Alai

A fej-nyaki rák a hetedik leggyakoribb ráktípus az incidencia és a mortalitás alapján, 890.000 új esettel és 450.000 halálesettel világszerte 2018-ban . A kezelés továbbra is kihívást jelent, mivel a jelenlegi terápiák 50% alatti ötéves túlélési arányt eredményeznek a lokálisan előrehaladott betegségben szenvedő betegek esetében . A gyógyszerrezisztencia és a toxicitás korlátozza a kemoterápiás szerek, például a cis- vagy karboplatin, az 5-fluorouracil és a taxánok hatékonyságát. A célzott szerek, mint a cetuximab, a nivolumab vagy a pembrolizumab bevezetése javította az eredményt, de a betegek többségénél nem oldotta meg az elsődleges vagy szerzett terápiarezisztencia problémáját . Csak nagyon kevés biomarkert használnak jelenleg a klinikai gyakorlatban, vagy csak nagyon kevés biomarker validálása haladt a rutinszerű használat felé . A megbízható preklinikai modellek ezért kulcsfontosságúak a HNSCC kezelési rezisztenciájában és progressziójában szerepet játszó molekuláris mechanizmusok jobb megértéséhez, valamint a hatékonyabb terápiás stratégiák kifejlesztéséhez.

A HNSCC tumorokból származó immortalizált sejtvonalak értékes eszközt jelentenek a kezelési rezisztencia funkcionális elemzéséhez. A monolayer sejtkultúrákban végzett gyógyszerszűrés továbbra is az új terápiás szerek azonosításának általános megközelítése. A háromdimenziós (3D) tenyészetek azonban, amelyek jobban reprezentálják a tumorszövet architektúráját és sejtkörnyezetét, jobbak lehetnek a betegek gyógyszerhatékonyságának előrejelzésében. A 3D-s sejtkultúrákat alkalmazó vizsgálatokban ugyanis a sugárzás- és gyógyszerérzékenységben nagy eltéréseket mutattak ki, hasonlóan az in vivo tumoroknál tapasztaltakhoz. Még ha a 3D kultúrák hasznosak is a különböző sejtpopulációk közötti kölcsönhatások tanulmányozására, nem reprodukálják teljes mértékben a HNSCC komplexitását. Így az új terápiák kifejlesztéséhez végső soron a HNSCC klinikailag releváns állatmodelljeire lehet szükség, amelyek pontosan reprezentálják a humán rák kialakulásához és progressziójához kapcsolódó sejtes és molekuláris változásokat. E tekintetben a HNSCC-kutatás területén megjelentek a rákkeltő HNSCC-modellek, a transzgenikus állatok és a transzplantálható xenograft modellek. Ez az áttekintés a HNSCC leggyakrabban használt preklinikai modelljeit ismerteti (vázlatosan ábrázolva az 1. ábrán), és áttekintést ad ezek erősségeiről és korlátairól. Ezen modellek alapján a személyre szabott kezelés kiválasztásának új megközelítéseit is tárgyaljuk.

Ex vivo modellek

Immortalizált HNSCC sejtvonalak

Négy évtizeddel ezelőtt jelentették az első protokollokat HNSCC sejtek ex vivo tenyésztésére . Miután ezekkel a protokollokkal megoldották az olyan korábbi akadályokat, mint a fibroblasztok túlszaporodása és a feeder rétegektől való függés, sikeresen létrehozták a HNSCC sejtvonalakat. A tenyésztési technikákat azóta továbbfejlesztették, és különböző HNSCC-sejtvonalakat hoztak létre, amelyek számos passzázs során stabilan növekednek. Az összes rendelkezésre álló HNSCC-sejtvonal részletes leírása meghaladná ennek az áttekintésnek a kereteit. Ezért szeretnénk az olvasót két korábbi áttekintő cikkre utalni. Mivel az immortalizált HNSCC-sejtvonalak könnyen fenntarthatók és bővíthetők, széles körben használták őket a genetikai változások és a kémiai és genetikai perturbációkra adott biológiai válaszok tanulmányozására, a potenciális molekuláris célpontok azonosítására, valamint új kismolekulás és biológiai terápiák kifejlesztésére . A közelmúltban bizonyítékot szolgáltattak arra, hogy ezek a sejtvonalak az intratumorális heterogenitás és a terápiás nyomás alatt bekövetkező klonális evolúció tanulmányozására is felhasználhatók . Az ilyen modelleken végzett átfogó molekuláris és funkcionális vizsgálatokból származó adatokat olyan könyvtárakban gyűjtötték össze, mint a Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE), amely a humán rákos sokféleség értékes tárháza .

Bár a kétdimenziós (2D) egyrétegű kultúrákban tenyésztett HNSCC sejtvonalak továbbra is fontos modellek a betegség új terápiás megközelítéseinek keresésében, általában nem képesek tükrözni a tumor szövettani jellegét, háromdimenziós (3D) architektúráját és in vivo strukturális és funkcionális különbségeit. Ezek a korlátok jelentősen befolyásolják a HNSCC-re vonatkozó bevált és új kezelési módok hatékonyságát monolayer kultúrákban értékelő in vitro vizsgálatok informatív értékét. A HNSCC-sejtvonalak 2D-s és 3D-s tenyészeteinek érzékenységében valóban jelentős különbségekről számoltak be a sugárkezelés és a gyógyszeres kezelés, pl. ciszplatin, cetuximab és az mTOR-gátló AZD8055 esetében. A 2D és 3D kultúrákban növekvő sejtek összehasonlító molekuláris elemzése lehetséges magyarázatot adott a 3D kultúrákban lévő sejtek alacsonyabb érzékenységére, mint például a DNS-javítással kapcsolatos gének expressziója és aktivációja , valamint az epiteliális-mesenchymális átmenettel és az őssejtképződéssel kapcsolatos gének fokozott expressziós szintje 3D körülmények között.

A genetikai instabilitás és a klonális szelekció előfordulása az in vitro tenyésztés során a rákos sejtvonalak további lehetséges korlátai, és magyarázhatja, hogy a sejtvonalakkal kapcsolatos eredményeket gyakran nehéz reprodukálni. Az általánosan használt MCF7 emlőrák- és A549 tüdőrák-sejtvonalak törzseinek átfogó elemzése valóban kiterjedt genomikai variációt mutatott ki a törzsek között, amely a biológiailag jelentős sejttulajdonságok eltéréseivel hozható összefüggésbe. Fontos, hogy amikor a törzseket 321 rákellenes vegyülettel szemben tesztelték, jelentősen eltérő gyógyszerreakciókat figyeltek meg: a vegyületek legalább 75%-a egyes törzseket erősen gátolt, míg másokban teljesen inaktív volt. Ez a tanulmány egyértelműen hangsúlyozza, hogy a maximálisan reprodukálható rákkutatás támogatása érdekében sürgősen szükség van jobb ex vivo modellekre.

A HNSCC fejlett ex vivo modelljei

Köpf-Maier és munkatársai elsőként hoztak létre egy olyan módszert, amely lehetővé tette, hogy a különböző szövettani entitásokból, köztük a garat laphámsejtes karcinómáiból (SCC) származó humán karcinóma sejtek in vitro “organoid struktúrákká” szerveződjenek át . Kimutatták, hogy ezek az organoid kultúrák viszonylag egyszerű kísérleti körülmények között megtartották az in vivo állapot kritikus tulajdonságait, mint például a 3D architektúrát, az egyedi karcinómából származó heterogén sejttípusok növekedését és a morfológiai differenciálódást . Egy későbbi tanulmányban ugyanez a csoport kimutatta, hogy ezek az organoid kultúrák felhasználhatók gyógyszerkísérletekhez, és hogy az ezekből nyert válaszadatok megegyeztek a betegek terápiára adott válaszával . A szerzők voltak az elsők, akik az organoid kultúrákat személyre szabott in vitro gyógyszertesztelési platformként javasolták, lehetővé téve a karcinómák egyéni kemoszenzitivitásának néhány napon belüli előrejelzését .

Azóta finomították a szövetek in vitro in 3D organotípusos struktúrákként történő in vitro tenyésztésének technikáit. Olyan protokollokat fejlesztettek ki organoidok létrehozására felnőtt és embrionális őssejtekből, amelyek képesek önszerveződni a származási szövetet tükröző 3D struktúrákba (áttekintésért lásd Clevers, 2016 ). Az első felnőtt őssejtekből származó organoid kultúrákat egér bélrendszeri őssejtekből hozták létre, amelyeket a bélrendszeri őssejt niche-t utánzó körülmények közé helyeztek . Az R-spondin-1, az epidermális növekedési faktor (EGF) és a Noggin táptalajhoz való hozzáadásával indukált feltételes átprogramozás, valamint a sejtek extracelluláris mátrixot biztosító bazális membránkivonatba ágyazása bizonyítottan serkenti a felnőtt őssejteket az önmegújulásra, a proliferációra és a bélhámra hasonlító differenciált utódok kialakítására . Ezt a technikát, amelyet eredetileg az emberi gyomor-bél traktusból származó fertőzött, gyulladásos és daganatos szövetek tanulmányozására fejlesztettek ki, nemcsak különböző emberi normál szövetekből, hanem betegektől származó tumorszövetekből származó organoid kultúrák létrehozására is alkalmazták. Ezek a vizsgálatok jelentősen bővítették és javították a rendelkezésre álló rákmodellek körét.

A közelmúltban Köpf-Maier és munkatársai korai megállapításait, miszerint a HNSCC organoid kultúrák alkalmas in vitro gyógyszer-tesztelési platformnak bizonyultak, több független vizsgálat is megerősítette. Bár jelentős különbségekről számoltak be a HNSCC betegekből származó primer, hosszú távon növekvő organoid kultúrák létrehozásának sikerességi arányában (30% versus 65% ), az összes eddigi tanulmány egyöntetűen leírta, hogy az organoidok megtartják az eredeti tumor számos tulajdonságát, beleértve az intratumorális heterogenitást , a mutációs profilt és a fehérje expressziós mintákat. Ezenkívül kimutatták, hogy az organoidok xenotranszplantáció során megtartották tumorigén potenciáljukat . Az in vivo gyógyszeres kezelésre adott válaszok hasonlónak bizonyultak az organoidokból in vitro gyógyszerérzékenységi vizsgálatokkal kiszámított IC50-hez Továbbá az organoidok vizsgálatából származó sugárérzékenységi adatok korreláltak a betegek klinikai válaszával . Fontos, hogy organoid modellekben nemcsak a kezeléssel kapcsolatos hatások tanulmányozhatók a tumorokban, hanem a nem kívánt terápiás mellékhatások a normál szövetekben is. Például a betegekből származó nyálmirigyorganoidokat használták a hyposaliváció – a sugárkezelés gyakori súlyos mellékhatása – molekuláris alapjainak feltárására .

Egy további tanulmány a HNSCC betegek daganataiból származó primer 2D sejtkultúrákat további értékes ex vivo HNSCC modellként azonosította . Itt a rákellenes terápiák individualizált nagyszabású szűrése reprodukálhatóan azonosította a daganatellenes aktivitást mutató gyógyszereket a megfelelő betegből származó xenograft (PDX) modellekben, ezáltal további bizonyítékot szolgáltatva arra, hogy az elsődleges HNSCC kultúrák felhasználhatók a terápiás döntéshozatal támogatására rutin klinikai környezetben .

A humán normál, diszpláziás és malignus nyelvszövetek organoid kultúráit is használták a nyelvi tumorigenezis főbb lépéseinek reprodukálására . A nyelvből származó primer keratinociták és fibroblasztok kollagénmátrixban lévő 3D ko-kultúrákban végzett hisztomorfometriás, immunhisztokémiai és elektronmikroszkópos elemzések azt mutatták, hogy a rétegzett növekedés, a sejtproliferáció és a differenciálódás összehasonlítható volt a ko-kultúrák és a megfelelő natív szövetek között, azonban nagymértékben eltértek a fibroblasztok nélkül nevelt kultúrákban . Ezek az eredmények alátámasztják a korábbi tanulmányokat, amelyek a rákhoz kapcsolódó fibroblasztok fontos szerepét mutatják a HNSCC patogenezisében . Ezek az adatok, valamint a tumoros mikrokörnyezet (TME) tumorfokozó hatásaira vonatkozó széles körű irodalmi bizonyítékok erősen amellett szólnak, hogy a jövőben fejlettebb preklinikai modelleket kell alkalmazni, amelyek az összes fő TME-komponenst tartalmazzák. Napjainkban új protokollok állnak rendelkezésre az organoidok előállítására, amelyek a stromasejtek mellett a beteg immunsejtjeit is tartalmazzák. Így, bár az organoidkultúráknak vannak korlátai, mint például a jelentős idő- és erőforrás-felhasználás, valamint a kísérletek eredményét befolyásoló, nem meghatározott külső tényezők beépítése (1. táblázat), ezek a kultúrák megfelelő modelleket jelenthetnek a jövőbeli kezelési stratégiák, köztük az immunonkológiai gyógyszerek kifejlesztésére és optimalizálására.

Állati modellek

A szájüregi rák karcinogénnel indukált állati modelljei

A legtöbb humán SCC-t köztudottan karcinogénekkel való krónikus expozíció indukálja. Kezdetben a szájüregi rosszindulatú daganatok kémiai úton történő előidézésének kísérleti megközelítései mindig kudarcot vallottak, mivel a szájnyálkahártya ellenállóbb volt a vegyi anyagok hatásával szemben, mint a bőr. Végül a 9, 10 dimetil-1, 2, benzantracén (DMBA) alkalmazásával sikeresen lehetett HNSCC-t előidézni a hörcsög arczacskóban, mint állatmodellben. A betegek forgatókönyvéhez hasonlóan a nyálkahártya karcinogenezise négy egymást követő szakaszban zajlott: hiperplázia, atípusos hiperplázia, carcinoma in situ és laphámrák . Nehéz volt azonban különbséget tenni a karcinogénnel való közvetlen érintkezés okozta hámelváltozások és a valódi premalignus transzformáció között, mivel a DMBA által kiváltott arctumorokban a változások átmeneti és reverzibilisek voltak. Ezenkívül a DMBA-indukált tumorok nem rendelkeztek a differenciált HNSCC számos szövettani jellemzőjével, és nem hasonlítottak szorosan a korai humán elváltozásokra. Ami még fontosabb, hogy a tumor a hörcsög arczacskójában keletkezett, amely egy olyan immunhiányos területet képvisel, amely az emberben hiányzik, így ez a modell nem nagyon jól utánozta a humán HNSCC-t. Bár a DMBA-t később széles körben alkalmazták hörcsög és patkány szájüregi rákmodellekben, egerekben nehéznek bizonyult DMBA-val szájüregi karcinómát előidézni. A 4-nitrokinolin-1-oxid (4-NQO), egy vízben oldódó kinolon-származék, ezután került bevezetésre, mint a szájüregi daganatok erős indukálója. A 4-NQO ivóvízzel történő adagolása vagy helyi alkalmazása többszörös diszpláziás, preneoplasztikus és neoplasztikus elváltozásokat eredményezett hosszú távú kezelés után mind patkány-, mind egérmodellekben, és ezek az elváltozások nagyon hasonlítottak az emberi szájüreg neoplasztikus átalakulásához. Több módosítás után a modellt Tang és munkatársai standardizálták, akik kimutatták, hogy a 4-NQO 16 héten keresztül történő adagolása C57BL/6 egerek ivóvizébe nagy gyakorisággal elősegíti a szájüreg karcinogenezisét.

A fent leírt rákkeltő állatmodellek a humán karcinogenezis során megfigyelhető események sorrendjének és az elváltozások típusának reprodukálásával kiváló in vivo rendszert biztosítanak a szájüregi karcinogenezis kulcsfontosságú vezető eseményeinek tanulmányozására. Ezeket a modelleket széles körben használták a rák kemoprevenciós stratégiáinak kifejlesztésére is, míg kevesebb tanulmány használta ki ezeket az állatmodelleket a már kialakult daganatok kezelésére szolgáló gyógyszerek hatékonyságának értékelésére. A gyógyszerek szűrési platformjaként az egyik fő korlátot a vizsgálati vegyület hatásainak értékeléséhez szükséges hosszabb idő jelenti (1. táblázat). A HNSCC legtöbb karcinogénnel indukált állatmodelljében 40 hétre van szükség a teljes értékű karcinóma kialakulásához, és még hosszabb időre, ha a vizsgálat végpontja az áttétképződés. Ebben az összefüggésben Wang és munkatársai közelmúltbeli jelentése egy lehetséges rövidítést kínál a 4NQO-eredetű sejtvonalból indukált nyelvi tumor xenograftok mint alternatív, célszerűbb szinogén egérmodell használatával .

A 4NQO-indukált állatmodell fő előnye, hogy alkalmas a karcinogén és genetikai tényezők tumorgenezisre gyakorolt hatásainak tanulmányozására, különösen immunkompetens környezetben. Így megfelelő platformot biztosít a HNSCC-ben alkalmazott immunterápiás kezelések fejlesztésének felgyorsítására . A modellt sikeresen használták a feltételezett rákos őssejteknek a kezeléssel szembeni rezisztenciában, a kiújulásban és az áttétképződésben játszott szerepének vizsgálatára is. Megállapították, hogy ez a modell alkalmas olyan új terápiás stratégiák kifejlesztésére, amelyek nemcsak a proliferatív tumor nagy részét, hanem a rákos őssejtek viszonylag nyugodt alpopulációját is célba veszik .

Géntechnológiával módosított egérmodellek

Míg a vegyi anyagok által okozott DNS-károsodás véletlenszerűen történik, a tumorevolúció elmélete szerint a mutációk véletlenszerű megszerzését a genomban a sejtek túlélését és proliferációját elősegítő genetikai változásokat hordozó klónok kiválasztása követi. A molekuláris profilalkotó vizsgálatok számos olyan feltételezett vezető gént azonosítottak, amelyek hozzájárulnak a HNSCC-ben a rák kialakulásához. Ezek a molekuláris vizsgálatok azonban nem szolgáltattak közvetlen bizonyítékot az ok-okozati összefüggésre vagy részletes betekintést azokba a biológiai mechanizmusokba, amelyek révén ezek a gének a tumor kialakulását irányítják. Bár a karcinogénnel indukált állatmodellek jól reprodukálják a humán primer tumorok genomiális változásainak heterogén tájképét , ezeknek a mutációknak csak egy töredéke hajtja a tumorgenezist az onkogének vagy tumorszuppresszor gének befolyásolásával, de sok mutáció utas, és nem járul hozzá egyértelműen a tumor kialakulásához. Ezek a vizsgálatok azt sem tárják fel, hogy a mozgatórugók nélkülözhetetlenek-e a tumor fenntartásához, és ezért csak korlátozottan alkalmasak hatékony terápiás stratégiák megtervezésére. Ezzel szemben a preklinikai modellrendszerek, mint például a genetikailag módosított egérmodellek (GEMM-ek) olyan kísérletileg követhető megközelítést nyújtanak, amelyben a specifikus mutációk biológiai hatásai részletesen tanulmányozhatók ellenőrzött genetikai háttérben. A következő fejezetekben a HNSCC-ben GEMM-eken alapuló korábbi tanulmányok legfontosabb eredményeit ismertetjük.

A krónikus karcinogén expozíció hiányában spontán HNSCC kialakulásával összefüggő kevés GEMM-et írtak le eddig (2. táblázat). A szájüregi rák genetikailag módosított egérmodelljét először Schreiber és munkatársai mutatták be . A v-Ha-ras génre transzgenikus egerek és a humán papillómavírus (HPV)-16 E6/E7-t hordozó transzgenikus egerek keresztezése után a szájban, a fülben és a szemben tumorok kialakulását figyelték meg körülbelül 3 hónapos korban kezdődően . Hat hónapos korukra a bi-transzgénes állatok 100%-ánál alakultak ki szájüregi daganatok, míg a két egytranszgénes csoport bármelyikében 0% volt a gyakoriság. A tumorigenezishez szükséges második genetikai találat előfeltételéről a K-rasG12D transzgenikus modell esetében is beszámoltak, amelyben egy tamoxifen-indukálható Cre rekombinázt használtak a keratin-14 (K14) promóter kontrollja alatt az endogén K-ras lókusz megcélzására . Az egytranszgénes modellben 1 hónapos tamoxifen-kezelés után csak nagy papillómákat figyeltek meg a szájüregben és hiperpláziákat a nyelvben . Ha azonban az egereket floxed p53 feltételes knockout egerekkel keresztezték, az összetett egerek 100%-ánál már 2 héttel a tamoxifen indukció után nyelvi karcinómák alakultak ki . A vírusos onkogének E6/E7 expressziója és a TP53 elvesztése mellett a krüppel-like-faktor 4 (KLF4) transzkripciós faktor homozigóta delécióját és a SMAD4 heterozigóta delécióját azonosították második genetikai találatként, amelyek egy onkogén driver mutációval együtt nagy gyakorisággal elősegítik a szájüregi tumorok kialakulását (2. táblázat).

A HNSCC progressziójának reprodukálása ellenére a fent leírt HNSCC-modellek alkalmassága új molekuláris célzott kezelési megközelítések feltárásának platformjaként valahol kérdéses marad, tekintve, hogy a tumorigenezist ezekben az állatokban irányító genetikai elváltozások hiányoznak vagy csak ritkán fordulnak elő HNSCC-betegekben. Összességében a HRAS és a KRAS mutációit a HNSCC betegek mindössze 6, illetve 0,2%-ában, a KLF4 és a SMAD4 homozigóta delécióját pedig az esetek 0, illetve 4%-ában mutatták ki. Ezenkívül a The Cancer Genome Atlas (TCGA) HNSCC kohorszában nem azonosítottak olyan eseteket, amelyek a fent leírt GEMM-ek összetett tumorra hajlamos genotípusainak egyikét hordozták . A spontán HNSCC GEMM-je, amely jobban hasonlít a humán betegség molekuláris jellemzőire, a SMAD4 egyetlen gén-knockout modellje lehet a fej-nyaki epithéliumban (HN-Smad4del/del), amelyről Bornstein és munkatársai számoltak be . Valóban, bár a homozigóta deléció ritka, a SMAD4 heterozigóta elvesztése a primer HNSCC-k 30-35%-ában kimutatható, ami a Smad4 expressziós szintjének downregulációjával jár együtt . A közelmúltban jelentős intratumorális heterogenitásról számoltak be az SMAD4 elvesztése tekintetében a primer HNSCC tumorokban . Érdekes módon a PDX-ből származó ex vivo kultúrákban a heterozigóta SMAD4-veszteséget delécióval vagy csökkentett expresszióval megjelenítő sejtszubpopuláció a szülői tumorból származó vad típusú SMAD4 genotípusú sejteket felülmúlta, ami a Smad4-hiányos sejtek túlélési előnyére utal . Az egy-knockout GEMM alkalmasságának további alátámasztására a HN-Smad4del/del egerekből származó HNSCC fokozott genomi instabilitást mutatott, ami korrelált a Fanconi-anémia / BRCA DNS-javító útvonal fehérjéit kódoló gének szabályozott expressziójával és funkciójával, ami szintén a HNSCC-érzékenységhez kapcsolódik az emberekben . Ezenkívül mind a normál fej- és nyaki szövetek, mind a HN-Smad4del/del egerekből származó HNSCC súlyos gyulladást mutatott, amelyet emberekben is összefüggésbe hoztak a patogenezissel, ahol a szájüregi baktériumok és a parodontális betegséghez társuló gyulladásos mediátorok társfaktort jelenthetnek a szájüregi SCC kialakulásában és elősegítésében.

A 2009-es eredeti jelentés óta a HN-Smad4del/del modellt a HNSCC tumorigenezisében részt vevő molekuláris folyamatok részletes elemzésére használják. Tudomásunk szerint eddig még nem használták ki új terápiás stratégiák kidolgozására. Ez a korlátozás talán azzal magyarázható, hogy ebben a modellben a tumor kialakulásának medián ideje 40 hét, ami a szájüregi rák karcinogénnel indukált állatmodelljeihez hasonló korlát (2. táblázat). A karcinogén kezelés integrálása a tumorképződés felgyorsítása érdekében az egy transzgénnel rendelkező GEMM-ekben így megfelelő módot jelenthet e korlátozás feloldására, amint azt már sikeresen demonstrálták egy tumorszupresszor gén (GRHL3 , PTEN ) delécióját hordozó vagy onkogén mikroRNS-eket túlexpresszáló GEMM-ekkel végzett vizsgálatokban (1. táblázat).

Betegből származó xenograft modellek

A súlyosan immunhiányos egértörzsek kifejlesztése és fejlesztése jelentősen megnövelte a PDX modellek elérhetőségét a rákkutatásban. A HNSCC PDX modellek sikeres létrehozásáról több kutatócsoport is beszámolt. Saját sorozatunkban 48%-os általános beültetési arányt figyeltünk meg , azonban úgy tűnt, hogy a beültetési arányok nagymértékben eltérnek a különböző beteg alcsoportok között. Az átültetést korlátozó tényezőket még nem sikerült egyértelműen azonosítani. Úgy tűnik, hogy a beültetés helye és az egértörzsek befolyásolják az átültetési arányt. Ezenkívül az olyan patológiai kockázati tényezők, mint a tumor szövettana és a HPV-státusz fontos meghatározói a PDX-képződésnek. Általánosságban elmondható, hogy a differenciálatlan, agresszív növekedést mutató HPV-negatív tumorok nagyobb valószínűséggel transzplantálódnak. Ennek megfelelően a PDX-graftmentáció sebessége és kinetikája összefüggésbe hozható a betegek kedvezőtlen prognózisával . A HPV-negatív tumorokkal ellentétben a HPV-asszociált HNSCC-tumorok gyakran nem tudnak átültetni. Mivel ezek a daganatok immunasszociált helyeken, például a mandulán vagy a nyelvalapon nőnek, a vírusfertőzött sejtek immunológiai kontrollját nélkülöző immunhiányos egerekbe történő transzplantációjuk az Epstein-Barr-vírus (EBV) pozitív B-sejtek együttes átvitelének kockázatát hordozza. Ennek eredményeként gyakran előfordul a B-sejtek ellenőrizetlen proliferációja és EBV+ limfómává alakulása. Mivel ezeknek a mesterséges limfómáknak a proliferációs rátája sokkal magasabb, mint a tumorsejtek proliferációja az SCC transzplantált szövetdarabjaiban, az eredeti tumortranszplantátumok gyakran túlnőnek . Ezért a PDX szövettani validálása egy szakvizsgázott patológus által elengedhetetlen a modell laphámsejtes karcinóma szövettanának megerősítéséhez.

Azzal a kérdéssel, hogy a PDX mennyire hasonlít az elsődleges beteg tumorhoz, számos csoport foglalkozott. Amint azt más daganatos entitások esetében kimutatták, az egerekben létrehozott HNSCC modellek az eredeti beteg tumorhoz hasonló szövettani jellemzőket mutatnak . A primer tumorok és a származtatott PDX modellek újgenerációs szekvenálással végzett átfogó genetikai elemzése a molekuláris aberrációk hasonló mintázatát és allélfrekvenciáját mutatta ki . Az eredeti tumorok és a származtatott modellek mutációs profiljai közötti korreláció szignifikánsan magasabb volt a PDX (R = 0,94), mint a sejtvonalak (R = 0,51) esetében . A metilómaelemzés szintén nagyfokú egyezést mutatott a PDX és a beteg tumorok között. Valóban, a vizsgált CpG-helyeknek átlagosan csak 2,7%-a ment át jelentős metilációs változásokon a tumorok egerekbe történő átültetése következtében . Továbbá, a génexpressziós vizsgálatok kimutatták a szülői tumorok és a PDX-ek általános rokonságát, amit a nem felügyelt hierarchikus klaszterelemzésben történő klaszterezésük is megerősített . A PDX és az elsődleges HNSCC-k közötti genom- és transzkriptomprofilok egyezésének növekvő bizonyítékával ellentétben a fehérjeexpresszióra vonatkozóan csak kevés adat áll rendelkezésre. A PDX-szövet első előzetes elemzése fordított fázisú fehérjetömb (RPPA) segítségével a TCGA HNSCC fehérjeexpressziós adataihoz hasonló fehérjeprofilokat mutatott ki , ami arra utal, hogy ezen a szinten is hasonlóság van az eredeti szövet és a származtatott modell között.

A PDX egyik legfontosabb jellemzője a stromális kompartment megőrzése. Annak ellenére, hogy a humán stróma az első passzázsokon belül egérstróma helyébe egérstróma lép, egy integrált stróma megmarad, ami lehetővé teszi az ezt a kompartmentet célzó vegyületek vagy a strómakompartment és a tumorsejtek közötti crosstalk értékelését. Továbbá az egerekben tenyésztett tumorok saját tumoros érhálózatot építenek ki, ami lehetőséget nyújt az angiogén hálózat értékelésére és az angiogenezist célzó vegyületekkel való beavatkozásra. A modell létrehozását követően az egerekben növesztett tumorokat le lehet szedni, életveszélyesen le lehet fagyasztani, majd szükség esetén fel lehet olvasztani, és újra be lehet ültetni egerekbe. Összességében a PDX megfelelő módszernek tekinthető a tumorszövet terjeszkedéséhez, és ígéretes preklinikai modellrendszer mechanisztikus vizsgálatokhoz és terápiás stratégiák fejlesztéséhez.

Az immunterápia közelmúltbeli megjelenésével számos ráktípus, köztük a HNSCC kezelési algoritmusában, a PDX-ben a funkcionális immunkörnyezet hiánya a leküzdendő fő akadály lett. Különböző stratégiákat javasoltak az immunrendszer megvalósítására immunhiányos egerekben. Mosier és munkatársai mérföldkőnek számító tanulmányában kimutatták, hogy humán perifériás mononukleáris sejtek (PBMC-k) befecskendezésével hosszú távon stabilan helyreállítható a funkcionális humán immunrendszer súlyos kombinált immunhiányos (SCID) egerekben. Így immunhiányos PDX-modelleket lehetett létrehozni a beteg PBMC sejtjeinek a PDX-et hordozó egerekbe történő bejuttatásával. Azonban a megfelelő immunsejtfejlődés és a T-sejt-alapozás hiányzik ennél a megközelítésnél, ami a humán immunsejtek bizonyos vonalainak hiányát eredményezi az egerekben . A később kifejlesztett kifinomultabb immunrekonstitúciós protokollok a humán CD34+ őssejtek NSG egerekbe történő átültetésén, valamint humán magzati tímusz és májszövet beültetésén alapulnak ezen egerek vesekapszulája alá . Ez a megközelítés egy teljes emberi immunrendszer hosszú távú beültetését és szisztémás rekonstitúcióját eredményezte, beleértve a T-, B-, NK-, dendritikus sejtekből és makrofágokból álló multilineáris emberi immunsejteket . Sajnos ez a módszer a modell összetettsége miatt nem kivitelezhető nagyszámú PDX esetében. Melanomában egy ígéretesebb eljárást javasoltak, ahol a PDX előállításához használt tumorszövetből izolált tumor-infiltráló T-limfocitákat (TIL) in vitro humán interleukin 2 (IL2) segítségével bővítették, mielőtt tumort hordozó PDX egerekbe injektálták .

A PDX modellek potenciálja a betegkezelés irányítására

A PDX értékét az egyéni betegkezelési döntés irányítására még tisztázni kell. Általánosságban elmondható, hogy a különböző daganatos entitásokban a betegek és a PDX modellek közötti korrelációkat, amelyek az egerek és a betegek közötti kezelési válaszokat hasonlítják össze, a klinikai kimenetelre vonatkozó retrospektív adatok felhasználásával végezték. Tudomásunk szerint a HNSCC-ben nem végeztek ilyen összehasonlításokat kellően nagy mintanagysággal. Az ilyen megközelítések értékének akadályai közé tartozik az egerekben alkalmazott gyógyszeradagolás, amely általában a maximálisan tolerálható dózist tükrözi, a dózis különböző egértörzseken belüli változékonysága és különösen a klinikailag értelmezhető végpont meghatározása. A klinikai környezetben a tumorválaszt a RECIST segítségével határozzák meg. Egerekben a lehetséges végpontok igen heterogén csoportját használták az egyszeri gyógyszeres kezelések hatékonyságának meghatározására, beleértve a relatív növekedésgátlásként kifejezett tumorregressziót, a kontrollcsoporthoz viszonyított tumortérfogatot, a tumor növekedésének gátlását és a végpontig eltelt időt. A modell további általános korlátai a PDX létrehozásának magas költségei, az eltérő beültetési arányok és az első transzplantációtól a kezelés szűrési eredményéig eltelt idő. Eddig a közel 80 HNSCC PDX modellből álló nagy gyűjteményünkben nem tudtuk megállapítani a xenograft modellben a gyógyszer-specifikus tumorválasz prediktív értékét. Ennek ellenére több cég a PDX-et a kezelési válasz előrejelzésének eszközeként hirdeti. A Champions Oncology 2016-ban megvalósíthatósági vizsgálatot indított (NCT02752932) a PDX prediktív értékének feltárására. Sajnos eddig nem publikáltak eredményeket.

A PDX fő hátránya, hogy a modell létrehozásához és bővítéséhez az organoidokhoz képest hosszabb időre van szükség, ami a klinikai rutinban való jövőbeni egyedi gyógyszerszűrési platformként való felhasználásukat kevésbé valószínűvé teszi. Ezenkívül a betegből származó TME-komponensekkel való rekonstitúciót, amelyek a jelenlegi protokollok által létrehozott mindkét modellből hiányoznak, sokkal könnyebben kell elérni az organoidokban, mint a xenograftos egérmodellekben. Ez lehetővé teszi a TME-t érintő rákellenes terápiák (pl. everolimus, bevacizumab, anti-PD-1/PD-1 L antitestek) bevonását a jövőbeli ex vivo szűrési megközelítésekbe.