8.3 Kémiai vizsgálatok
A PHG-komponensek TLC lemezeken való láthatóvá tétele lehetséges a fenolokra vonatkozó általános reagensek használatával; vas-klorid, vanillin és sósav (rózsaszínű színtartományt adnak a resorcinol vagy a floroglucinol származékokkal), vagy specifikusabb tesztekkel a 2,4-dinitrofenilhidrazin (kimutatja az aldehideket). A Folin-Ciocalteu reagens szintén hasznos a katechol- vagy hyrokinonmaggal rendelkező fenolok kimutatására (kék foltok jelennek meg közvetlenül a TLC-lemez permetezése után) vagy más fenolok esetében, amelyek kék vagy szürke foltokat mutatnak, ha a lemezt ammóniagőzzel füstöljük. A Gibbs-reagens (2% 2,6-diklórkinon-kloroimid kloroformban), majd a lemez 2M NH4OH-val történő füstölése különböző színeket ad (pl. képes megkülönböztetni a vanillinsav-rózsaszín színt és az izovanillinsav-kéket). A fahéjsav-származékok jellegzetes világoskék fluoreszcenciát adnak, ha UV-fényben (366 nm) vizsgáljuk őket. A fahéjsavak cisz- és transz-izomerjei TLC-lemezeken mutatkoznak, amikor a kivonatot vizes oldószerekben két irányban kromatografálják (2D-TLC). A fenoltartalom becslésére gyakran alkalmaznak spektrofotometriás módszereket, pl. az Arnow-reagenssel vagy a korábban említett Folin-Ciocalteu-reagenssel végzett módszert .
A növényi kivonatokban lévő kumarinokat egyes minőségi vizsgálatok jelzik, pl., Laktongyűrű-teszt (a híg lúggal hidrolizált kumarinok O-kumársav-sók sárga oldatát képezik, amely savasítás vagy CO2-vel való telítés után visszafordítható); vagy azo-kapcsolási teszt (vörös szín alakul ki a lúgos oldatban diazotizáló szulfanilsavval való reakció következtében). A kumarinok UV-fényben (365 nm) könnyen kimutathatók, mivel jellegzetes színű fluoreszcenciát adnak (kivéve az egyszerű, szubsztituálatlan kumarint, amelynek nincs fluoreszcenciája). Kék, ibolya, barna, zöld vagy sárga színük alapján mutathatók ki. KOH 10%-os oldata metanolban vagy antimon-klorid 20%-os oldata kloroformban fokozhatja a színt. A hidroxikumarinok lúgos oldatban nem mutatnak bathokróm spektrális eltolódást . A diódasoros detektálással végzett HPLC analízis során a kumarinok különböző UV spektrumai lehetővé teszik a vegyületek gyors azonosítását .
A kromonok lúgos oldatokban reagálva O-hidroxi-β-diketonokat adnak a γ-piron gyűrű regenerálása nélkül, valamint koncentrált savval és koncentrált lúggal színezett vegyületeket . A kromonok UV-fényben is láthatóak (kék, sárga, zöldessárga, barna fluoreszcencia 365 nm-en).
A flavonoidokban az aktív fenilgyűrű (kromofór) jelenléte miatt UV-fényben könnyen kimutathatók. UV-spektrumaik különösen informatívak, mivel olyan szerkezeti információkat szolgáltatnak, amelyek alapján megkülönböztethető a fenol típusa és az oxidációs mintázat. A TLC kromatogramok permetezésével különböző kémiai reakciók lehetségesek; pl. vizualizáció ammóniagőz jelenlétében (a kalkonok és az auronok narancssárgává, illetve vörössé válnak) vagy Naturstoff Reagenz A-val (2-aminoetanol és difenilbórsav észterének 1%-os oldata) történő permetezés és 5%-os metanolos polietilénglikol 4000 (PEG 4000) oldattal történő felülpermetezés, ami növeli a reakció érzékenységét. A származékosítás után a vegyületek UV-fényben megfigyelhetők voltak (világossárgától zöldig terjedő fluoreszcencia). Egyéb vizsgálatok közé tartozik a vas-kloriddal, diazotált szulfanilsavval történő permetezés (mindkettő a fenolok reakciója), és a specifikus reakció; cianidin magnéziumporral sósav jelenlétében (jelzi a flavanonok és dihidroflavanolok jelenlétét) . A flavonoidok mennyiségi kolorimetriás becslésére alumínium-kloriddal (AlCl3) történő reakciót használnak (az abszorbancia 425 nm-en mérhető). A lúgos oldatban oldott flavonoidok intenzív sárga színt adnak, amely a sav hozzáadása után csökken. A flavonoid vegyületek UV-spektrumában két fő sáv (abszorbancia-maximum) látható: az I. sáv magasabb hullámhosszon (a flavonoid szerkezet cinnamoil részének tulajdonítható) és a II. sáv alacsonyabb hullámhosszon (a benzoil résznek köszönhető). Az I. sáv általában 304-350 nm-en van a flavonok esetében (H a C-gyűrű C-3-jánál), 352-385 nm-en a flavonolok esetében (OH-csoport a C-3-nál), és 328-357 nm-en a 3-szubsztituált flavonolok esetében (O-szubsztitúció a C-3-nál). A II. sáv a legtöbb szerkezet esetében kb. 250-280 nm-nél van. Az A gyűrűben lévő további fenolcsoport (-OH) a II. sávban bathokróm eltolódást (hosszabb hullámhosszra való eltolódást) okoz, és a B gyűrűben lévő további -OH csoport hasonló hatást vált ki az I. sávban .
A legtöbb antrakinon vagy glikozidjuk sárga vagy narancsvörös kristályokat alkot, és a pH-tól függő fluoreszcenciát mutathatnak . A fő színreakció a Bornträger-teszt, amely a kinon lúgos vizes közegben történő feloldásával történik. A színreakció a narancsvöröstől a bíborvörösig terjed (a kinon szerkezetétől és szubsztituenseitől függően). Az antrakinonok ezzel a reakcióval vörös színt adnak. Az 1,8-dihidrokinonok esetében magnézium-acetáttal történő reakciót is alkalmaznak. Az antrakinonok 10%-os metanolos KOH-oldattal történő permetezés után kimutathatók a TLC-lemezeken. Az eredeti sárga vagy sárgásbarna szín vörösre, lilára, zöldre vagy lilára változik . A porított rebarbara UV-fényben vizsgálható a raponthicin (stilbenoid glikozid, amely mérgező) jelenlétének kimutatására. Az eredeti rebarbarában (Rheum palmatum) vörösesbarna fluoreszcencia jelenik meg, de nem látszanak fénylő kékes-ibolya foltok (mint a rhaponti rebarbara-Rheum rhaponticum okán).
Amint korábban említettük, a szaponinok felületaktív vegyületek (módosítják a felületi feszültséget) és emulgeáló tulajdonságokkal rendelkeznek. Annak gyors minőségi ellenőrzésére, hogy egy növény tartalmaz-e SPG-ket, általában a növényi anyag vízzel történő felrázásával végzett habzási tesztet használják. A szaponinok membránpermeabilizáló tulajdonságokkal rendelkeznek. A szaponinok alacsony koncentrációban képesek tönkretenni a vörösvértestek membránjait (amelyek kicsaphatják a vörösvértestek membránjában lévő koleszterint), ami in vitro a vér hemolízisét okozza. Ez a képesség vezetett a hemolízis (hemolitikus index-IH) széles körű használatához, mint a biológiai aktivitás meghatározásának módszeréhez. Az IH-t úgy határozzák meg, mint a szarvasmarhavér 2%-os izotóniás szuszpenziójának mennyisége (ml-ben), amely 1 g vizsgált növényi anyaggal (vagy vizsgált kivonattal) kezelve hemolízisnek megy keresztül. Referenciaként Gypsophila paniculata szaponin keveréket (IH=30 000) vagy Saponin Album (Merck) (IH=15 000) használtunk. Hostettmann és Marston leírása szerint a szaponozidok hemolitikus aktivitása jelentősen változik a glikozid rész szerkezetétől függően. A monodesmosid szaponinok (kivéve az acilglikozidokat és a glicirrizint) erősen hemolitikusak. Nincs olyan színreakció, amely különösen specifikus lenne az SPG-kre. Rendelkezésre áll azonban a Lieberman-reakció (ecetsav-anhidriddel kénsav jelenlétében), ahol a színek az aglikon típusától függően különböznek (triterpén-rózsaszíntől vörösig -vagy szteroid-kék-zöld) .
A növényi anyagban lévő CRG-k azonosítására szolgáló kémiai reakciók az aglikonok vagy a cukrok miatt történhetnek. A Liebermann- és Salkoviski-teszt a szteroid-részeket jelzi, ezért nem specifikus a CRG-kre. Keller Kiliani és a Xanthidrole tesztek, mindkettő dezoxi-cukrokat (digitoxóz vagy cimaróz) jelez. A Kedde- vagy Baljet-reakció specifikusabb, mivel az α,β-telítetlen laktongyűrű jelenlétéhez kapcsolódik. A CRG-k fluoreszcens reakciója is lehetséges, pl. a digoxin C-14 és C-16 hidroxilcsoportja a vizet H2SO4 segítségével két további kettős kötés kialakulásával eliminálja. Ez egy konjugált rendszert eredményez (egy kettős kötéssel a laktongyűrűben), amely a digoxint UV-fényben fluoreszkálóvá teszi. A Jensen-reakciót (triklórecetsavval etanolban történő permetezés után) a CRG-k láthatóvá tételére használják a TLC-kromatogramokon .
A teljes HCN közvetlen mérése az élelmiszerekben jelen lévő cianogén glikozidok savas hidrolízisével, valamint a köztes cianohidrinek HCN-re történő bomlásával azzal az előnnyel jár, hogy minden típusú mintára alkalmazható, bár valószínűleg in vivo nem áll rendelkezésre a cianogén glikozidok összes potenciális HCN-je. E vegyületek növényekben való jelenlétének láthatóvá tétele olyan reagensekkel, mint pikrinsav/nátrium-karbonát vagy benzidin/kuprinsav-acetát impregnált szűrőpapíron lehetséges. Ezek a reagensek képesek színreakciókat adni a zúzott növényi szövetből felszabaduló HCN-nel. Az impregnált papírt egy csőben a zúzott növényi anyag fölé helyezzük, és 40 °C-on 2 órán át hagyjuk inkubálni. A sárgáról vörösesbarnára történő színváltozás a HCN enzimatikus felszabadulását jelzi. A pikrátpapír nem teljesen specifikus a cianogénre (a Brassica fajokból származó illékony izotiocianátok is reagálnak erre a reakcióra). Ezért egy másik tesztet is alkalmaznak, amelyhez a 4,4-tetrametil-diamin-difenilamin 1%-os kloroformban (w/v) és 1%-os réz-etilacetoacetát kloroformban (w/v) frissen készített oldatainak (1:1) keverékét használják. A színreakció halvány kékeszöldről élénkzöldre változik. Egy másik lehetséges módszer a növényi szövet savas vízben történő desztillációját és a felszabaduló HCN ezüst-nitráttal történő titrálását igényli. Az egyes cianogén glikozidok vagy cianohidrinek elemzésére hatékonyak az olyan kromatográfiás módszerek, mint a trimetilszililil-származékok HPLC/MS vagy GC/MS, és biztosítják a vegyületek kémiai jellemzését, valamint mennyiségi meghatározását .
A glükozinolátokból a növényekben képződő termékek sokfélesége miatt (az aglikon szerkezetétől függően) az izotiocianátok spektrofotometriás módszerrel történő becslése (ahol az 1,2-benzol-ditiollal történő izotiocianát-kondenzáció során 1,3-benzodithiol-2-tionok színtermékek képződnek) elégtelen lehet a növények glükozinolát-tartalmának meghatározására .
.