A laboratóriumi orvostudomány az elmúlt két évtizedben jelentős fejlődésen ment keresztül. A vírusterhelési próbák a nested PCR-próbáktól az átírással közvetített amplifikáción át a valós idejű PCR-ig fejlődtek, és tovább fejlődnek az olyan módszerekkel, mint a digitális PCR. Ez a fejlődés érzékenyebb, szélesebb dinamikai tartományú vírusterhelési teszteket eredményezett, ami lehetővé teszi az orvosok számára, hogy jobban megértsék a beteg terápiára adott válaszát és a betegség progresszióját.
A molekuláris diagnosztika fejlődésével javuló betegkezelés egyik példája a HIV-1 betegek kezelése. A jelenlegi kezelési irányelvek szerint a kezelés sikerét 75 kópia/ml alatti HIV-1 RNS-koncentrációban határozzák meg.1 A kezelés sikertelenségének meghatározása a globális, nemzeti és országspecifikus irányelvek szerint változik, de általában 50-1000 kópia/ml közötti HIV-1 RNS-koncentrációban határozzák meg.1-3
Ezek a kezelési határértékek a valós idejű PCR-mérések dinamikai tartományának alsó határán vannak, ahol a pontosság és a reprodukálhatóság kihívást jelenthet. A vírusterhelési tesztek teljesítményét befolyásoló tényezők az automatizált platform, a nukleinsav extrakciós kémia, a PCR-primerek/szondák kiválasztása és tervezése, a PCR-amplifikációs feltételek és a teszt kalibrációs stratégiája. Itt áttekintjük a különböző tervezési megközelítéseket és azok lehetséges hatását a vizsgálat teljesítményére és a klinikai eredményekre. (1. ábra)
Extrakciós eljárás
Az extrakciós kémia kiválasztásakor gondosan figyelembe kell venni a minta típusát és az analitot. HIV-1 esetén például az Egészségügyi Minisztérium (Department of Health and Human Services, DHHS) azt tanácsolja, hogy a HIV-1 RNS-t a HIV-1 viremia markereként kell használni.1
A HIV-1 RNS és a provirális DNS közötti különbségtétel azért fontos, mert az utóbbi nem az aktív vírusreplikáció markere, hanem a sejtekbe már beépült vírusból felszabaduló látens rezervoáré. Egy olyan extrakciós vegyszer, amely a HIV-1 RNS-t és a provirális DNS-t is tisztítja, nem adna pontos képet a valódi vírusreplikációról az orvos számára; ezért e vírus esetében csak olyan extrakciós vegyszert szabad használni, amely kifejezetten a HIV-1 RNS-t tisztítja, hogy a provirális DNS-t kizárják a downstream kvantitációból.
Alternatív megoldásként a teljes nukleinsav (TNA) extrakciós kémia használata a HIV-1 kvantitására potenciálisan hamis pozitív eredményekhez vagy pontatlan kvantitációhoz vezethet, ami káros hatással lenne a betegkezelésre. A TNA extrakciós kémia felhasználható nehezebb mintatípusok, például vizelet vagy széklet esetében, vagy olyan vizsgálatokhoz, amelyeknek mindkét RNS/DNS célpontot ki kell mutatniuk.
Célpont kiválasztás
A HIV, HBV és HCV törzsek között tapasztalható rendkívüli vírusdiverzitás rendkívül fontos annak biztosítása érdekében, hogy a molekuláris diagnosztikai (MDx) vizsgálatok a mintában jelen lévő törzs(ek)től függetlenül helyes eredményt adjanak.
Ezeknek az aggályoknak a kezelése érdekében az optimális teszttervezésnek a primer/szonda célpontjának kiválasztásával kell kezdődnie egy genetikailag konzervatív régióban, ahol a vírusdiverzitásnak a legkisebb potenciális hatása van. A genetikailag konzervatív régiók csak különböző vírustörzsek szekvenciáinak összehasonlításával határozhatók meg.
Az igény kielégítéséhez elengedhetetlen egy globális felügyeleti program, amely átfogóan értékeli a HIV, HBV és HCV törzsek forgalomban lévő vírusdiverzitását.4 A felügyeleti programban a földrajzilag különböző régiókban gyűjtött törzsekből generált szekvenciákat használják annak meghatározására, hogy a vírusgenom mely régiói a legkonzerváltabbak és a molekuláris diagnosztikai tesztekkel kimutathatók. Azáltal, hogy a keringő vírusszekvenciákat felhasználják a tesztek tervezéséhez, jelentősen csökken annak kockázata, hogy a törzsek kimaradnak a tesztekből.
Szondatervezés és PCR-ciklikus körülmények
A célrégió kiválasztása mellett a szondatervezés és a PCR-ciklikus körülmények is kritikus fontosságúak a vírusterhelés pontos kvantitásának biztosítása érdekében. A szondatervezésnek toleránsnak kell lennie a természetben előforduló polimorfizmusokkal, és így az adott célrégióban esetlegesen előforduló eltérésekkel szemben. Idővel a szondatechnológia és a PCR-módszertan is fejlődött. A víruskvantitáción túl a PCR-technológián alapuló MDx-alkalmazások szélesebb köre különböző szondatervek alkalmazását teszi szükségessé. A kisebb barázdához kötődő szondákat jellemzően genotipizálásra és egynukleotid-polimorfizmus kimutatására használják.
A TaqMan szondákat gyakran használják olyan vizsgálatokban, ahol a célterületek nagyfokú konzerváltsággal rendelkeznek. A részben kettős szálú szondákat, amelyek jobban tolerálják a nagyfokú genetikai heterogenitást, főként a szonda hossza és a kötési feltételek miatt, olyan területeken használják, ahol nagyfokú a heterogenitás5.
A szondák tervezése mellett gyakran a ciklikus körülmények is a tervezési optimalizálás tárgyát képezik a teljesítménykövetelmény elérése érdekében (pl. tolerancia a lehetséges eltérésekkel szemben.) A fázis-illesztett ciklikálás egy olyan megközelítés, amely alacsonyabb hőmérsékletű ciklusokat tartalmaz a kezdeti szigor csökkentése érdekében, amelyet magas hőmérsékletű ciklusok követnek a specificitás megőrzése érdekében. Ez a megközelítés mérsékli az esetleges primer-eltéréseknek a mintakvantitásra gyakorolt kedvezőtlen hatását. Abban az esetben, ha nehéz elkerülni a ritka polimorfizmusok jelentős hatását, egy második célpont kimutatása is beépíthető a vizsgálat tervezésébe. Ha a szekvencia-diverzitás befolyásolja a vírusgenom egy régiójának kimutatását, egy második régió kimutatása biztosítja a pontos eredmény elérését. Tekintettel a molekuláris próbák összetettségére és a vírusok nagyfokú diverzitására, a molekuláris próbák tervezésekor a globális felügyelet és a célspecifikus szondatervezés átfogó megközelítését kell figyelembe venni. Egyszerűen egy stratégia, például a kettős célpontú stratégia adaptálása hamis biztonságérzetet nyújthat.
Kalibrációs stratégia
A kalibrációs stratégia a molekuláris próbák tervezésének szerves részét képezi, és kritikus fontosságú a széles dinamikai tartományban való reprodukálhatóság biztosításához. A legtöbb, a terápia irányítására szolgáló kvantitatív módszer jelenleg külső kalibrációs görbét használ az analit koncentrációjának meghatározásához.
Ezekben az analit jelét egy betegmintában egy ismert koncentrációjú mintacsoporttal hasonlítják össze, és egy egyszerű lineáris regresszió (y=mx+b) segítségével kiszámítják a vírusterhelést. Ez a megközelítés általában olyan kalibrátorokat használ, amelyeket betegmintaként dolgoznak fel a teljes folyamat során, lehetővé téve mind az extrakciós, mind az amplifikációs reagensek és eszközök kalibrálását.
Alternatívaként olyan kalibrátorokat is lehet használni, amelyeket nem dolgoznak fel az extrakción keresztül, azonban ez a megközelítés magában hordozza annak kockázatát, hogy a visszanyerésbeli különbségeket vagy a reagens összetételének változását nem veszik figyelembe, ami potenciálisan a kvantitációban való eltérésekhez vezethet.
Egy másik, ritkábban alkalmazott stratégia a belső mennyiségi standard. Ez az alkalmazás egy harmadrendű polinomiális regressziós egyenest (y = ax3 + bx2 + cx + d) használ a lineáris tartományban, a linearitástól való megengedett maximális eltéréssel. Korábbi tanulmányok szerint a linearitástól való elfogadható megengedett eltérés egyes vizsgálatok esetében ± 0,2 Log10 volt.6 Ez a linearitástól való megengedett eltérés és a kalibrációs megközelítés magyarázatot ad a módszerek között gyakran megfigyelhető torzításra, valamint a nagyobb pontatlanságra a dinamikai tartomány alsó határán, ahol gyakran klinikai döntések születnek.
Következtetés
A molekuláris vizsgálatok pontos és precíz teljesítménye kritikus fontosságú a megfelelő terápiás kezeléshez. A pontatlan vírusterhelési eredmények nem megfelelő kezeléshez vezethetnek, és a beteg nem megfelelő terápián maradhat. Ez a téves diagnózis sokkal szélesebb körű következményekkel jár, mint egy-egy beteg kezelése, mivel a rezisztens vírustörzs terjedésének növekedéséhez is vezethet. A terápiakezelés szempontjából a rezisztenciával járó mutációkkal rendelkező vírus szűkebb terápiás lehetőségekkel való kezelése nagyobb kihívást jelent. Ezen túlmenően a hamis pozitív arányok szükségtelenül növelhetik az ismételt vizsgálatok vagy a drágább rezisztenciavizsgálatok költségeit, valamint aggodalmat okozhatnak a beteg és az orvos számára.
- Az Egészségügyi Minisztérium által kidolgozott Irányelvek az antiretrovirális szerek használatához HIV-fertőzött felnőttek és serdülők esetében. https://aidsinfo.nih.gov/guidelines). Hozzáférés 2019. szeptember.
- European AIDS Clinical Society (EACS). EACS Guidelines Version 9.1 October 2018.
- National Department of Health, South Africa, April 2015, hozzáférés: 2017. augusztus 2: https://aidsfree.usaid.gov/sites/default/files/tx_south-africa_pmtct_2015.pdf.
- Brennan CA, Bodelle P, Coffey R, et al. HIV global surveillance: foundation for retroviral discovery and assay development. Journal of medical virology. 2006;78 Suppl 1:S24-29.
- Luk KC, Devare SG, Hackett JR, Jr. Részben kettős szálú lineáris DNS-szondák: új tervezés genetikailag polimorf célpontok érzékeny kimutatására. Journal of Virological Methods. 2007;144(1-2):1-11.
- Vermehren J, Colucci G, Gohl P, et al. A Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan hepatitis C-vírus mennyiségi teszt második verziójának kifejlesztése a genotípusok jobb befogadásával. Journal of Clinical Microbiology. 2011;49(9):3309-3315.
Elismerés: A szerző szeretné elismerni és megköszönni Mary Rodgersnek és Shihai Huangnak a cikk felülvizsgálatát.