1 transzkripciós aktivátortól . Ez ellentétben áll más gombákkal, beleértve a Sordariomycetes Neurospora crassa-t és a Fusarium fujikuroi-t, ahol az XYR1 ortológja kizárólag a xilanáz gének expresszióját modulálja. Az XYR1 csonka formájához vezető mutációt találtak, amely a QM9136 törzs celluláz-negatív fenotípusát okozza, amely a Natick mutagenezis programjából származik. Ennek megfelelően a celluláz túl- és túltermelő mutánsok az xyr1 transzkripciós aktivátorok mRNS-ének emelkedett szintjével rendelkeznek. Az is bebizonyosodott, hogy az XYR1 túlexpressziója a cellulázok magasabb expressziójához vezet, és megszünteti a katabolit repressziót glükóz jelenlétében . Továbbá az XYR1 feltételezett szabályozó régióján belüli pontmutáció hasonlóan deregulált expressziós mintázathoz vezet . Az XYR1 és a CRE1 mellett három transzkripciós faktor, az ACE1, ACE2 és ACE3 szabályozza a cellulázok és xilanázok expresszióját a T. reesei-ben . A CRE1-hez hasonlóan az ACE1 is egy C2H2 cinkujjas represszor, ezért deléciója javítja mind a cellulázok, mind a xilanázok termelését . Az ACE2 és ACE3 az XYR1-hez hasonlóan Zn(II)2Cys6 típusú transzkripciós aktivátorok . Ha az ace2 hiányzik, a cellulázok és a xilanázok transzkripciója ennek megfelelően csökken, bár a celluláz szoforóz általi indukciója nyilvánvalóan érintetlen marad. Az ace3 törlése teljesen megszünteti a cellulázok transzkripcióját, de csak a xilanázokét csökkenti. Míg az ACE2 túlterjedését még nem kísérelték meg, az ACE3 túlterjedése mindkét enzimtípus aktivitásának növekedéséhez vezet, csakúgy, mint hat másik, eddig nem jellemzett szabályozó túlterjedése . Ezek közé tartozik két további Zn(II)2Cys6 típusú transzkripciós faktor, valamint két WD40 fehérje, egy bromodomain fehérje és egy gcn5 rokon acetiltranszferáz. Mindhárom Zn(II)2Cys6 transzkripciós aktivátor (XYR1, ACE2 és ACE3) hasonlít az S. cerevisiae jól jellemzett Gal4 fehérjéjére. Jól ismert, hogy a Gal4 toborozza a Gcn5-tartalmú SAGA komplexet, és ezáltal elősegíti a célgének transzkripcióját hiszton acetiláción és euchromatin képződésen keresztül. Tény, hogy a T. reesei Gcn5 ortológja nélkülözhetetlen a celluláz expressziójához, és részt vesz a hisztonok acetilálásában a cbh1 promóterben . Az elmúlt években kialakult egy olyan kép, amely azt mutatja, hogy a cellulázok és a kapcsolódó CAZimek átírását gombákban számos transzkripciós faktor kombinációja szabályozza, amelyek egy komplex transzkripciós-szabályozó hálózatot képviselnek, amelyet ellentétes hatású aktivátorok és represszorok befolyásolnak. A Penicillium oxalicumban például húsz transzkripciós faktor modulálja a celluláz gének aktiválódását vagy represszióját. Ezek közül a ClrB-t az összes többi regulátor és a célgénjeik kulcsfontosságú integrátoraként azonosították. E szabályozók homológjai megtalálhatók a T. reesei-ben, de a növényi sejtfalszabályozás adaptációinak sokféleségét tekintve várható, hogy más és más szabályozók is jelentős szerepet játszanak. A cellulázszabályozás másik kulcsszereplője a T. reesei ortológja a rejtélyes Aspergillus LaeA , amely különböző gombákban részt vesz a másodlagos metabolitok géncsoportjainak szabályozásában. Míg ennek a feltételezett fehérje-metiltranszferáznak a deléciója a különböző celluláz- és más CAZyme-gének erős downregulációjához vezet, addig a túlexpressziója erősen elősegítheti ezek kifejeződését . Hasonló hatást találtak a VELVET komplex LAE1 interakcióban lévő VEL1 fehérjéje esetében is .

A fent említett tanulmányok többsége alapvető betekintést nyújt a cellulázképzés szabályozásába. Mivel e vizsgálatok többségét vagy az eredeti T. reesei QM6a izolátumon, vagy a mérsékelten túltermelő QM9414 törzsön végezték, továbbra sem világos, hogy ezek a hatások megvalósíthatók-e és milyen mértékben a túltermelő törzsekben. Ezekben a törzsekben a transzkripció helyett olyan folyamatok, mint a transzláció, a szekréció és a szekretált enzimek forgalma korlátozhatják a celluláztermelés további növekedését. Érdekes lesz látni, hogy a celluláz génexpresszió javításának több bejelentett módja halmozható-e egymásra, és hogyan teljesítenek az ilyen törzsek a véletlenszerű mutagenezissel nyert hipertermelőkkel összehasonlítva.

Az érdeklődésre számot tartó gén transzkripciójának egyszerű fokozása nem mindig vezet jobb termékképzéshez, különösen a nem gombafehérjék esetében. Az alacsony termékképződés megkerülésének egyik sikeres stratégiája a fúziós gén megközelítés, amely a magasan expresszált gén promóter és terminátor régiója mellett a kódolt fehérjét is expressziófokozóként használja. A T. reesei esetében ez a cel7A-t kódoló cellobiohidroláz, amely celluláz indukáló körülmények között a legerősebben expresszálódó fehérje. Úgy gondolják, hogy ezek a génfúziók általában növelik az mRNS stabilitását, az ER-be történő importálást és a szekréciós útvonalon való áthaladást. Ebből a célból gyakran kihasználják a CEL7A moduláris szerkezetét, amely egy katalitikus modulból, egy linkerből és egy CBM-ből áll, így a C-terminális CBM-et a kívánt gén helyettesíti. Ennek a génfúziós megközelítésnek ma már léteznek olyan változatai, amelyek a fehérjét az ER-be irányítják a megfelelő hajtogatás, diszulfidhíd-képzés és glikoziláció céljából, de ezt követően a fehérje intracelluláris felhalmozódását célozzák, hogy elkerüljék a kívánt termék extracelluláris proteázok általi lebontását. Az egyik ilyen stratégia hidrofobinokat használ, amelyekhez hordozóként egy ER-visszatartó jel kapcsolódik. Ezek a fúziós fehérjék micellaszerű struktúrákba rendeződnek, és tenzid alapú vizes kétfázisú rendszerrel tisztíthatók. Egy másik stratégia a fehérjéknek az ER-be történő célba juttatására a kukorica tárolófehérjéből származó γ-zein peptidet (ZERA) használja. Analóg módon ezek az önszerveződő fúziós fehérjék ER-membránnal körülvett fehérje testeket alkotnak, amelyek megvédik őket a proteolízistől . A gombáknak az emlős fehérjék hatékony termelőgazdájaként való kifejlesztéséhez a fermentációs levesben gyakran előforduló proteázok inaktiválására is szükség van. Egy szisztematikus vizsgálat során különböző szekretált proteázokat azonosítottak, amelyek a biofarmakonok, köztük az antitestek, az interferon α 2b és az inzulinszerű növekedési faktor lebontásával kapcsolatosak, és számosat inaktiváltak. Ez nemcsak a proteáz aktivitás drasztikus csökkenéséhez, hanem mindhárom rekombináns fehérje stabilitásának erős növekedéséhez is vezetett, az antitest esetében a legkifejezettebb volt a hatás. Bár az N-glikozilációs mintázatot már korábban is próbálták módosítani nagy értékű terápiás fehérjék előállítása céljából, az autentikus humán glikozilációs mintázat létrehozása gombás expressziós gazdaszervezetben jelenleg nem tűnik megvalósíthatónak. Ezért kérdéses, hogy ilyen biofarmakonokat fognak-e a jövőben gombasejtgyárakban előállítani, különösen a CHO sejtek gyors fejlődését figyelembe véve .

A fent említett hidrofobinok a fehérjék másik olyan csoportja, amely jelentős figyelmet kapott felületaktív tulajdonságaik miatt . Ezek a kisméretű, extracelluláris fehérjék amfifil tulajdonságaiknak köszönhetően a hidrofób/hidrofil határfelületeken fehérjerétegekbe rendeződnek, és a hidrofób felületeket nedvesíthetővé, a hidrofil felületeket hidrofóbiássá teszik. Az élelmiszeripari és orvosi alkalmazásokban széleskörű lehetőségük van a hidrofób anyagok diszpergálására, a habok stabilizálására vagy a különböző molekulák felszínekre történő célzására . A cerato-plataninok a négy konzervált ciszteinnel rendelkező kis, szekretált fehérjék másik csoportja. Kötődnek a kitinhez és az N-acetilglükózamin oligoszacharidokhoz, és önegyesítő tulajdonságokkal rendelkeznek a hidrofób/hidrofil határfelületeken. A hidrofobinokkal ellentétben a cerato-plataninok inkább a felületek polaritási/apolaritási tulajdonságait fokozzák. A különböző CAZimekben jelen lévő CBM-eknek célzott funkciót is tulajdonítanak. Javíthatják annak a katalitikus doménnek a hidrolitikus aktivitását, amelyhez kapcsolódnak, és kedvezőbb pH- és hőmérsékleti optimumhoz vezethetnek . Szénhidrátkötő tulajdonságaik továbbá kihasználhatók a fúziós fehérjék affinitási tisztítására, pl. cellulóz oszlopok segítségével . A rekombináns CBM-ek egyéb alkalmazásainak széles skáláját a közelmúltban máshol áttekintettük .

Trichoderma reesei a konszolidált biofeldolgozáshoz és az egészsejtes katalízishez

A konszolidált biofeldolgozás (CBP) klasszikusan a cellulóz etanol előállítási folyamat cellulolitikus enzimtermelésének, enzimatikus hidrolízisének és fermentációs lépéseinek egyetlen egységnyi műveletbe történő integrálását jelenti. Ezért kívánatos lenne egyetlen, jó cellulolitikus tulajdonságokkal és hatékony etanol-fermentációs útvonallal rendelkező szervezet. Mindazonáltal a mikrobiális konzorciumok használata is kapott némi figyelmet . Sajnos jelenleg nem áll rendelkezésre egyetlen olyan organizmus, amely mindkét követelménynek megfelel (2. ábra). Következésképpen erőfeszítéseket tettek arra, hogy az etanologének cellulolitikussá, illetve a cellulolitikus organizmusok etanologénné váljanak. Az első forgatókönyvvel összefüggésben a T. reesei gyakran szolgált CAZyme géndonorként, különösen a két endoglükanázt kódoló cel5a és cel7b, valamint a két cellobiohidroláz, a cel6a és a cel7a esetében (1. táblázat). Valamennyi közzétett vizsgálatban a S. cerevisiae viszonylag alacsony szekréciós kapacitása korlátozta a szekretált vagy membránban lehorgonyzott heterológ CAZymek szubsztrátkonverzióját. Ezért a reális cellulóz szubsztrátokkal elérhető magas etanolhozamhoz kereskedelmi forgalomban kapható T. reesei enzimkoktélokkal való kiegészítésre volt szükség. Mindazonáltal, miközben a mesterséges S. cerevisiae törzsek szekréciós és felszíni megjelenítési kapacitásának javítására irányuló erőfeszítések jelenleg is folynak, a jelenleg rendelkezésre álló celluláz megjelenítő törzsek már képesek a biomassza szacharifikációjához szükséges enzimterhelés jelentős csökkentéséhez vezetni. A második forgatókönyvvel összefüggésben maga a T. reesei ígéretes célszervezetet jelent. De bár ez a gomba a természetben rendelkezik azzal a képességgel, hogy a biomasszához kapcsolódó összes cukrot metabolizálja és etanollá alakítsa, a hozamok alacsonyak, és nem kívánt melléktermékként ecetsav képződik. Másrészt a T. reesei nagyméretű fermentációs rendszerei jól megalapozottak, mivel széles körben alkalmazzák a kereskedelmi enzimtermelésben, és a géntechnológia molekuláris eszközei is nagyon jól kidolgozottak. A T. reesei CBP organizmusként való alkalmazása előtt álló egyik nagy kihívás az, hogy számos celluláz és glikolitikus génje elnyomódik a hipoxia hatására, ami szükséges az etanoltermeléshez. Ezenkívül a cellulázok transzkripciós repressziója etanol jelenlétében további leküzdendő kihívást jelent. A celluláz hipertermelő RUT-C30 törzs azonban nagyobb etanoltoleranciával rendelkezik, mint a Natick vonalból származó QM9414 törzs , és ezért tökéletes platformtörzset jelent a T. reesei mint CBP szervezet fejlesztéséhez, különösen mivel a szénkatabolit derepresszált is. Továbbá lignocellulóz-pép jelenlétében a RUT-C30 a fermentáció korai szakaszában pelletszerű morfológiát mutat, ami a Triton X-100 felületaktív anyag hozzáadásával növekedéstől független módon érhető el, majd magasabb enzimtermeléshez is vezet. Ez azért fontos, mert a rossz keverhetőség és az alacsony maximális sejtsűrűség a fonalas növekedés következtében eddig akadályozta a T. reesei CBP szervezetként való felhasználását. Általánosabban szólva, a konszolidált biofeldolgozás más integrált folyamatok leírására is használható, amelyekben a szubsztrát nem feltétlenül lignocellulóz biomassza, hanem más biopolimer, például kitin vagy keményítő, és a termék nem etanol, hanem bármilyen más metabolit . Ebből a célból a közelmúltban több tanulmány is foglalkozott különböző metabolitok túltermelésével a T. reesei géntechnológiáján keresztül (2. táblázat). Az elérhető hozamok azonban a legtöbb esetben messze voltak a kereskedelmi hasznosíthatóságtól, ezért további optimalizálást igényeltek.

A sejttervezés és -mérnökség eszközei

Míg a T. reesei és más Trichoderma fajok molekuláris eszköztáráról két átfogó áttekintés csak a közelmúltban jelent meg , ezeket szeretnénk frissíteni a terület legújabb eredményeivel. A célzott törzsfejlesztés a jobb celluláztermelés vagy a metabolikus mérnöki munka érdekében hatékony módszereket igényel a szervezetbe történő irányított genetikai módosítások bevezetésére. A géncélzás általában alacsony hatékonysága sokáig nagy kihívást jelentett a deléciós vagy expressziós kazetta homológ integrálásával ésszerű számú transzformáns előállítása szempontjából. Ezt a problémát főként a DNS-javítás nem-homológ végcsatlakozási (NHEJ) útvonalának olyan komponenseinek inaktiválásával oldották meg, mint a tku70 vagy a tmus53 . A Tku70 deletált törzsek jobb géncélzást mutatnak, bár a homológ integráció hatékonysága ezekben a törzsekben még mindig változhat a célzott lókusztól függően, és így akár 30 %-ra is csökkenhet. E javulás alapján számos új megközelítést dolgoztak ki az expressziós kazetták meghatározott genomi régióba történő beillesztésére, ezáltal elkerülve a véletlenszerű integrációjuk okozta pleiotróp hatásokat. Jorgensen és munkatársai tku70 hátteret használva olyan expressziós platformot fejlesztettek ki, amely a könnyen szűrhető ade2 lókuszt használja az integráció preferált helyeként. Az expressziós kazetta e lókuszba történő integrálásakor az ade2 elpusztul, és a keletkező transzformánsok határozott vörös pigmentációt fejlesztenek ki. Egy másik vizsgálatban a pyr4 és asl1 lókuszokat választották ki egy uridin- és l-arginin auxotrófiával rendelkező törzs kifejlesztésére, amely lehetővé teszi a helyhez kötött integrációt ezeken a helyeken . Ouaedraogo és munkatársai más stratégiát követtek, és az S. cerevisiae I-SceI meganukleázát expresszálták T. reesei-ben. Az I-SceI mesterséges kettősszál-töréseket hoz létre az I-SceI felismerőhelyen, amelyet előzetesen egy előre meghatározott lókuszon vezettek be, és javította mind a transzformáció, mind a homológ integráció hatékonyságát. Egy további vizsgálatban az I-SceI által közvetített kettős szálszakadást tku70 delécióval kombinálták. Itt a kettős szálszakadások NHEJ útján történő javításának képtelensége a kazetta integrációjának kedvez, ami akár 100 %-os homológ rekombinációs hatékonyságot eredményez. A géntechnológia vagy a genomszerkesztés forradalmát a CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 rendszer vezette be . Az ilyen technológia szükségességét és az enzimgyártó jelentőségének növekedését is alátámasztva, ezt a rendszert először filamentózus gombák esetében tesztelték a T. reesei . A géncélzás stimulálása érdekében specifikus DNS-kettősszál-töréseket vezet be, és csak a Cas9 (CRISPR-hez kapcsolódó) nukleáztól függ, amely egyetlen kimérai vezető RNS-t használ a célzáshoz. Ennek az RNS-vezetett Cas9-nek a pontos célzását egy adott DNS-szekvenciára a vezető RNS protospacer szekvenciája biztosítja egyszerű bázispárosítással. A géndeléciós konstrukcióhoz 200 bp up- és downstream flanking régiót használva 90 % feletti HR-frekvenciát lehetett elérni. Kettős deléciók és hármas deléciók 45, illetve 4 %-os gyakorisággal fordultak elő egyetlen transzformációs kört követően. Míg ebben a vizsgálatban az in vitro átírt vezető RNS-eket a deléciós kazettával együtt transzformálták egy Cas9-et expresszáló T. reesei-be, addig Nødvig és munkatársai két flankáló ribozim szekvenciát használtak arra, hogy a vezető RNS-eket egy nagyobb, a Cas9 enzimet is kódoló átiratból szabadítsák fel különböző Aspergilliekben. Egy másik alapvető eszköz, amelyre mind a rekombináns fehérjeexpresszióban, mind a törzsmérnökségben szükség van, a promóterek, amelyek lehetővé teszik a gének szabályozható módon történő kifejeződését. Bár számos indukálható és represszálható promóter áll rendelkezésre a különböző celluláz promóter régiókkal, ezek általában hátrányokkal járnak, mivel expressziójuk a gazdaszervezet anyagcseréjéhez kötött, és az aktivátorok a promóter titrációs hatásai miatt korlátozóak lehetnek. Hasznos alternatívák közé tartozik az l-metionin represszibilis T. reesei gének különböző bazális expressziós erősségű készlete . Kimutatták, hogy e promóterek egyike képes különböző riportergének represszív kifejeződését több szénforráson, többek között búzaszalmán is irányítani. Egy hasonló vizsgálatban a T. reesei egyik rézpermeáz génjének promóterét használták a xyr1 fő celluláz és hemicelluláz szabályozó gének expressziójának szabályozására réz hiányában . Tekintettel azonban arra, hogy az AA 9 családba tartozó réztartalmú enzimek fontos összetevői a T. reesei cellulázkeverékének , kétséges azonban, hogy ez a rendszer alkalmazható-e celluláz előállítási forgatókönyvben.

Az izgalmas molekuláris eszközök mellett ma már a klasszikus genetika néhány régebbi trükkje is rendelkezésre áll. A T. reesei törzsfejlesztését sokáig akadályozta az a tény, hogy a gombát aszexuálisnak tartották, ami megakadályozta a törzsek keresztezését. Mérföldkő volt ebben a tekintetben annak megállapítása, hogy a QM6a rendelkezik egy MAT1-2 párosodási lókusszal, és könnyen keresztezhető bizonyos MAT1-1 T. reesei vad típusú izolátumokkal. Amikor azonban a QM6a MAT1-2 lókuszát a MAT1-1 megfelelőjével helyettesítették, az eredeti MAT1-2 QM6a törzzsel való konfrontáció során nem keletkeztek strómák. Következésképpen a QM6a-ból származó különböző tudományos és ipari T. reesei törzseknél nem volt lehetséges a párosítás kihasználása törzsmérnöki célokra. Rendszerbiológiai megközelítéssel azonosították a nőstény sterilitásért felelős hiányzó gént, a ham5-öt. A N. crassa-ban a ham-5 egy olyan fehérjét kódol, amely a sejtfúzió során MAP-kináz vázként szolgál. A funkcionális ham5 újbóli bevezetése helyreállítja a QM6a törzsben a stromata képződést, és lehetővé teszi a nőstény termékenység helyreállítását más, QM6a háttérből származó törzsekben. Ez a megállapítás különösen fontos, mivel a fent említett H. jecorina izolátumokkal való keresztezés szegmentálisan aneuploid utódokhoz vezethet . Ezzel az eszközzel a kezünkben megteremtődött az alapja a releváns mutációk azonosításának, amelyek például celluláz túltermeléshez vezetnek. Ez azért fontos, mert a mutáns fenotípusokat okozó gén(ek) azonosítására szolgáló hagyományos komplementációs megközelítések nagyrészt sikertelenek voltak olyan fajok esetében, mint a T. reesei. És bár a nagy áteresztőképességű szekvenálás és az összehasonlító genomelemzés könnyen azonosítja a mutációkat a celluláz hiper- és nulltermelő QM6a törzsvonalban, ez csak néhány esetben vezetett már egy mutáció és egy adott fenotípus összekapcsolásához. Azokban az esetekben azonban, amikor nagyszámú mutációt találtak, vagy a mutációk ismeretlen funkciójú géneket érintettek, az összehasonlító szekvenciaelemzés nem mutatta ki a kívánt célgének természetét . Ezért több kutató sikeresen alkalmazta az újgenerációs szekvenálással kombinált tömeges szegregátumelemzést a releváns mutációk azonosítására. Ebben a megközelítésben a mutánst egy referencia törzzsel keresztezik, és a kívánt fenotípust mutató szegregánsok genomiális DNS-ét összevonják és szekvenálják. A szekvenált DNS-állománynak a szülői törzsek genomjával való genom-összehasonlítása ezután feltárhatja a fenotípus szempontjából releváns konzervált mutációkat. A fenotípushoz nem kapcsolódó mutációk alulreprezentáltak lesznek. Bár nem várható, hogy ez a megközelítés egyetlen mutáció azonosításához vezet, mivel a releváns mutációhoz közeli mutációk általában együttesen szegregálódnak, a további vizsgálatok célpontjainak száma jelentősen lecsökken.