Alai

Ez a blogbejegyzés (a különböző típusú fixálószerekről még lesz szó…) elsősorban a paraformaldehid/formaldehid, közismert nevén PFA használatára összpontosítunk, amely az áramlási citometriában leggyakrabban használt fixálószer. A PFA kifejezetten a formaldehid szilárd, polimer formájára utal (és vizes oldatban monomer formaldehiddé oldódik), így amit általában kanonikusan “PFA fixálásnak” neveznek, az valójában a monomer, formaldehid oldat használata. Ebben az esetben a PFA és a formaldehid szinonimák és felcserélhetők.
A minták áramlási citometriához történő fixálására általában 1-4%-os PFA oldatot használnak. Fertőző minták fertőtlenítése esetén már 0,37%-os koncentráció is hatékonyan fertőtleníti a HIV-fertőzött betegektől származó mintákat1. Az 1%-os PFA-val történő 45-60 perces, illetve a 4%-os PFA-val (pl. BioLegend pufferrel) történő 15-20 perces inkubáció elegendő a sejtek teljes rögzítéséhez, és a sejtek vagy felhasználhatók a későbbi feldolgozáshoz (permeabilizálás az intracelluláris célpontok számára), vagy ebben a szakaszban tárolhatók későbbi elemzés céljából.
A rutin áramlási citometriás festési eljárás során, amely magában foglalja a felületi markerek festését, több lépésben dönthet úgy, hogy fixálja a mintákat – a felületi markerek festése után, vagy előtte fixálja.
A döntés, hogy mikor lehet fixálni, bizonyos esetekben… fix. Például, ha foszfo-célpontokat elemez, bizonyos felületi antigének antitestek általi kötődése röviddel a kontaktus után megváltoztathatja az intracelluláris jelátviteli útvonalakat, így a foszforilációs eredményekben artefaktumot eredményezhet. Ebben az esetben a sejteket a felületi antitestek hozzáadása előtt rögzítenie kell (ezért az intracelluláris foszforilációs célpontok elemzéséhez ajánlott True-Phos™ Perm pufferünk protokollját úgy terveztük, hogy a rögzítési lépés megelőzze a többi eljárást). Mindegyiknek megvannak a maga előnyei és hátrányai, de itt van néhány dolog, amire mindegyik esetben figyelni kell.