Spektroszkópiai módszerek
Abszorbancia spektroszkópia. Egyes enzimvizsgálatok esetében lehetséges a reaktáns vagy a termék közvetlen mérése az abszorbancia tulajdonságai alapján Fersht (1999). A glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz (EC 1.1.1.1.49) által katalizált reakcióban az egyik termék (NADH) 340 nm-en nyeli el a fényt, így a reakciót az ezen a hullámhosszon bekövetkező abszorbancianövekedés követésével lehet nyomon követni.
Glükóz-6-foszfát + NAD+ → 6-foszfoglükonát + NADH + H+
Más esetekben a reaktáns vagy termék mérése közvetett módon történik. Az acetilkolin-észteráz (EC 3.1.1.7) esetében például az acetiltiokolin szubsztrátként szolgál, amely az enzimmel való érintkezéskor tiokolin szabadul fel. A tiokolin Ellman reagenssel reagálva egy színes terméket hoz létre, így az abszorbancia növekedését követve nyomon követhető a reakció.
Acetiltiokolin + H2O → acetát + H+ + tiokolin
Tiokolin + Ellman reagens → színes származék
Az enzimaktivitás nyomon követésére néha kapcsolt próbákat használnak. Ebben az esetben az érdeklődésre számot tartó enzimatikus reakciót egy második reakcióval párosítják, amelyet a kényelmes mérés érdekében összekapcsolnak. Erre példa a hexokináz (EC 2.7.1.1) vizsgálata. Ebben az esetben a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz és a NAD+ feleslegét adjuk a vizsgálati elegyhez, és a 340 nm-en mért abszorbanciát figyeljük.
Reakció I: Glükóz + ATP → glükóz-6-foszfát + ADP
Reakció II: Glükóz-6-foszfát + NAD+ → 6-foszfoglükonát + NADH + H+
Ebben a példában az I. reakciónak sebességkorlátozónak kell lennie, és a glükóz-6-foszfát koncentrációjának egy késleltetési időszakot követően el kell érnie az állandósult állapotot. Cleland Cleland (1979) megfogalmazott egy eljárást annak biztosítására, hogy a kapcsolt próba pontos mérést adjon az enzim reakciósebességéről. Ha lehetséges, a reakciót lehetőleg folyamatosan monitorozni kell. A fent leírt vizsgálatokkal a spektrofotométer úgy programozható, hogy az idő függvényében folyamatos leolvasást adjon. Az elválasztási technikákban, amelyek magukban foglalhatják a radioaktivitás, az elektroforézis vagy a kromatográfia használatát, diszkontinuus vagy végpontos vizsgálatokat alkalmaznak. Miután a vizsgálathoz lineáris időtartamot állapítottak meg, a paramétert a lineáris időtartamon belül egyetlen időpontban (lehetőleg a lineáris fázis közepéhez közeli időpontban) mérik. A sebességet ezután az adott időpontban és a reakció indításakor mért jelkülönbségből határozzák meg. A végpontos vizsgálatokkal óvatosan kell eljárni, és a linearitás megerősítése érdekében ellenőrizni kell az időfolyamatokat. Az inkubációs körülmények, például a hőmérséklet, a pH vagy a szubsztrátkoncentráció változása megváltoztathatja a vizsgálat linearitását. A rutin enzimvizsgálatoknál a reakcióedény az egyik komponens kivételével az összes komponenst tartalmazza, és a reakciót a hiányzó komponens (az enzim vagy az egyik szubsztrát) hozzáadásával indítjuk el. A többi komponensnek egyensúlyban kell lennie a pH, a hőmérséklet és az ionerősség tekintetében. A reakciót általában a hiányzó komponens koncentrált törzsoldatának kis térfogatú hozzáadásával indítjuk el. A kis térfogat biztosítja, hogy ez a hozzáadás ne zavarja meg a már kialakult egyensúlyi feltételeket. Ha nem lehetséges egy kis komponens hozzáadása, az elválasztott komponenseknek azonos hőmérsékleten, ionerősségen és p H értéken kell lenniük. Bár a két komponensnek teljesen össze kell keverednie, kerülni kell az erőteljes rázást, mivel az denaturálhatja az enzimfehérjét. A keverés történhet egy cső megfordításával, amelyhez egy dugó van rögzítve, vagy egy Parafilm-zárral ellátott küvettával. A hígított fehérjék gyakran kevésbé stabilak, mint a koncentráltabbak, és a vizsgálatokat gyakran inert fehérje, például szarvasmarha-szérumalbumin (0,25 mg/ml) jelenlétében végzik a tisztított enzim stabilizálása érdekében. Kísérleteket kell végezni annak biztosítására, hogy a fehérje inert legyen. Mivel az albumin például hidrofób szubsztrátokhoz kötődhet, nem mindig megfelelő erre a célra. A diszkontinuus vizsgálatokhoz az időzítőt be lehet állítani, és a keverés után meghatározott időközönként lehet mintát szívni. A legtöbb spektrofotométer esetében a detektálás manuálisan, a műszerpanel vagy a számítógép billentyűzete segítségével indítható. Egy komponens küvettába történő hozzáadásához körülbelül 20 másodpercre van szükség ahhoz, hogy a küvettát a spektrofotométerbe helyezzük, és a detektálást egy számítógépes billentyű megnyomásával kezdjük meg. Ennek az időnek általában nincs nagy jelentősége, mivel a legtöbb reakció esetében a vizsgálat 10-30 percig tart. A kontrollmérések egy enzimet nem tartalmazó vakpróbát és egy szubsztrátot nem tartalmazó vakpróbát tartalmaznak. Ezek a kontrollok biztosítják, hogy nem történnek véletlen reakciók. A kontroll (nem enzim vak) sebességet kivonjuk a kísérlet által generált dátumból, hogy megkapjuk az enzimatikus reakció tényleges sebességét. Sok vizsgálatnál szükséges a reakciót egy adott időpontban leállítani vagy leállítani, hogy megakadályozzuk a termék további termelődését. Például 5 perces időközönként lehet mintát venni egy előre meghatározott ideig, és a terméket HPLC-vel mérni.
Minden kromatográfiás elemzés 30 percig is eltarthat. A reakció befejezésének módszerei általában az enzim denaturálását jelentik sav hozzáadásával vagy forró vízfürdőbe merítéssel. Egyes metalloenzimek aktivitása EDTA-val vagy más fémion-kelátorral csillapítható. A legtöbb enzimvizsgálat spektroszkópiai technikákon alapul, amelyek közül a két leggyakrabban használt az abszorpciós és a fluoreszcencia Fersht (1999). A reakciósebesség követésére használt hullámhossznak olyannak kell lennie, amely a legnagyobb abszorpciós különbséget eredményezi a szubsztrát és a termék között. Az abszorpciós méréseket szabványos spektrofotométerrel végzik, a mintákat speciális küvettákban vagy küvettákban tartva. A kereskedelemben kaphatók olyan eldobható műanyag küvetták, amelyekbe 1 vagy 3 ml minta fér. Használatuk a látható hullámhossztartományra (350-800 nm) korlátozódik. A 350 nm-nél kisebb hullámhosszúságú mérésekhez kvarcküvettákat kell használni (az üveg és a műanyag elnyeli a fényt az UV-tartományban). A küvetták úthosszát a gyártó adja meg. A népszerű úthosszok 1,00 cm, 0,40 cm és 0,20 cm. Egyre több vizsgálatot végeznek műanyag vagy kvarc aljú 96 lyukú mikrotiterlemezekkel. Egy adott hullámhosszon fényt elnyelő anyag koncentrációja meghatározható a Beer-törvényből:
A = εcl,
melyben A a minta abszorpciója egy adott hullámhosszon, c a minta koncentrációja, l az úthossz, ε pedig az extinkciós együttható vagy moláris abszorpciós képesség. Az ε mértékegysége M-1 cm-1 vagy mM-1 cm-1. Ha az ε értéke ismert egy adott anyagra vonatkozóan, akkor az adott anyag oldatban lévő koncentrációja kiszámítható az oldatban való elnyelésének mérésével. A Beer-törvény segítségével kiszámítható a koncentráció változásának sebessége egy reakció során. Az abszorpciós mérések lehetséges hibája a Beer-törvénytől való eltérésből adódik, mivel az csak az abszorpciós értékek véges tartományára érvényes. Így, mivel 1-nél nagyobb abszorpciós értékek esetén nem feltétlenül alkalmazható, a vizsgálatokat úgy kell megtervezni, hogy a kísérleti értékek ennél kisebbek legyenek. E problémák némelyikét meg lehet kerülni rövidebb úthosszúságú küvetták használatával. Egy 1,00 cm hosszúságú küvettában 1,00 cm-es abszorbanciájú minta 0,20-as abszorbanciájú lesz egy 0,20 cm hosszúságú küvettában. Általában a 0,5 körüli abszorbanciával való munka kompromisszumot jelent a spektrofotométerben rejlő optikai zaj minimalizálása és az ésszerű mérhető jel között. Az oldatban lévő zavarosság szórhatja a fényt és látszólagos abszorbanciát eredményezhet. Szűrés vagy centrifugálás alkalmazható e részecskék eltávolítására. Bár az úthossz megváltoztatásával elkerülhető a linearitástól való eltérések egy része (azaz amikor az abszorbancia olyan magas, hogy a spektrofotométer nem tud pontos mérést végezni), az eltérések gyakran az abszorbens fajok közötti intermolekuláris kölcsönhatásokból adódnak. Az abszorbens fajok nagyobb koncentrációjánál dimerizáció (vagy magasabb rendű eximerek képződése) következik be. Ezekben az esetekben a Beer-törvénynek engedelmeskedik, ha a termék koncentrációja csökken. Ezt vagy a reakció lassításával (az enzimkoncentráció csökkentésével), vagy rövidebb ideig tartó mérésekkel lehet elérni (mielőtt a Beer-törvénytől való eltérésekkel találkoznánk).