RTT fibroblasztok hibás autofágia aktivációt mutatnak éhezési körülmények között
Az RTT betegek autofágia-hibájára vonatkozó hipotézis ellenőrzése érdekében, elemeztük az autofágia aktiválódását éhezési körülmények között RTT-betegekből (n = 4) és egészséges személyekből (n = 4) izolált bőr primer fibroblasztokban17,19.
Először az éheztető közegben tenyésztett egészséges és RTT fibroblasztok időbeli életképességét határoztuk meg MTT és Trypan-kék kizárási tesztekkel. A standard tápfolyadékban tenyésztett RTT fibroblasztok életképességéhez képest az RTT fibroblasztok életképessége 4 óra éhezés után csökkent (20 ± 3,3% elhaló sejt, p < 0,05); ez az arány 6-8 óra éhezés után jelentősen nőtt (60 ± 5,1% elhaló sejt, p < 0,05) (1a. ábra). Ezzel szemben az egészséges fibroblasztok 4 órás éhezés után még teljesen életképesek voltak, és csak nagyon kis mértékben csökkent az életképességük 6-8 óra elteltével (10 ± 1,2% haldokló sejt, p < 0,01) a standard táptalajon nevelt fibroblasztok életképességéhez képest (1a. ábra). Így a két sejtvonal életképességének az egyes időpontokban történő közvetlen összehasonlításából kiderült, hogy az RTT fibroblasztok életképessége 4 h-tól kezdődően súlyosan károsodott (lásd a részleteket az ábra legendájában, p < 0,05). Továbbá a Western blotting (WB) elemzés kiemelte, hogy a 4 órán át éheztetett RTT fibroblasztokban a poli (ADP-ribóz)polimeráz-1 (PARP) p25 fragmentumának megfelelő sáv jelentősen megnövekedett (96 ± 4%, p < 0,001) a 0. időpontban történt gyenge kimutatáshoz képest. Ez a fragmentum a fehérje kaszpáz-függő lebomlása során szabadul fel az apoptózis indukciójának korai fázisában (1b. ábra)35 . A p25 fragmentum az egészséges fibroblasztokban ugyanezen kísérleti körülmények között szinte kimutathatatlan volt.
Az RTT fibroblasztok életképességének csökkenése éheztető közegben. (a) Az RTT és az egészséges fibroblasztok időfüggő életképessége 24 órán keresztül éheztető közegben tenyésztve. Az eredmények az élő sejtek százalékos arányában vannak feltüntetve a vizsgálat 0. időpontjában lévő sejtek számához viszonyítva. A bemutatott eredmények öt független, három példányban elvégzett kísérlet átlaga ± S.E.. *szignifikánsan különbözik az egészséges sejtektől a 0. időpontban; **szignifikánsan különbözik az RTT sejtektől a 0. időpontban és az egészséges sejtek életképességétől a megfelelő időpontban (*p < 0,01, **p < 0,05, oneway ANOVA, majd Tukey-teszt, n = 15). (b) A PARP (poli (ADP-ribóz) polimeráz (PARP), egy olyan fehérjecsalád, amely számos, főként a DNS-javítást és a programozott sejthalált érintő sejtfolyamatban vesz részt) p25 fragmentumának Western blotting analízise RTT és egészséges fibroblasztokban, amelyeket 2 és 4 órán keresztül éheztető körülmények között neveltünk. Belső kontrollként béta-tubulint használtunk. Három független kísérlet reprezentatív immunoblotját közöljük. A bemutatott eredmények három független, három példányban elvégzett kísérlet átlaga ± S.E.. *Szignifikánsan különbözik a kontrolltól (akár egészséges, akár RTT sejtek a 0. időpontban) (*p < 0,001, egyirányú ANOVA, majd Tukey-teszt, n = 9).
Az adatok megerősítették, hogy az RTT fibroblasztok nem tolerálják a növekedést éhező közegben, és gyorsan apoptózison mennek keresztül. Ezért tovább vizsgáltuk az autofágikus fluxust az LC3B-II marker clearance monitorozásával egy lizoszóma-inhibitor, például klorokvin (CQ)24,25,26,27,28,29,30 jelenlétében és hiányában.
A CQ-val összefüggő citotoxikus hatás kizárása után (S1. kiegészítő ábra) egészséges és RTT fibroblasztokat nyugalmi vagy éheztető közegben tenyésztettünk 2 órán át 20 µM CQ jelenlétében vagy hiányában, hogy WB-vel számszerűsítsük az LC3B-II/GAPDH arányt (2a. ábra). Az LC3B-II/GAPDH arány (vagy bármely más, az autofágia által nem modulált belső kontroll) mintázatát az autofágia aktiválásának körülményei között, valamint CQ (vagy bármely más lizoszóma-inhibitor) jelenlétében és hiányában érvényes stratégiának tekintjük az autofágia-áramlás monitorozására.
Defektív autofágia-aktiváció RTT fibroblasztokban. (a) RTT és egészséges fibroblasztok WB-analízise, amelyeket DMEM vagy éheztető közegben (2 h) 20 µM CQ jelenlétében vagy hiányában tenyésztettek (felső panel). A szűrőket anti-LC3B vagy anti-GAPDH antitesttel szondáztuk. A rendelkezésre álló sejtvonalakon (n = 4 mind az egészséges, mind az RTT fibroblasztok esetében) végzett három független kísérlet reprezentatív immunoblotját közöljük. Az LC3B-GAPDH-tartalom denzitometriai meghatározását ImageJ szoftverrel végeztük (alsó panel). Az eredmények három független kísérlet átlaga ± S.E.. Az azonos csoporton belüli különböző kísérleti körülmények közötti különbségek szignifikánsan különböznek (*p < 0,05; **p < 0,001, egyirányú ANOVA, majd Tukey-teszt, n = 32). (b) Egészséges és RTT fibroblasztokat (mindkét esetben n = 4), amelyeket 2 és 4 órán keresztül CQ hiányában éheztető táptalajban tenyésztettünk, WB-vel vizsgáltuk a p62/SQSTM1 és PSMA-3 tartalomra (felső panel). A sávok átlagos intenzitását a β-tubulin (a p62 esetében) és a GAPDH (a PSMA-3 esetében) intenzitásához normalizáltuk ImageJ szoftverrel (alsó panel). A bemutatott kép négy független kísérlet reprezentatívja. Bár az RTT fibroblasztok életképessége 4 órás éhezéskor már veszélyeztetett volt (lásd az 1. ábrát), erre az időpontra azért volt szükség, hogy nyomon követhessük a p62 degradációját, amely általában késleltetve történik32. Az eredmények négy független, három példányban elvégzett kísérlet átlaga ± S.E.. *,**,*Szignifikánsan különbözik az adott (lásd a sávokat) kísérleti körülménytől (*,* p < 0,05; **p < 0,001 egyirányú ANOVA; majd Tukey-teszt, n = 24). (c) Az autofágia aktiválásának immunfluoreszcens mikroszkópos elemzése egészséges (felső panel) és RTT fibroblasztok (alsó panel) által (n = 4 mindkét esetben). A nyugalmi (balra), éheztetett (középen) és éheztetett + 20 µM CQ (jobbra) sejteket anti-LC3B antitesttel festettük. Mivel nyugalmi körülmények között az autofágoszómák kimutatása alacsony volt, az éheztetett állapotban az autofágia indukciójára pozitív sejteket a legalább 10 pöttyöt mutató sejtek százalékában számszerűsítettük. Az eredmények három független kísérlet átlaga ± S.E.. **Szignifikánsan különbözik a specifikus (lásd a sávokat) kísérleti körülménytől (*p < 0,001; **p < 0,005, Unpaired τ Student-teszt, n = 24).
A standard táptalajban tenyésztett egészséges fibroblasztokban az LC3B-I egyértelműen immun-érzékelhető volt, míg az LC3B-II halványan. A CQ hiányában és jelenlétében standard közegben tenyésztett egészséges fibroblasztok LC3BII/GAPDH aránya összehasonlítható volt (2a. ábra, bal oldali panel). Ez a megfigyelés arra utal, hogy a bazális autofágia szinte kimutathatatlan volt az egészséges fibroblasztokban (2a. ábra, bal panel).
Amikor ezeket a sejteket éheztető táptalajban és CQ hiányában 2 órán keresztül növesztettük, az LC3B-II/GAPDH arány megnőtt (60 ± 4.8%, p < 0,05) az egészséges fibroblasztokéhoz képest, amelyeket standard táptalajban tenyésztettek akár CQ hiányában, akár jelenlétében (ami, mint korábban említettük, azonos volt) (2a. ábra, bal és jobb panel). Ez a viselkedés valóban arra utal, hogy az LC3-I valóban lipidáción ment keresztül, hogy LC3B-II-t képezzen, amely az autofágia aktiválódásának korai markere24,25,26,27,28,29,30 . Ezen autofágia-aktiváció jelenlétének tesztelésére a sejteket 2 órán át CQ jelenlétében éheztető táptalajban tenyésztettük, és az LC3B-II/GAPDH arány további növekedését mutatták (94 ± 5,5%, p < 0,001) a standard táptalajban tenyésztett egészséges fibroblasztokhoz képest (2a. ábra, bal és jobb oldali panel).
Továbbá, a CQ hiányában és jelenlétében éhező táptalajon tenyésztett egészséges fibroblasztok LC3B-II/GAPDH aránya közötti különbség statisztikailag szignifikáns volt (p < 0,05, ábra. 2a, bal oldali panel)
Az LC3B-II mintázat WB-elemzéssel történő standard értelmezése szerint tehát az általános eredmény azt jelzi, hogy tápanyag hiányában az egészséges fibroblasztok stimulálják az autofágoszómák képződését, amelyek CQ jelenlétében felhalmozódnak. Ez a viselkedés összeegyeztethető a normális autofágikus fluxussal24,25,26,27,28,29,30. Érdekes módon a standard tápfolyadékban nevelt RTT fibroblasztok esetében, míg az LC3B-I egyértelműen kimutatható volt az immunrendszerben, az LC3B-II nagyon halvány volt a sejtekben mind CQ hiányában, mind jelenlétében (2a. ábra, bal oldali panel). Éheztető körülmények között és CQ hiányában az LC3B-II-nek megfelelő halvány sáv megjelenése az RTT fibroblasztokban csak a szűrő hosszú expozíciója után utalt arra, hogy az LC3B-I legalább minimális lipidálódása történt (2a. ábra, bal panel). Ezért az LC3B-II/GAPDH arány a CQ hiányában éheztető közegben nevelt RTT fibroblasztok között megnövekedett (93 ± 5,5%, p < 0,001) a CQ hiányában standard közegben nevelt RTT fibroblasztokéhoz képest (2a. ábra, jobb oldali panel).
A CQ adása éheztető közegben nevelt RTT fibroblasztokhoz azonban nem növelte tovább az LC3B-II/GAPDH arányt, amely megnövekedett (95 ± 3,5%, p < 0,001), ha összehasonlítjuk a CQ hiányában standard közegben nevelt sejtekkel, de nem növekedett szignifikánsan a CQ hiányában éheztető közegben nevelt RTT fibroblasztok LC3B-II/GAPDH arányához képest (2a. ábra, bal panel). Ez a megállapítás arra utalt, hogy az RTT sejtekben nem történik autofágoszómák felhalmozódása, és a WB-analízis alátámasztotta az autofágikus fluxus valamilyen szintű blokkolását24,25,26,27,28,29,30,31.
Az esetleges hibás autofágikus fluxusra vonatkozó hipotézisünk további megerősítésére két elismert autofágikus riporter szubsztrát lebomlását ellenőriztük egészséges és CQ hiányában 2 és 4 órán át éheztetett RTT fibroblasztokban, nevezetesen: (i) a p62/SQSMT1 fehérje, amely segíti a poliubikvitinált fehérjeaggregátumok eltávolítását, és maga is lebomlik a lizoszomális hidrolázok által36; (ii) a 20 S proteaszóma, amely gyorsan lebomlik éheztető körülmények között37,38 . A két fehérje alapszintjéhez (azaz a 0. időponthoz képest) a p62/tubulin arány (44 ± 10% 4 óra után, p < 0,001) és a PSMA-3/GAPDH arány (azaz a 20 S proteaszóma α7 alegysége) (45 ± 3,1% 2 óra után, 11 ± 5,2% 4 óra után, mindkét esetben p < 0,001) időbeli csökkenése volt megfigyelhető egészséges fibroblasztokban (2b. ábra, felső panel).
Az RTT fibroblasztok esetében a p62/tubulin arány időbeli csökkenése még 4 h után sem volt statisztikailag szignifikáns (89 ± 9%), míg a PSMA3/GAPDH arány csökkenése 2 h (81 ± 4,4%, p < 0,05) és 4 h (78 ± 5,1%, p < 0,05) után szignifikánsan különbözött a fehérje alapszintjéhez (azaz a 0. időponthoz) képest (2b. ábra, alsó panel). Az egészséges és az RTT csoportok közötti különbségek azonban csak a p62/tubulin arány esetében voltak statisztikailag szignifikánsak 4 h-nál (p < 0,05), míg a PSMA3/GAPDH arány mind a 2 h-nál (p < 0.05) és 4 h alatt (p < 0,001) (2b. ábra, alsó panel).
Érdekes módon a β-tubulin és a GAPDH mintázat, amelyet a p62 festés, illetve a PSMA3 festés belső kontrolljaként használtunk, nem változott 4 h éhezés alatt az egészséges fibroblasztokban. A β-tubulin sáv, valamint a GAPDH sáv intenzitása azonban jelentősen csökkent a 4 órán át éheztetett RTT fibroblasztokban ahhoz képest, amit 0 vagy 2 órás időpontban megfigyeltünk ezeknél a sejteknél (2b. ábra, felső panel). Ez a csökkenés valószínűleg az ebben az időpontban begyűjtött élő RTT fibroblasztok alacsonyabb számának volt köszönhető (összhangban az RTT fibroblasztok 4 órás éheztetéskor tapasztalt rossz életképességével, amelyről az 1a. ábrán számoltunk be), és nem a β-tubulin idővel bekövetkező csökkenő szabályozódásának. Összességében azt találtuk, hogy az RTT fibroblasztok nem bontották le hatékonyan ezeket az autofágia riporter szubsztrátokat, ami alátámasztja a hibás autofágia hipotézisét.
A blokk jellemzőinek további megvilágítása érdekében immunfluoreszcens elemzést végeztünk az LC3B antitest használatával. Egészséges és RTT fibroblasztokat elemeztünk, amelyeket standard közegben CQ hiányában (nyugalmi állapot) és éheztető közegben 2 órán keresztül 20 µM CQ jelenlétében vagy hiányában növesztettünk (2c. ábra). A primer sejtek lassú anyagcseréjével összhangban azt találtuk, hogy a nyugalmi állapotban lévő egészséges és RTT fibroblasztok gyenge és diffúz LC3B+ festődést mutattak, a több mint 10 pöttyöt (azaz autofágoszómát) mutató sejtek alacsony százalékával (8 ± 5% és 1 ± 0,5%, illetve), ami azt jelzi, hogy immunfluoreszcenciával a bazális autofágia kevéssé volt kimutatható, összhangban az ábrán közölt adatokkal.
A standard táptalajon nevelt sejtekhez képest az éheztető táptalajon (CQ hiányában) nevelt egészséges fibroblasztok legalább 10 LC3B+ autofagoszómát mutató százalékos aránya jelentősen megnőtt (82 ± 10%, p < 0,005), míg az éheztető táptalajon nevelt RTT fibroblasztoké enyhén emelkedett (17 ± 8%, p < 0,001). Tény, hogy az éheztető táptalajon nevelt egészséges fibroblasztok legalább 10 autofagoszómát mutató aránya szignifikánsan magasabb volt, mint az azonos kísérleti körülmények között nevelt RTT fibroblasztoké (p < 0,005). Az autofagoszómák főként a perinukleáris régióba lokalizálódtak. CQ jelenlétében továbbra is megfigyelhető volt a várt diffúz és intenzív LC3B+ festődés, bár ebben az esetben a diffúz festődés nem tette lehetővé a pontok számának pontos számszerűsítését.
A CQ adagolása hatástalan volt az RTT fibroblasztokban, ami egyértelműen az autofagoszóma biogenezis súlyos károsodására utal (2c. ábra).
Az autofagoszóma biogenezis feltételezett károsodásának jelentőségére tekintettel egy további megközelítést alkalmaztunk e megfigyelés megerősítésére. Mind az egészséges, mind az RTT fibroblasztokat, amelyeket CQ hiányában 2 órán át éheztettünk, az autofagoszómák membránjára specifikus festékkel (Cyto-ID) festettük meg, és immunfluoreszcenciával elemeztük. Ebben az esetben is, míg az egészséges fibroblasztokban ténylegesen több autofágoszómát detektáltunk, az RTT fibroblasztokban csak korlátozott számú kis és izolált vezikulát figyeltünk meg (S2. kiegészítő ábra). A legalább 5 Cyto-ID pozitív pöttyöt mutató sejtek százalékos aránya közötti különbség az egészséges és az RTT fibroblasztok között kifejezetten jelentős volt (80 ± 4% vs. 8 ± 6%, p < 0,001). Ezért az átfogó elemzés bizonyítékot szolgáltatott arra, hogy az RTT primer fibroblasztokban hibás autofagoszóma biogenezis zajlik.
Az R255X MeCP2 mutációt hordozó RTT betegek érett vörösvérsejtjei megtartják a mitokondriumokat
A következőkben azt vizsgáltuk, hogy a hibás autofágia további jelei is megfigyelhetők-e ex vivo az RTT betegeknél. Mivel a mitokondriumok kiürítése klasszikus autofágián alapuló mechanizmus, amely a keringő retikulocitákban az RBC-kké érés végső szakaszában zajlik32,33,34 , vizsgálatunkat ex vivo emberi RBC-kre is kiterjesztettük annak ellenőrzésére, hogy a mitokondriumok visszamaradnak-e ezekben a sejtekben.
Ezért RTT betegek (n = 15) és egészséges donorok (n = 11) RBC-it transzmissziós elektronmikroszkópiával (TEM) elemeztük. A TEM-vizsgálat rávilágított a mitokondriumokra emlékeztető struktúrák (SRM) jelenlétére az RTT-betegek többségéből (15-ből 11) izolált, kétkúp alakú RBC-kben. E 11 RTT-beteg közül hárman mutatták a legsúlyosabb tünetegyüttest, és az RBC-k magas gyakoriságát is (20 ± 4%) (3a-h. ábra). A várakozásoknak megfelelően az SRM nem volt kimutatható az egészséges RBC-kben (3I. ábra). Az egészséges és az RTT alanyok közötti különbségek statisztikailag szignifikánsak voltak (p < 0,0004; 3. ábra, alsó panel).
TEM felvétel, amely az RTT betegek érett RBC-inek mitokondriumait mutatja. Felső panel: Transzmissziós elektronmikroszkópiás felvételek RTT (n = 3) és egészséges (n = 3) betegek RBC-iről (jobbra lent). Az R255X MCP2 mutációt hordozó betegek RTT RBC-jeiben jelentős gyakorisággal (15 alanyból összesen 3) különböző formájú mitokondriumokra hasonlító struktúrákat (SRM) figyeltek meg (a-h). Egészséges betegeknél ezeket a struktúrákat nem észlelték (i). A képeket különböző, 20 000× és 60 000× közötti nagyítással készítettük. Alsó panel: Statisztikai elemzés. A legalább egy SRM-et mutató RBC-k számát 10 különböző mezőben számoltuk meg. A különbségek statisztikailag szignifikánsak voltak p < 0,0004 (Unpaired τ Student-teszt).
Mindemellett a tünetek súlyosságát a klinikai értékelés alapján határoztuk meg, és ennek megfelelően a legsúlyosabb tünetekkel rendelkező három beteg mindegyike a MeCP2 gén R255X mutációját hordozta, ami súlyos prognózissal jár39.
Ennek következtében, és tekintettel arra, hogy nem volt lehetőségünk nagyobb számú, más mutációt hordozó, a mitokondriumtartalmú RBC-k alacsony vagy nulla gyakoriságát mutató alany bevonására, figyelmünket ennek a három betegnek az elemzésére összpontosítottuk. A TEM-elemzés az említett három esetben intakt vagy részben emésztett mitokondriumokra emlékeztető struktúrák jelenlétét dokumentálta (akár elektronsűrűségűek, akár fényesek), amelyek normál vagy súlyzó (hosszúkás) alakúak voltak, és általában kicsik, halvány cristákkal (3a-h. ábra). Valójában e struktúrák mérete és általános alakja megegyezett az érett vörösvértestekbe visszamaradt mitokondriumokéval a hibás makroautofágia (pl. Ulk1-/- egerek) vagy mitofágia (pl. Nix-/- egerek) nem-RTT egérmodellekben, amelyekről más szerzők beszámoltak32,33 . Érdekes módon az általunk megfigyelt mitokondriumok morfológiai elváltozásait, mint például a csökkent méret, a megnyúlt (azaz súlyzó alakú) szerkezet és különösen a halvány cristae-k jelenlétét már leírták az RTT betegek izomzatában és kisagyában20,21 . Az SRM mitokondriális azonosságának megerősítése érdekében egészséges donoroktól és ezektől a súlyos tüneteket mutató RTT-betegektől származó vörösvértesteket festettünk anti-COX-IV (citokróm c oxidáz) antitesttel. A három RTT-betegből származó RBC-k statisztikailag jelentős része az egészséges alanyok RBC-ivel összehasonlítva (35 ± 5% vs. 0,2 ± 0,01%, p < 0,005) COX-IV+ pontozott mintázatot mutatott, ami mitokondriumok visszamaradására utalt (4. ábra). A mitokondriumok sejtenkénti átlagos tartalma a számítások szerint 1,2 ± 0,2 organellum volt RBC-nként az RTT betegeknél és 0,002 ± 0,0002 az egészséges alanyoknál (p < 0,005) (4. ábra). A mitokondriumokat mutató RBC-k százalékos arányában a TEM és az IF vizsgálatok közötti különbségek annak tulajdoníthatók, hogy a szervsejtek kimutatásának lehetősége TEM-mel szigorúan függ a sejt vékony szelvényétől, ami akadályozhatja jelenlétüket, míg az IF megközelítés nem korlátozott ilyen módon.
A mitokondriumok azonosítása RTT betegek érett RBC sejtjeiben IF segítségével. Felső panel: Az R255X MeCP2 mutációt hordozó RTT betegekből (n = 3) (bal oldali panel) és egészséges egyénekből (n = 3) izolált RBC-k immunfluoreszcens mikroszkópos elemzése (jobb oldali panel). Az RBC-ket citospinninggel üvegekhez tapadtattuk, és anti COX-IV antitesttel szondáztuk. Az RTT RBC-k COX IV+ pöttyös mintázatot mutattak, amely az egészséges RBC-kben nem volt kimutatható. A tisztatér-felvétel kiemelte az RBC-k normális bi-konkáv alakját. A kísérletet három példányban, ugyanazon vérminta felhasználásával végeztük el. Alsó panel: a legalább 1 mitokondriumot mutató RBC-k százalékos arányát 10 különböző mezőben számoltuk ki (bal oldali panel); a mitokondriumok átlagos számát RBC-nként a különböző mezőkben az egyes RBC-k pöttyök számának megszámlálásával számoltuk ki (jobb oldali panel). Az eredmények az átlagok ± S.E.; **szignifikánsan különbözik a kontrolltól (**p < 0,005, párosítás nélküli τ Student-teszt).
Az eredmények további megerősítésére mind az egészséges személyek, mind a három RTT beteg RBC-jének citofluorimetriás elemzését elvégeztük anti-CD71 (transzferrin receptor) és anti-COX-IV antitestek alkalmazásával. A CD71-pozitivitás, az éretlen RBC-k markere, gyakorisága nem különbözött szignifikánsan az egészséges és az RTT-betegeknél (1,34 ± 0,13% vs. 1,03 ± 0,3%; S3. kiegészítő ábra). Hangsúlyozni kell, hogy a vizsgálatba bevont RTT-betegek normális hematológiai paramétereket mutattak, és bár a retikulocita-index – legalábbis néhány alany esetében – alacsonyabb volt, mint az egészségeseknél, a két betegcsoport közötti általános különbség nem volt statisztikailag szignifikáns (1. táblázat). Ezzel szemben az egészséges RBC-kben nagyon gyenge COX-IV+ populáció volt megfigyelhető, míg az RTT RBC-kben a COX-IV+ sejtek nagyobb gyakorisága volt kimutatható (0,056 ± 0,004% vs. 1,15 ± 0,19%, p < 0,01). Ezeket az eredményeket tovább erősítette a Mitotracker Green (MT) festés (S3. kiegészítő ábra), amely az MT+ RBC-k számának növekedését dokumentálta egy (R255X MeCP2 mutációt hordozó) RTT betegnél egy egészséges beteghez képest (0,37% vs. 0,16%), hasonlóan a korábban leírt COX-IV antitesttel megfigyelthez.
Az SRM azonosságának további validálása érdekében azonos számú RBC-t lizáltunk és elemeztünk WB-vel denaturáló és redukáló körülmények között. A szűrőket a szirtuin-3 elleni antitestekkel festettük meg, amely egy kifejezetten a mitokondriális mátrixban expresszálódó de-acetiláz40. A szirtuin3-at azért választottuk mitokondriális markernek ebben a megközelítésben, mert a COX-IV-től és más mitokondriális markerektől eltérően molekulatömege az elektroforetikus mintázatban nem fedésben van a hemoglobin láncok vagy a hemoglobin oligomerek molekulatömegével. A három vizsgált RTT-betegnél mindegyik betegnél a szirtuin-3/GAPDH arány statisztikailag szignifikáns növekedését figyeltük meg az egészséges vörösvértestekből származó lizátumok azonos arányához képest (p < 0. 001) (S4. kiegészítő ábra).
Ez a három beteg, akik mindegyike MeCP2-mutációt (azaz R255X) hordozott, a legrosszabb fenotípust mutatta, a legalább 1 mitokondriumot tartalmazó vörösvértestek nagyon magas százalékában. A rendelkezésünkre álló nagyon korlátozott számú beteg miatt azonban nehéz volt statisztikailag szignifikáns következtetést levonni a betegség súlyossága és az érett RBC-ken belüli mitokondriumok visszamaradásának mértéke közötti kapcsolat lehetőségére vonatkozóan. Egy másik, említésre méltónak tűnő szempont, hogy a mitokondriumok visszatartása az érett RBC-k belsejében a korábban idézett Ulk1-/- és Nix-/- egérmodellekben vérszegénységhez vagy más vérkórképekhez vezetett, amit valószínűleg ezeknek az abnormális eritrocitáknak a lép makrofágok általi fokozott kiürülése határozott meg32,33 . Az e vizsgálatba bevont RTT-betegeknél csak nagyon korlátozott és statisztikailag nem szignifikáns csökkenést regisztráltak a hematológiai értékekben, és úgy tűnt, hogy nem voltak vérszegények vagy nem szenvedtek más vérbetegségben. A mi eredményeink és az egérmodellek eredményei közötti eltérés annak tudható be, hogy a makroautofágia vagy a mitofágia génjeinek kiütése (pl. Ulk1-/-, illetve Nix-/- egerek) a mitokondriumot visszatartó RBC-k nagyon magas százalékát és számos organellum visszatartását idézi elő az RBC-ken belül, ami lényegesen súlyosabb rendellenesség az RTT-betegeknél dokumentáltakhoz képest32,33 . Annak ellenére, hogy az R255X mutációt hordozó betegeknél szignifikánsan magas mitokondriumtartalmú RBC-ket figyeltünk meg (4. ábra), az egyes sejtekben lévő organellák száma nagyon alacsony volt az RTT RBC-kben (4. ábra). Ez talán nem elegendő ahhoz, hogy jelentős morfológiai és funkcionális változásokat idézzen elő az RBC-kben. Érdemes megemlíteni, hogy bár a mitokondriumok visszatartása az RBC-ken belül legalább az egyik tényező lehet, amely meghatározza az RTT RBC-kben megfigyelt súlyos redox egyensúlyhiányt, amely az energiaállapot és az anyagcsere jelentős változásával társul (pl., ATP/ADP és NADH/NAD arány), a közelmúltban végzett vizsgálatok arról számoltak be, hogy az oxigén hemoglobinhoz való kötődésének és az oxigéndiffúziónak a kinetikája szinte teljesen megegyezik az egészséges betegekével16,17,23,41 .
A mi eredményeink és az egérmodellekből származó eredmények közötti látszólagos eltérés magyarázatot találhat abban is, hogy az RTT-szindróma X-kapcsolt rendellenesség, amely szinte kizárólag a női nemet érinti, és az X-kromoszóma két kópiája közül az egyik inaktivációja (XCI) véletlenszerű, az embriogenezis során bekövetkező jelenség, amint azt széles körben dokumentálták42,43 . Így az RTT-szindróma esetében a véletlenszerű XCI a szomatikus sejtekben várhatóan olyan mozaikosságot eredményezne, amelyben a sejtek fele a vad típusú allélt, a másik fele pedig a MeCP2 gén mutáns allélját expresszálja. Érdekes módon az a lehetőség, hogy legalább néhány MeCP2-mutáció nem véletlenszerű XCI-vel járhat együtt a neuronális szövetekben, összhangban van az RTT-betegek fenotípusos variabilitásával (és az RTT ismert eseteire is), amely jellemzőt már széles körben dokumentálták42,43 . Elméletileg, ha a csontvelőben a hematológiai progenitorok fele megtartja a MeCP2 mutációt hordozó X-kromoszómát, akkor a keringő érett RBC-knek csak a fele hordozná a kóros allélt, így korlátozva a keringő mitokondriumtartalmú RBC-k számát. Mindazonáltal sporadikus RTT betegek keringő leukocitáiban megfigyelték a nem véletlenszerű XCI fokozott előfordulását a vad típusú allél javára42,43 . Ezzel kapcsolatban nagy kihívást jelentene annak vizsgálata, hogy a mitokondriumtartó RBC-k alacsony számát mutató vagy nem mutató betegeknél a mitofágia kevésbé jelentős károsodása vagy a nem véletlenszerű XCI is megfigyelhető-e, ami a vad típusú MeCP2 allélt hordozó hematológiai progenitorok pozitív szelekciójához vezetne.
Ezért, tekintettel az RTT patológia komplexitására, inkább azt állítjuk, hogy az RTT betegek, a Pearson-szindrómában érintett betegekkel együtt, a mitokondriumok visszatartásának első eseteit képviselhetik az emberi érett RBC-kben44.
Hibás autofágia bizonyítása a Mecp2-null egerek kisagyában
Mivel az RTT egy idegrendszeri fejlődési rendellenesség, a szisztémás hibás autofágiára utaló eredményeink további alátámasztására immunhisztokémiai elemzéseket végeztünk a p62 és az ubikvitin kimutatására a kisagyban (ill.azaz egy olyan szervet, amelyben mitokondriumok elváltozásait és más jelentős szövettani rendellenességeket figyeltek meg)21,45 9 hetes vad típusú egerek, valamint 5 hetes (tünetmentes) és 9 hetes (tünetes) Mecp2 -/y egerek esetében. Minden egyes kísérleti feltételhez három állatból izolált szervet elemeztek. A wt-hez képest az RTT kisagy a p62 (5a. ábra) és az Ub (5b. ábra) festődés intenzitásának növekedését mutatta minden rétegben (azaz a szemcsék, a Purkinje- és a kérgi rétegekben), ami lineáris volt az állatok életkorával. Ráadásul a hiperfestett struktúrák intracelluláris aggregátumokra hasonlítottak. A p62/SQSTM1 és Ub festődés intenzitásának szemikvantitatív értékelése szerint az 5 hetes állatok kisagya és az egészséges állatok, valamint a 9 hetes állatok és az 5 hetes állatok kisagya közötti különbségek statisztikailag szignifikánsak voltak (p < 0.05).
Az autofágia riporter szubsztrátjainak felhalmozódása az RTT egérmodellek kisagyában. Immunhisztokémiai analízis 9 hetes vad típusú egerek és 5 (tünetmentes) és 9 hetes (tünetmentes) RTT egerek MeCP2 kiütött kisagyának immunhisztokémiai elemzése (n = 3 minden kísérleti csoportban). A három kísérleti feltétel esetében a különböző állatokból izolált szerveket vizsgáltuk. Az egyes szervekből származó szeleteket (n = 4) anti-p62/SQSTM1 (a) és anti-Ub antitesttel (b) vizsgáltuk. Mind a p62/SQSTM1, mind az Ub festődésének életkor szerinti lineáris növekedését figyeltük meg az RTT egerek kisagyának minden rétegében a vad típusú állatok kisagyához képest. (c) A p62/SQSTM1 és Ub immunreaktivitás szemikvantitatív értékelését mutató oszlopdiagram, önkényes egységben kifejezve. Az eredményeket átlagszám ± S.E. értékben fejeztük ki, ±95%-os megfigyelők közötti reprodukálhatósággal. Az 5 hetes egerek kisagyának festődését a vad típusú egerekével, a 9 hetes egerek festődését pedig az 5 hetes egerekével hasonlítottuk össze. A különbségeket Student’s τ teszttel értékeltük, és ≤ 0,05 p értéknél szignifikánsnak tekintettük.
A tünetmentes és tüneteket mutató állatok közötti szövettani különbség arra utal, hogy az autofágia elváltozás születéskor hiányozhat vagy gyenge lehet, míg az élet első heteiben (és valószínűleg a MeCP2 aktivitás csúcspontjának elérésekor) fokozatosan erősödik, ami a tünetek kialakulásához vezet.