A koronavírusok az elmúlt két évtizedben két nagyszabású járványt okoztak, a SARS-t és a közel-keleti légúti szindrómát (MERS)8,9. Általánosságban úgy vélték, hogy a SARSr-CoV – amely főként denevérekben található – egy jövőbeli járványkitörést okozhat10,11. Itt egy azonosítatlan tüdőgyulladásos megbetegedés kitörése által okozott esetek sorozatáról számolunk be a közép-kínai Hubei tartományban, Wuhanban. Ez a járványkitörés – amely egy helyi tenger gyümölcsei piacról indult – jelentősen megnőtt, és 2761 embert fertőzött meg Kínában, 80 halálesettel jár, és 20. január 26-ig további 10 országban 33 ember megfertőződéséhez vezetett2 . A betegek jellemző klinikai tünetei a láz, száraz köhögés, légzési nehézségek (dyspnoe), fejfájás és tüdőgyulladás. A betegség kialakulása az alveolusok károsodása miatt progresszív légzési elégtelenséghez vezethet (amint azt a mellkas keresztirányú számítógépes tomográfiás felvételein megfigyelhetjük), és akár halálhoz is vezethet. A betegséget vírus okozta tüdőgyulladásként határozták meg a klinikusok a klinikai tünetek és egyéb kritériumok alapján, beleértve a testhőmérséklet emelkedését, a limfociták és a fehérvérsejtek számának csökkenését (bár ez utóbbiak szintje néha normális volt), a mellkasröntgenfelvételen látható új tüdőinfiltrátumokat, és a háromnapos antibiotikumos kezelést követően sem volt látható javulás. Úgy tűnik, hogy a korai esetek többsége az eredeti tenger gyümölcsei piaccal érintkezett; a betegség azonban mostanra már emberről emberre történő érintkezés útján terjed.
A járvány kitörésének kezdetén a Wuhan Jin Yin-Tan Kórház intenzív osztályára felvett hét súlyos tüdőgyulladásos beteg (akik közül hatan a tenger gyümölcsei piac eladói vagy szállítói) mintáit a Wuhan Virológiai Intézet (WIV) laboratóriumába küldték a kórokozó diagnosztizálása céljából (bővített adatok 1. táblázat). CoV-vizsgálatot végző laboratóriumként először pán-CoV PCR-primereket használtunk e minták vizsgálatához13 , tekintettel arra, hogy a járvány télen és egy piacon tört ki – ugyanabban a környezetben, mint a SARS-fertőzések. Öt mintát találtunk PCR-pozitívnak CoV-re. Egy mintát (WIV04), amelyet a bronchoalveoláris mosófolyadékból (BALF) gyűjtöttünk, újgenerációs szekvenálással végzett metagenomikai elemzéssel elemeztünk a lehetséges etiológiai kórokozók azonosítása érdekében. Az összesen 10 038 758 leolvasásból – amelyből a humán genomból származó leolvasások szűrése után 1 582 teljes leolvasás maradt meg – 1 378 (87,1%) szekvencia felelt meg a SARSr-CoV szekvenciájának (1a. ábra). De novo assembly és célzott PCR segítségével egy 29 891 bázispáros CoV-genomot kaptunk, amely 79,6%-ban megegyezett a SARS-CoV BJ01 szekvenciájával (GenBank accession number AY278488.2). Az összes leolvasás újbóli leképezésével nagy genomlefedettséget értünk el erre a genomra (bővített adatok, 1. ábra). Ezt a szekvenciát benyújtottuk a GISAID-hoz (https://www.gisaid.org/) (EPI_ISL_402124 csatlakozási szám). Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) által adott nevet követve ideiglenesen a 2019-es új koronavírusnak (2019-nCoV) nevezzük. A 2019-nCoV négy további teljes hosszúságú genomszekvenciáját (WIV02, WIV05, WIV06 és WIV07) (GISAID-csatlakozási számok EPI_ISL_402127-402130), amelyek több mint 99,9%-ban azonosak voltak egymással, ezt követően négy további betegből nyertük következő generációs szekvenálás és PCR segítségével (bővített adatok 2. táblázat).
a, Az ICU06-os beteg BALF-jének következő generációs szekvenálással végzett metagenomikai elemzése. b, A 2019-nCoV WIV04 genomiális szerveződése. M, membrán. c, Hasonlósági diagram a 2019-nCoV WIV04 teljes hosszúságú genomszekvenciája alapján. Referencia szekvenciaként a SARS-CoV BJ01, a denevér SARSr-CoV WIV1, a denevér koronavírus RaTG13 és ZC45 teljes hosszúságú genomszekvenciáit használtuk. d, A koronavírusok teljes genomjának nukleotidszekvenciáin alapuló filogenetikai fa. MHV, egérhepatitis vírus; PEDV, sertés járványos hasmenés vírus; TGEV, sertés fertőző gastroenteritis vírus. a skálasávok nukleotidpozíciónként 0,1 helyettesítést jelentenek. A beállítások és a használt szoftver leírását a Módszerek tartalmazza.
A vírus genomja hat fő nyitott olvasókeretből (ORF) áll, amelyek közösek a koronavírusokkal, valamint számos egyéb járulékos génből (1b. ábra). További elemzések azt mutatják, hogy a 2019-nCoV néhány génje kevesebb mint 80%-os nukleotidszekvencia-azonosságot mutat a SARS-CoV-val. Az ORF1ab-ban található hét konzervált replikázdomén aminosav-szekvenciái azonban, amelyeket a CoV-fajok osztályozásához használtunk, 94,4%-ban megegyeztek a 2019-nCoV és a SARS-CoV között, ami arra utal, hogy a két vírus ugyanahhoz a fajhoz, a SARSr-CoV-hoz tartozik.
Ezt követően megállapítottuk, hogy egy denevérkoronavírusból (BatCoV RaTG13) származó RNS-függő RNS-polimeráz (RdRp) rövid régiója – amelyet korábban a Yunnan tartományból származó Rhinolophus affinisban mutattak ki – magas szekvenciaazonosságot mutatott a 2019-nCoV-vel. Teljes hosszúságú szekvenálást végeztünk ezen az RNS-mintán (GISAID accession number EPI_ISL_402131). A Simplot-elemzés azt mutatta, hogy a 2019-nCoV a teljes genomban nagymértékben hasonlított a RaTG13-hoz (1c. ábra), a teljes genomszekvencia azonossága 96,2% volt. A 2019-nCoV, a RaTG13, a SARS-CoV és a korábban bejelentett denevér SARSr-CoV-ok összehangolt genomszekvenciáit felhasználva a 2019-nCoV genomjában nem találtunk bizonyítékot rekombinációs eseményekre. A teljes hosszúságú genom, valamint az RdRp és a spike (S) génszekvenciáinak filogenetikai elemzése azt mutatta, hogy – valamennyi szekvencia esetében – a 2019-nCoV legközelebbi rokona a RaTG13, és a többi SARSr-CoV-tól elkülönülő törzsvonalat alkotnak (1d. ábra és 2. ábra (bővített adatok). Az S gén által kódolt receptor-kötő spike-fehérje nagymértékben eltér a többi CoV-tól (2. ábra, bővített adatok), 75%-nál kevesebb nukleotidszekvencia-azonosságot mutat az összes korábban leírt SARSr-CoV-val, kivéve a RaTG13-mal való 93,1%-os nukleotid-azonosságot (3. táblázat, bővített adatok). A 2019-nCoV és a RaTG13 S génjei hosszabbak, mint a többi SARSr-CoV-é. A 2019-nCoV S génjének szekvenciájában a legnagyobb különbséget az N-terminális doménben található három rövid inszerció, valamint a receptor-kötő motívum öt kulcsmaradékából négyben bekövetkezett változások jelentik a SARS-CoV szekvenciájához képest (kibővített adatok 3. ábra). Tovább kell vizsgálni, hogy a 2019-nCoV S-fehérjének N-terminális doménjében lévő inszerciók a MERS-CoV-hoz hasonlóan szialinsav-kötő aktivitást kölcsönöznek-e. A RaTG13-mal való szoros filogenetikai rokonság bizonyítékot szolgáltat arra, hogy a 2019-nCoV denevérekből származhat.
Gyorsan kifejlesztettünk egy qPCR-alapú kimutatási módszert az S gén receptor-kötő doménjének szekvenciája alapján, amely a genom legváltozatosabb régiója volt (1c. ábra). Adataink azt mutatják, hogy a primerek képesek voltak megkülönböztetni a 2019-nCoV-t az összes többi humán koronavírustól, beleértve a denevér SARSr-CoV WIV1-et is, amely 95%-ban azonos a SARS-CoV-val (bővített adatok 4a, b ábra). A hét betegtől nyert minták közül hat BALF- és öt szájüregi kenetmintát találtunk pozitívnak a 2019-nCoV-ra az első mintavétel során, ahogyan azt a qPCR és a hagyományos PCR értékelte. A második mintavétel során azonban már nem tudtunk víruspozitív mintákat kimutatni az említett betegektől vett száj- és végbéltamponokból, valamint vérmintákból (2a. ábra). Javasoljuk azonban, hogy a 2019-nCoV rutinszerű kimutatásához más qPCR-célpontokat, köztük az RdRp vagy a burok (E) géneket használjanak. Ezen eredmények alapján azt javasoljuk, hogy a betegség levegő útján terjedhet, bár nem zárhatjuk ki az egyéb lehetséges terjedési utakat, mivel további vizsgálatokra van szükség, több beteg bevonásával.
a, A 2019-nCoV molekuláris kimutatása hét betegnél. A betegek adatai az 1., 2. bővített adattáblázatban találhatók. A kimutatási módszereket a Módszerek című fejezetben ismertetjük. AS, anális tampon; OS, orális tampon. b, A 2019-nCoV antitestszintek dinamikája egy betegnél, aki 2019. december 23-án a betegség jeleit mutatta (ICU-06). OD arány, optikai sűrűség 450-630 nm-en. A jobb és bal oldali y tengelyek az IgM és IgG ELISA OD-arányait jelzik. c, A 2019-nCoV antitestek szerológiai vizsgálata öt betegnél (bővített adatok 2. táblázat). A csillag az ICU-06 betegtől 2020. január 10-én gyűjtött adatokat jelzi. b, c, A határérték 0,2 volt az IgM vizsgálatnál és 0,3 az IgG vizsgálatnál, az egészséges kontrollok szintjének megfelelően.
A 2019-nCoV szerológiai kimutatásához a denevér SARSr-CoV Rp3-ból származó, korábban kifejlesztett nukleokapszid (N) fehérjét használtuk antigénként az IgG és IgM enzimhez kötött immunoszorbens tesztekhez (ELISA), mivel ez a fehérje 92%-ban azonos aminosavakat tartalmaz a 2019-nCoV N fehérjével (Extended Data Fig. 5), és a SARSr-CoV7 kivételével nem mutatott keresztreaktivitást más humán koronavírusokkal szemben. A hét vírusfertőzött betegtől csak öt szérummintát tudtunk beszerezni. Egy betegnél (ICU-06) a betegség kezdete után 7, 8, 9 és 18 nappal követtük nyomon a vírusos antitestek szintjét (bővített adatok 2. táblázat). Egyértelmű tendencia volt megfigyelhető az IgG- és IgM-titerekben, amelyek az idő múlásával növekedtek, kivéve, hogy az IgM-titer az utolsó mintában csökkent (2b. ábra). Második elemzésként a 7 vírus-pozitív beteg közül 5 beteg mintáit vizsgáltuk meg a betegség kezdete után körülbelül 20 nappal a vírusellenes antitestek jelenlétére (bővített adattáblázat 1., 2. táblázat). Minden betegmintában – de az egészséges egyénekből származó mintákban nem – erősen pozitív volt a vírus IgG (2b. ábra). Három IgM-pozitív minta is volt, ami akut fertőzésre utal.
A következőkben sikeresen izoláltuk a vírust (2019-nCoV BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019 néven) mind Vero E6, mind Huh7 sejtekből az ICU-06-os beteg BALF-mintájából. A sejtekben három napos inkubációt követően egyértelmű citopatogén hatásokat figyeltünk meg (bővített adatok 6a., b. ábra). A WIV04 törzs azonosságát Vero E6 sejtekben immunfluoreszcens mikroszkópiával igazoltuk a keresztreaktív vírus N antitest használatával (Kiterjesztett adatok 6c., d. ábra), valamint metagenomikai szekvenálással, amelynek legtöbb olvasata a 2019-nCoV-hoz térképeződött, és a qPCR-elemzés azt mutatta, hogy a vírusterhelés az 1. naptól a 3. napra nőtt (Kiterjesztett adatok 6e., f. ábra). A fertőzött sejtek ultravékony metszeteiben a vírusrészecskék tipikus koronavírus morfológiát mutattak, amint azt elektronmikroszkópia segítségével láthatóvá tették (Extended Data 6g. ábra). A vírus IgG-pozitív minták semlegesítő aktivitásának további megerősítése érdekében szérum-neutralizációs vizsgálatokat végeztünk Vero E6 sejtekben az öt IgG-pozitív betegszérummal. Kimutattuk, hogy minden minta képes volt semlegesíteni a 2019-nCoV 100 TCID50 (50%-os szövetkultúra-infektív dózist) 1:40-1:80 hígításban. Azt is megmutattuk, hogy ez a vírus keresztneutralizálható ló anti-SARS-CoV szérummal (L.-F. Wang ajándéka) 1:40-es hígításban; azonban a SARS-CoV antitestekkel való keresztreaktivitás lehetőségét meg kell erősíteni emberből származó anti-SARS-CoV szérummal (bővített adatok 4. táblázat).
AzACE2 ismert, hogy a SARS-CoV14 sejtreceptora. Annak megállapítására, hogy a 2019-nCoV is az ACE2-t használja-e sejtbejutási receptorként, vírusfertőzőképességi vizsgálatokat végeztünk olyan HeLa sejtekkel, amelyek emberből, kínai patkósdenevérből, cibetből, sertésből és egérből származó ACE2 fehérjét expresszálták vagy nem expresszálták. Megmutattuk, hogy a 2019-nCoV az egér ACE2 kivételével minden ACE2 fehérjét képes belépési receptorként használni az ACE2-t expresszáló sejtekbe való bejutáshoz, de az ACE2-t nem expresszáló sejtekbe nem, ami arra utal, hogy valószínűleg az ACE2 az a sejtreceptor, amelyen keresztül a 2019-nCoV bejut a sejtekbe (3. ábra). Azt is kimutattuk, hogy a 2019-nCoV nem használ más koronavírus-receptorokat, például az aminopeptidáz N-t (APN) és a dipeptidilpeptidáz 4-t (DPP4) (bővített adatok 7. ábra).
A vírus fertőzőképességének meghatározása olyan HeLa sejtekben, amelyek expresszálták vagy nem expresszálták (nem transzfektált) ACE2-t. Az S taggel ellátott ACE2 plazmid expresszióját egér anti-S tag monoklonális antitesttel detektáltuk. hACE2, humán ACE2; bACE2, Rhinolophus sinicus (denevér) ACE2; cACE2, cibet ACE2; sACE2, sertés ACE2 (sertés); mACE2, egér ACE2. Zöld, ACE2; piros, vírusfehérje (N); kék, DAPI (sejtmagok). Méretsávok, 10 μm.
A tanulmány részletesen beszámol a 2019-nCoV-ről, a Kínában és más országokban jelenleg zajló akut légúti szindróma járványért felelős valószínű etiológiai ágensről. Minden vizsgált betegnél vírus-specifikus nukleotid-pozitív és vírusfehérje szerokonverziót figyeltek meg, ami bizonyítékot szolgáltat a betegség és e vírus jelenléte közötti összefüggésre. Azonban még mindig sok sürgős kérdés vár megválaszolásra. A 2019-nCoV és a betegség közötti összefüggést nem igazolták állatkísérletekkel, hogy teljesüljenek a Koch-féle posztulátumok egy mikroorganizmus és egy betegség közötti okozati kapcsolat megállapítására. Még nem ismerjük e vírus gazdák közötti terjedési rutinját. Úgy tűnik, hogy a vírus egyre inkább átvihető az emberek között. Szorosan figyelemmel kell kísérnünk, hogy a vírus tovább fejlődik-e, hogy virulensebbé váljon. A specifikus kezelések hiánya miatt és figyelembe véve a 2019-nCoV és a SARS-CoV rokonságát, a SARS-CoV elleni néhány gyógyszer és preklinikai vakcina valószínűleg felhasználható lenne e vírus kezelésére. Végül, tekintettel a SARSr-CoV természetes rezervoárokban való széles körű elterjedésére, a jövőbeni kutatásoknak e vírusok aktív felügyeletére kell összpontosítaniuk szélesebb földrajzi régiókban. Hosszú távon széles spektrumú vírusellenes gyógyszereket és vakcinákat kell készíteni a jövőben e víruscsoport által okozott újonnan megjelenő fertőző betegségekre. A legfontosabb, hogy szigorú szabályokat kell bevezetni a vadon élő állatok háziasítása és fogyasztása ellen.
Ezzel a megjegyzéssel kiegészítve a bizonyítékban: A cikk elfogadása óta az ICTV a vírust SARS-CoV-215-nek nevezte el; emellett a WHO közzétette az e vírus által okozott betegség hivatalos nevét, amely COVID-1916.